방법 논문

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

DOI:

10.3791/52935

⸱

2015년 10월 21일

 ,  ,  , 
1Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서 영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

초록

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척추 동물의 두개 안면 구조의 개발은 세포 이동, 확산, 접착 및 분화의 정확한 조정이 필요합니다. 멕켈의 연골, 제 인두 아치 유도체의 패터닝은 두개골 신경 크레스트 (CNC) 세포의 이동과 진보적 인 분할, 증식 및 분화 된 연골 세포의 조직을 포함한다. 몇몇 연구는 아래턱 형태 발생 동안 CNC 마이그레이션을 설명했지만,이 연골 세포의 연골 멕켈의 성장 및 확대에 조직을 실현하는 방법의 상세는 불분명. sox10은 제한 및 화학적으로 유도 Cre 호텔 재조합 효소 - 중재 재조합하여 별개의 클론 인구를 반영 전구 세포 및 그들의 자손의 멀티 스펙트럼 라벨을 만드는, 독특한 형광 단백질 (RFP, YFP와 CFP)의 순열을 생성합니다. 공 촛점 시간 경과 사진을 사용하면, 연골 세포를 관찰 할 수있다 behavi또는 제브라 피쉬 멕켈의 연골의 개발 과정.

멀티 스펙트럼 셀 라벨은 멕켈의 연골 세포의 확장을 보여 과학자 수 있습니다. 하악을 prefigures 멕켈의 연골의 확장 단계에서 연골 세포들은 조직 단일 셀 계층 행에 스택으로 확장에 영향을하는 층간 삽입. 세포 확장을 중재하기 위해이 조직 인터 프로세스의 실패는 우리가 하악 기형에서 관찰 형성 부전 하악의 세포 기계적인 설명을 제공합니다.

서론

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두개 안면 개발은 세포 증식, 이동 및 분화, 2, 3를 구동하는 복잡한 분자, 세포 및 조직의 상호 작용을 필요로한다. 이 엄격하게 규제하고 복잡한 과정은 두개 안면 기형이 가장 흔한 선천성 기형 1-9의 사이 있도록 유전과 환경 교란에 될 수 있습니다. 수술 개입이 개발 기초를 이해, 두개 안면 기형 치료의 의지가 남아 있지만 미래의 치료를 혁신하는 것이 필수적이다. 따라서, 통합 및 확장과 세포 통합의 형태 형성과 메커니즘을 연구하는 것은 두개 안면 골격 (1)의 형성에 새로운 통찰력을 제공합니다.

두개골 신경 크레스트 마이그레이션 및 첫 번째 인두 아치 하악을 prefigures 멕켈의 연골을 형성 확장, 다음 짝을 형성 하악 프로세스를 채 웁니다. 형태 형성 오멕켈의 연골 f를 방향 증식, 세포 편광과 차별화 1,10 통해 연골 세포 조직을 필요로한다. 그러나, 멕켈의 연골의 성장과 확장에 연골 세포 조직의 복잡함은 확실하지 않다. 동적 세포의 행동을 이해하는 것은 이러한 형성 부전 하악 표현형 (11) 하악의 크기에 영향을 미치는 선천성 기형을 이해하는 것이 중요합니다.

Zebrafish의 배아는 멕켈의 연골 형태 형성의 자세한 연구를위한 많은 발달과 유전 적 장점을 제공한다. 유전 취급 용이성, 투명성, 생체 및 급속한 발전은 라이브 영상 6 세포의 이동과 조직의 관찰 잘 빌려주는 강력한 장점이다. 같은 sox10 같은 혈통-추적 도구 사용 : 카에데 형질 전환 라인을, 우리와 다른 배아 두개 안면 골격 1.5의 신경 크레스트 기원을 묘사했다. USIUBI와 ERT2-Cre 호텔 : sox10을 겨 Zebrabow-M 유전자 변형 라인은 두개 안면 개발 과정에서 세포 운동의 세부 사항을 탐험 할 수있게되었습니다. Zebrabow-M은, 서로 다른 형광 물질의 발현을 구동 유비퀴틴 프로모터의 LOX 사이트 (8)에 의해 각각 측면으로 설계된 트랜스 제닉 라인이다. Zebrabow-M의 기본 형광이 RFP를 표현, 빨간색입니다. Cre 호텔의 발현 유도 후, Zebrabow-M은 재결합을 구성하고 세포는 배아에서 멀티 스펙트럼 표현을 생성하는 다른 형광체 (RFP, CFP와 YFP)의 조합을 표현한다. 다른 병치 된 전구 세포에서 유래하는 세포 집단이 클론 적 표시되도록 재조합 이벤트 이후의 표지 세포 분열 모든 딸 세포를 클론 적, 표시되어 있습니다. 이 복제 셀 라벨에 의해, 클론 해상도와 세포 증식 및 마이그레이션 (그림 1, 2) 다음에 할 수 있습니다.

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프로토콜

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매사 추세 츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜 번호 # 2010N000106에서 모든 절차를 승인했다. 이 평가 및 실험 동물 관리 국제 (AAALAC) 가이드 라인의 인증 협회을 준수합니다.

1. 시약 및 재료 준비

  1. E3 배아 50X 배지 1 L을 제조 (표 2 참조) (표 1 참조)과 1X E3 배아 배지 1 L를 준비한다.
  2. 1X E3의 1 L에 PTU 30mg을 첨가하여 N-페닐 티오 (PTU)와 E3 배아 매체를 준비한다. 저어 O / N은 ​​PTU가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 실온에서 보관하십시오.
  3. , 프로 나아 제 용액을 제조 1X E3 15 ml의 프로 나제​​ (0.5 ㎎ / ㎖) 150 ㎕의 희석. 이 금액은 1 페트리 접시에 충분하다. 즉시 사용합니다.
  4. 메틸 셀룰로오스 솔루션을 준비합니다.
    1. 25 ml의 0.2 % tricaine 75 ml를 혼합하여 E3-tricaine 솔루션을 준비1X E3의. E3-tricaine 용액의 75 mL에 메틸 셀룰로오스의 3g을 끓인다.
    2. E3-tricaine 솔루션 100ml로 최종 볼륨을 확인합니다. 최종 메틸 셀룰로오스 용액은 황색 색조와 점성과 불투명하다. 저장 : RT 빛으로부터 보호.
  5. 타목시펜 재고 및 유도 솔루션
    1. 4- hydroxytamoxifen 100 % 에탄올에 용해시켜 5 mM의에게 타목시펜 스톡 용액을 제조 하였다. -80 ° C에서 보관 재고.
    2. 유도 용액을 얻었다 1X E3에서 소망 농도 타목시펜의 신선한 희석을 준비한다. 주의! 사용하기 전에 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 참조하십시오.
  6. 표 3에 따라 0.2 % tricaine의 1 리터를 준비합니다.
  7. 공 초점 슬라이드를 얻습니다. 블록을 형성하기 위해 함께 네 개의 커브 글라스 (18 X 18) 접착제 다음 중간에 배아 장착 할 수 있도록 2cm 간격 24 X 60 커브 글라스에 2 블록을 배치합니다.

2. 배아 준비

  1. 형질 전환 라인.
    참고 : Zebrabow-M은 알렉스 Schier의 실험실에서 관대 한 선물이었다.
  2. sox10 : ERT2-Cre 호텔
    참고 : 표준 분자 클로닝 방법을 사용하여 ERT2-Cre 호텔과 상용 기술을 복제 재결합을 얻을 : 대상 벡터 pDestTol2- sox10를 생성합니다.
    1. 렌즈 목적지와 LR 반응에 진입 클론 (pENTR3' - 폴리 -A) 겸용 5 'sox10 프로모터의 7.2Kb, 게이트웨이 중간 클론 (PME-ERT2-Cre 호텔)와 (3)을 포함하는 항목 클론 (pENTR5'- sox10p)' 벡터 pDestTol2-의 α-crystallin을 : YFP.
    2. 구조를 정화 pDestTol2- sox10 : ERT2-Cre 호텔을. 하나의 셀 단계에서 WT 배아 (F0)에 TOL2의 트랜스 mRNA의 (50 NG / μL)와 정제 된 구조 (100 NG / μL)를 공동 주입.
    3. 세균 온라인 전송을위한 화면 F0 성인 설립자 F1 배아 강한 노란색 형광을 기반으로.
  3. sox10 : ERT2-Cre 호텔, Zebrabow-M
    1. Zebrabow-M을 교배ERT2-Cre 호텔 형질 전환 라인 : sox10와 라인 (2.1.1).
    2. 강한 유비쿼터스 RFP 발현과 YFP 렌즈 마커와 성인까지 그들을 성장을 보이는 선택 배아.

3. 배아 컬렉션

  1. sox10의 여러 쌍을 설정 : ERT2-Cre 호텔을, Zebrabow-M 형질 전환 제브라 피쉬를 오후 5시와 1 일 오후 6시 사이.
  2. 다음 날, 아침에 디바이더를 당겨 정오 경 계란을 수집합니다.
  3. 요리를 페트리와 배아를 d​​echorionate하는 프로 나제​​ 용액 15ml를 추가로 전송.
  4. 배아의 약 60 %가 dechorionated 때까지 1 분 5의 배아를 품어. 프로 나제​​ 솔루션을 경사하여 반응을 중지하고 신선한 E3 매체와 태아에게 3 ~ 4 회 반복한다.
  5. RT O / N에서 E3에서 dechorionated 배아를 품어하고는 10 somites 단계에 도달하기 위해 개발 할 수 있습니다. 다른 발달 성장을 방지하기 위해 클러치 당 50 ~ 60 배아를 품어.

4. 치료

  1. 그들은 10 somites의 단계에 보장하기 위해 빛 필드 현미경으로 배아 '발달 단계를 확인합니다.
  2. 적색 형광 단백질 (RFP) 필터와 형광 현미경을 사용하여 밝은 빨간색 배아를 분리.
  3. 페트리 접시에 hydroxytamoxifen 용액 10 μm의를 추가하고 3 시간 동안 28.5 ° C에서 분리 된 배아를 배양하여 Cre 호텔 - 재결합의 유도로 넘어갑니다.
  4. 타목시펜 솔루션을 가만히 따르다 및 E3와 배아를 여러 번 씻는다.
    주의! 특별한 생물학적 폐기물 용기에 타목시펜 솔루션을 폐기합니다.
  5. 28.5 ° CO / N에서 배아를 품어.
  6. 배아는 약 28 ~ 29 somites 단계 (24 시간 약 게시물 수정) 때, E3-PTU 솔루션 이하에서 28.5 ° C에서 배아를 배양한다.
    참고 : PTU가 여기에 개발 배아에 melanophores의 형성을 억제하는 데 사용됩니다. 이 치료는 할 필요가자동 형광 melanophores 의한 형광의 신호 왜곡을 피하기.
  7. 28.5 ° C에서 배아를 품어

5. 배아 선택

  1. 완전히 개발 된 두개 안면 구조를 시각화하기 위해, 레드 신호와 Cre 호텔 표현 마커 양성 (망막 노란색)의 강도 4 일 후 수정의 배아를 선택합니다.
  2. E3 / 0.015 %의 tricaine 솔루션 배아를 마취. 부드럽게 배아를 괴롭히는 경우 활성 운동 또는 지느러미 활동이 관찰되지 않을 때 마취가 확인된다.

6. 프로필 메틸 셀룰로오스에서 배아를 장착

  1. 메틸 방울을 함유하는 페트리 접시에 이미징 선택된 배아를 전송하고 부드럽게 메틸 셀룰로스와 배아 방부.
  2. 깨끗한 공 초점 슬라이드에서 신선한 메틸 한 방울을 배치하고 microloader 팁을 사용하여 드롭 내에서 배아를 탑재합니다. 위치 배아는 등쪽으로 만지지 않도록주의를 복용직접 배아.
  3. 25 × 25 커버 슬립으로 장착 배아를 커버하고, 필요한 경우 커버 슬립을 조작함으로써 태아의 위치를​​ 조정한다.
  4. 배아는 이제 이미지에 대한 준비가되어 있습니다.

형광 현미경으로 7. 분석

  1. 배아를 초점을 맞추기 위해, 20 배 건조 렌즈 목표 (핀홀 크기 2.0 μm의 개구 수 0.75)를 사용합니다.
  2. 현미경에 L100 버튼을 눌러 소프트웨어의 채널을 선택합니다.
  3. 공 초점 설정 버튼을 선택하고 '자동'을 클릭하고 창을 닫기 전에 다음과 같은 채널을 선택 : 채널 1 : CFP, 채널 2 : GFP, CH3 : RFP 또는 mCherry을
  4. '연동을 제거'버튼을 클릭하기 전에 채널 2와 CH3의 전원을 켭니다. 스캔을 시작하는 '놀이'를 클릭하십시오.
  5. 원하는 화질 AC 때까지 가장 ½ 프레임 / 초 고전압 (HV) (150)로 시작하고 따라서 설정을 조정함으로써 행해진 다 관심 구조에 초점hieved. RFP 따라서 HV를 조정, 다른 색상보다 밝은 것입니다. YFP 및 RFP 양성 세포를 모두 찾을 수있는 Z 위치를 변경합니다.
  6. 설정으로 설정하면, 당신의 배의 이미지를 캡처합니다. 각 분할 채널에서 이미지 처리를 위해 공 촛점 이미징 소프트웨어 형식 및 TIFF 형식으로 사진을 저장합니다.
  7. 다음으로, CFP 이미징, 채널 2와 CH3를 끄고 채널 1의 전원을 켭니다. 초점 영역을 변경하지 않고, 단계 5와 설정을 다시 조정한다.
    참고 : CFP 인해 핀홀 크기를 조정하여 회피 할 수있다 파랑 채널에서 배경 신호를 감지하기 정말 어려울 수 있습니다. 큰 핀홀 크기는 신호 / 배경 잡음 비를 감소시켜보다 효율적으로 형광을 검출 할 수있게한다. 그러나, 큰 핀홀 이미지 품질 저하, 공 초점 효과를 감소시킬 것이다. 따라서, 설정 조절은 조심 원하는 이미지의 품질 및 강도를 달성하기 위해 요구된다.
  8. 이미지를 캡처 (모두 형식으로 공 초점 소프트웨어와 T를 저장이미지 처리를위한 IFF). 이미지는 다음 레이어를 병합하고 8 팬과 동료들에 의해 설명 된 바와 같이 색 설정을 개선하기 위해 공통의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다.

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결과

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전체 마운트 알 시안 블루 얼룩에 의해 전통적인 연골 시각화 개발 멕켈의 연골을 관찰하고 일반적으로 최종 세포 조직 (12) (그림 1A)를 시각화하는 데 사용에 귀중한하고있다. 더 혈통은 sox10를 사용하여 추적, 초과 근무 개발 연골 세포를 분석하기 : 카에데 유전자 변형 라인 라이브 배아 2,12 (그림 1B)에 세포 이동, 통합 및 확장을 연구 수있게되었습니다. 그러나, 두개 안면 골격 구조에서 연골 세포의 조직은 제대로 이해 남아 있습니다. 라이브 영상으로 Zebrabow-M 트랜스 제닉 라인 멕켈의 연골 (도 1C-G)의 확장과 성장을 매개 연골을 흡장 및 연신 공정을 공개 할 수있다.

ERT2-Cre 호텔 배아 10 somites하고 콘드에서 타목시펜으로 치료 하였다 :; sox10이 ...

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토론

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위에서 서로를 보완 설명으로 알 시안 블루와 photoconvertible 형질 전환 라인은 연골과 뼈 개발의 복잡한 프로세스를 정의 할 수 있습니다. 그러나, 기관 형성기 동안 라이브 세포의 이동과 조직은 오랫동안 가정 간접적으로 증명하지만 시각 적이있다. 연골 특정 Cre 호텔과 함께 Zebrabow-M 형질 전환 라인은 뼈와 연골 형성에 관여하는 모든 별개의 이벤트를 동시에 실시간 관찰을 허용합니다. 이 기술은 micrognathia 설명 눈에 띄는 기능 중 하나입니다 로빈 순서와 같은 조건에서 세포와 기관 수준에서 아래턱 성장 결함의 연구를 할 수 있습니다. 증식, 확장 또는 인터에 실패 효율적으로 시간이 지남에 따라 성장 연골 세포에 가시화 될 수있다.

색상 다양성 최적화

exten을 제어 할 수있는 4 hydroxytamoxifen의 농도를 적정하여 Cre 호텔 레벨 최적화배아 치사 초래없이 재조합 및 색상의 다양...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 친절 물고기 설비 및 라인의 우수한 케어 Zebrabow-M 유전자 변형 라인, pDEST 벡터에 대한 제프리 번스와 르네 이티 - Daigle 공유를위한 알렉스 Schier 감사합니다.

자금 조달 :

우리는 어린이를위한 이너스 병원에서 어린이 (ECL) 및 박사후 연수 장학금에 대한 NIDCR RO3DE024490와 슈라 이너스 병원에서 관대 한 자금 지원 (LR 및 YK)에 대해 감사하고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PronaseRoche Life Sciences10165921001500 &mu를 준비합니다. l 50 mg/ml의 스톡 분취액
셀룰로오스Sigma-AldrichM0262
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7619
TricaineSigma-AldrichE10521
4-HydoxyTamoxifenSigma-AldrichT176
24 x 60 coverslipsFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 커버슬립Fisher Scientific12-540A
25 x 25 커버슬립Fisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA 클로닝 키트생명 기술 K591-20
pENTR/D-TOPO 클로닝 키트 Life TechnologiesK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTGeoffrey Burns 실험실에서 선물한
Brightfield microscope 
형광 현미경 
컨포칼 현미경
이미지 처리 소프트웨어
메틸

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Zebrabow Clonal AnalysisChondrocyte IntercalationMeckel s CartilageConfocal Time LapseSOX10 ERT2 CreTamoxifen InductionCranial Neural CrestMultispectral LabelingClonal Cell AnalysisZebrafish Embryos

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