Method Article

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

DOI:

10.3791/52975

⸱

August 4th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

Abstract

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멤브레인 수용체 - 리간드 상호 작용은 다수의 세포 기능을 매개한다. 바인딩 역학 이러한 분자의 상호 작용에 의해 트리거 다운 스트림 신호는 가능성이 기계적인 환경에서 결합 및 신호 포획 장소에 의해 영향을받습니다. 최근 연구는 기계적인 힘에 의한 항원 인식을 조절하고 T 세포 수용체 (TCR)의 트리거링 할 것을 보여 주었다. 이 형광 현미경으로 단일 분자 힘 분광법을 결합한 새로운 우리가 개발 한 기술이라고 형광 생체막의 힘 프로브 (fBFP)에 의해 가능하게되었다. 민감한 힘 센서로서 고속 카메라와 실시간 영상 추적 기술을 매우 부드러운 인간 적혈구를 사용 fBFP 1 ~ PN (10-12 N) ~ 3nm 이상이며 ~ 0.5 밀리의 힘, 공간과 시간 해상도. fBFP으로, 하나는 정확하게 힘 조절에 따라 단일 수용체 - 리간드 결합 동력학과 동시​​에 이미지가 트리거 바인딩 세포 내 칼을 측정 할 수 있습니다cium 하나의 살아있는 세포에 신호. 이 새로운 기술은 기계적인 규제에서 다른 세포에서 다른 막 수용체 - 리간드 상호 작용과 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

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세포 간 및 세포 - 대 - 세포 외 기질 (ECM)의 밀착성이 세포 표면 수용체, ECM 단백질, 및 / 또는 지질 1 간의 결합에 의해 매개된다. 바인딩은 세포의 기능을 형성 한 구조뿐만 아니라, 인식, 통신, 및 환경 1-3에 반응 할 수있다. 수용성 단백질 (예 : 사이토킨 및 성장 인자), 3 차원 (3D)에서 결합하는 세포 표면 수용체 상 유체 상 달리 세포 부착 수용체 분자 구속 두 대향면을 연결하는 좁은 접합부 갭에 걸쳐 그들의 리간드 결합을 형성 두 차원 (2D) 인터페이스 4-7에 확산. 일반적으로 기존의 결합 분석 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 또는 SPR)에 의해 측정되는 3D 동역학 달리, 챔버 (11, 12)을 흘러, 예컨대 원 자간 력 현미경 (AFM) 8-10 같은 전문 기술을 정량 2D 동력학 가지고 마이크로 피펫 13, 14, 광핀셋 (15)과 생체막의 힘 프로브 (BFP) 16-21.

단지 세포 응집력 물리적 링크를 제공하는 이상은, 부착 분자는 그 주변과 통신하는 셀에 대한 ....

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Protocol

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이 프로토콜의 지침을 다음과 조지아 공대의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 인간의 적혈구 분리, 바이오 티 닐화 및 삼투압 조절

참고 : 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인 한 단계 1.1, 숙련 된 의료 전문가 등의 간호사가 수행해야합니다.

  1. 손가락 찌르기에서 혈액의 8-10 μL (한 방울)를 얻어 탄산염 / 중탄산염 버퍼 1 ㎖에 추가 (표 1, 2). 부드럽게 G 와동 또는 900 X에서 1 분 동안 혼합 원심 분리기를 피펫. 뜨는을 취소하고 한 번 더 씻는다.
  2. 작은 비커 비오틴 PEG3500-NHS 링커 (표 1) 3.5-4 mg의 무게. 최종 농도가 3 ㎎ / ㎖ 있도록 카보네이트 / 중탄산염 완충액에 용해시킨다.
  3. 탄산염 / 중탄산염 버퍼 171 μL, 적혈구 팩 10 μL와의 1049 μl를 혼합비오틴 링커 PEG3500-NHS 용액을 30 분 동안 RT에서 배양한다. 탄산염 / 중탄산염 버퍼 한 번 적혈구를 세척 한 후 두 번 N2-5 % 버퍼 (표 1, 2)와.
  4. 한편, 5 분 동안 바닥 진공....

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Results

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BFP 기술 1995 17 에반스 실험실에 의해 개척되었다.이 picoforce 도구는 광범위하게, 그들의 리간드 16,19,20과 상호 작용하는 부착 분자의 이차원 동력학을 분석하기 위하여, 표면에 고정화 된 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용 된 30, 분자 탄성 21,29을 측정하고, 단백질의 구조적 (21)을 변경 결정합니다. 대한 fBFP, 추가되는 해당 소프트웨어 시스템 (표 1)과 에피 형광 관련 장치 (그림 1A - C)의 추가 세트.

fBFP 시스템은 하드웨어 시스템 (광학 기계 및 전기 부품) 및 소프트웨어 시스템 (표 1 및도 1A, B)로 구성된다. 명 시야 및 에피 형광 현미경을 가능 광학 부품과 거꾸로 현미경 .......

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Discussion

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성공적인 fBFP 실험은 몇 가지 중요한 고려 사항을 수반한다. 힘의 계산이 신뢰할 수있는 위해 첫째, 마이크로 피펫, RBC, 프로브 비드가 가능한 동축에 가깝게 정렬되어야합니다. RBC 및 피펫 사이의 마찰을 무시할 수 있도록 피펫 내부 RBC의 투영 약 1 프로브 피펫 직경이어야한다. 전형적인 사람 RBC 들어, 최적 피펫 직경 17,30 식 1의 최적을 산출 2.0-2.4 ㎛ 인 것이다. 둘째, 힘 클램프 분석 및 열 변동 분석에서 측정이 단일 결합에 대한 대부분입니다 보장하기 위해, 20 %가 아래의 접착 주파수는 10,13,30를 유지한다. 여기서, 비 특​​정 유착 신중 (BSA 충분한 차단 통상 <5 %)을 제어한다. 또한, 데이터는 단일의 힘 - 드롭 접착 이벤트 수집한다 - 단일 단계 실종 단일 분자 거동의 특징 (유사한단일 분자에 형광) FRET. 형광 염료의 셋째, 부하 농도가 최상의 영상 품질을 달성하기 위해 경우에 따라 최적화되어야한다. 넷째, T 세포 또는.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 논문과 관련된 연구와 Zhu 실험실의 fBFP 기술 개발은 NIH 보조금 AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 및 TW008753의 지원을 받았습니다. 이 강력한 실험 도구를 발명한 Evan Evans와 BFP를 구축하는 데 도움을 준 Evans 연구소의 구성원인 Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, Ken Halvorsen에게 감사드립니다. 또한 기기 개발에 도움을 주신 다른 Zhu lab 구성원인 Fang Kong, Chenghao Ge 및 Kaitao Li에게도 감사드립니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4 • H2O)Sigma-AldrichS9638인산염 완충액 준비
Anhy. 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907인산나트륨 완충액 준비
탄산나트륨(Na2CO3)Sigma-AldrichS2127탄산염/중탄산염 완충액 준비
, 중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma-AldrichS5761탄산염/중탄산염 완충액 제제
염화나트륨(NaCl)시그마-알드리치S7653N2-5% 완충액 제제
염화칼륨(KCl)시그마-알드리치P9541N2-5% 완충액 제제
인산칼륨 일염기성(KH2PO4)시그마-알드리치P5655N2-5% 완충액 제
자당그마-알드리치S0389N2-5% 완충액 제제
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1비드 기능화
비오틴-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC 비오틴화
니스타틴시그마-알드리치N6261RBC 삼투압 조정
수산화암모늄(NH4OH)시그마-알드리치A-6899유리 구슬 실란화
메탄올BDH67-56-1유리 구슬 실란화
30% 과산화수소(H2O2)J. T. BarkerJan-86유리 구슬 실란화
아세트산(빙차)시그마-알드리치ARK2183유리 구슬 실란화
3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS)Uct Specialties, llc4420-74-0유리 구슬 기능화
붕규산 유리 구슬Distrilab Particle Technology9002유리 구슬 기능화
Streptavidin− MaleimideSigma-AldrichS9415유리 구슬 기능화
BSASigma-AldrichA0336리간드 기능화
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201세포 내 칼슘 형광 염료 로딩
디메틸 설폭시드 (DMSO)Sigma-AldrichD2650세포 내 칼슘 형광 염료 로딩
Quantibrite PE 비드BD Biosciences340495밀도 정량화
유세포 분석기BD BiosciencesBD LSRII 밀도 정량화
모세관 0.7-1.0 mm x 30 인치Kimble Chase46485-1마이크로 피펫
제작 불연성 / 갈색 마이크로 피펫 풀러셔터 기기P-97마이크로 피펫 제작
피펫 마이크로 포스NarishigeMF-900마이크로피펫 제작
미네랄 오일Fisher ScientificBP2629-1챔버 어셈블리
현미경 커버 유리Fisher Scientific12-544-G챔버 어셈블리
마이크로 인젝터월드 정밀 기기MF34G-5챔버 어셈블리
1 ml 주사기BD 309602챔버 어셈블리
마이크로피펫 홀더NarishigeHI-7챔버 어셈블리
CNC 가공을 사용하여 집에서 설계한 기계 부품 및 어댑터 제작. 생물 물리학 기기: 모든 부품은 CAD 설계에 따라 맞춤화됩니다.BFP 시스템
현미경(TiE 반전)NikonMEA53100BFP 시스템
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)NikonMRH00401BFP 시스템
카메라, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, 모노Graftek Imaging02-2020CBFP 시스템
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADCGraftek Imaging02-2185ABFP 고해상도
Karl SussPH400BFP 시스템수동 서브 미크론 프로브 헤드
TMC77049089BFP 시스템
3D 수동 번역 스테이지Newport462-XYZ-M
솔리드 웍스 3D CAD 소프트웨어SOLIDWORKS Corp.버전 2012 SP5BFP 시스템
LabVIEW 소프트웨어National Instruments버전 2009BFP 시스템, BFP 프로그램
3D 피에조 변환 단계Physik InstrumenteM-105.3PBFP 시스템
선형 피에조 어큐에이터Physik InstrumenteP-753.1CDBFP 시스템
Micromanager 소프트웨어버전 1.4fBFP 시스템, 형광 이미징 프로그램
듀얼 캠 (DC-2)광77054724fBFP 시스템
듀얼 캠 방출 필터 (T565LPXR)광도77054725fBFP 시스템
형광 카메라하마마츠ORCA-R2 C10600-10BfBFP 시스템
플라스틱 파라핀 필름 (파라 필름)Bemis Company, IncPM996병 밀봉
탄산염/ 중탄산염 완충액 (pH 8.5)8.4 g / L 탄산나트륨 (Na2< / sub>CO3< / sub>), 10.6 g / L 중탄산 나트륨 (NaHCO3< / sub>)
인산염 완충액 (pH 6.5-6.8)27.6 g / L NaPhosphate monobasic (NaH2< / sub>PO4< / sub> • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate 이염기성(Na2HPO4)
N2-5% 완충액(pH 7.2)20.77g/L 염화칼륨(KCl), 2.38g/L 염화나트륨(NaCl), 0.13g/L 인산칼륨 일염기성(KH2PO4), 0.71 g/L anhy. 인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4), 9.70 g/L 자당
: 제 시원격 제어 방진 테이블 (5 'x 3')이있는

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J.

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