우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
멤브레인 수용체 - 리간드 상호 작용은 다수의 세포 기능을 매개한다. 바인딩 역학 이러한 분자의 상호 작용에 의해 트리거 다운 스트림 신호는 가능성이 기계적인 환경에서 결합 및 신호 포획 장소에 의해 영향을받습니다. 최근 연구는 기계적인 힘에 의한 항원 인식을 조절하고 T 세포 수용체 (TCR)의 트리거링 할 것을 보여 주었다. 이 형광 현미경으로 단일 분자 힘 분광법을 결합한 새로운 우리가 개발 한 기술이라고 형광 생체막의 힘 프로브 (fBFP)에 의해 가능하게되었다. 민감한 힘 센서로서 고속 카메라와 실시간 영상 추적 기술을 매우 부드러운 인간 적혈구를 사용 fBFP 1 ~ PN (10-12 N) ~ 3nm 이상이며 ~ 0.5 밀리의 힘, 공간과 시간 해상도. fBFP으로, 하나는 정확하게 힘 조절에 따라 단일 수용체 - 리간드 결합 동력학과 동시에 이미지가 트리거 바인딩 세포 내 칼을 측정 할 수 있습니다cium 하나의 살아있는 세포에 신호. 이 새로운 기술은 기계적인 규제에서 다른 세포에서 다른 막 수용체 - 리간드 상호 작용과 신호 전달을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
세포 간 및 세포 - 대 - 세포 외 기질 (ECM)의 밀착성이 세포 표면 수용체, ECM 단백질, 및 / 또는 지질 1 간의 결합에 의해 매개된다. 바인딩은 세포의 기능을 형성 한 구조뿐만 아니라, 인식, 통신, 및 환경 1-3에 반응 할 수있다. 수용성 단백질 (예 : 사이토킨 및 성장 인자), 3 차원 (3D)에서 결합하는 세포 표면 수용체 상 유체 상 달리 세포 부착 수용체 분자 구속 두 대향면을 연결하는 좁은 접합부 갭에 걸쳐 그들의 리간드 결합을 형성 두 차원 (2D) 인터페이스 4-7에 확산. 일반적으로 기존의 결합 분석 (예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 또는 SPR)에 의해 측정되는 3D 동역학 달리, 챔버 (11, 12)을 흘러, 예컨대 원 자간 력 현미경 (AFM) 8-10 같은 전문 기술을 정량 2D 동력학 가지고 마이크로 피펫 13, 14, 광핀셋 (15)과 생체막의 힘 프로브 (BFP) 16-21.
단지 세포 응집력 물리적 링크를 제공하는 이상은, 부착 분자는 그 주변과 통신하는 셀에 대한 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜의 지침을 다음과 조지아 공대의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 인간의 적혈구 분리, 바이오 티 닐화 및 삼투압 조절
참고 : 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인 한 단계 1.1, 숙련 된 의료 전문가 등의 간호사가 수행해야합니다.
- 손가락 찌르기에서 혈액의 8-10 μL (한 방울)를 얻어 탄산염 / 중탄산염 버퍼 1 ㎖에 추가 (표 1, 2). 부드럽게 G 와동 또는 900 X에서 1 분 동안 혼합 원심 분리기를 피펫. 뜨는을 취소하고 한 번 더 씻는다.
- 작은 비커 비오틴 PEG3500-NHS 링커 (표 1) 3.5-4 mg의 무게. 최종 농도가 3 ㎎ / ㎖ 있도록 카보네이트 / 중탄산염 완충액에 용해시킨다.
- 탄산염 / 중탄산염 버퍼 171 μL, 적혈구 팩 10 μL와의 1049 μl를 혼합비오틴 링커 PEG3500-NHS 용액을 30 분 동안 RT에서 배양한다. 탄산염 / 중탄산염 버퍼 한 번 적혈구를 세척 한 후 두 번 N2-5 % 버퍼 (표 1, 2)와.
- 한편, 5 분 동안 바닥 진공....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
BFP 기술 1995 17 에반스 실험실에 의해 개척되었다.이 picoforce 도구는 광범위하게, 그들의 리간드 16,19,20과 상호 작용하는 부착 분자의 이차원 동력학을 분석하기 위하여, 표면에 고정화 된 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용 된 30, 분자 탄성 21,29을 측정하고, 단백질의 구조적 (21)을 변경 결정합니다. 대한 fBFP, 추가되는 해당 소프트웨어 시스템 (표 1)과 에피 형광 관련 장치 (그림 1A - C)의 추가 세트.
fBFP 시스템은 하드웨어 시스템 (광학 기계 및 전기 부품) 및 소프트웨어 시스템 (표 1 및도 1A, B)로 구성된다. 명 시야 및 에피 형광 현미경을 가능 광학 부품과 거꾸로 현미경 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
성공적인 fBFP 실험은 몇 가지 중요한 고려 사항을 수반한다. 힘의 계산이 신뢰할 수있는 위해 첫째, 마이크로 피펫, RBC, 프로브 비드가 가능한 동축에 가깝게 정렬되어야합니다. RBC 및 피펫 사이의 마찰을 무시할 수 있도록 피펫 내부 RBC의 투영 약 1 프로브 피펫 직경이어야한다. 전형적인 사람 RBC 들어, 최적 피펫 직경 17,30 식 1의 최적을 산출 2.0-2.4 ㎛ 인 것이다. 둘째, 힘 클램프 분석 및 열 변동 분석에서 측정이 단일 결합에 대한 대부분입니다 보장하기 위해, 20 %가 아래의 접착 주파수는 10,13,30를 유지한다. 여기서, 비 특정 유착 신중 (BSA 충분한 차단 통상 <5 %)을 제어한다. 또한, 데이터는 단일의 힘 - 드롭 접착 이벤트 수집한다 - 단일 단계 실종 단일 분자 거동의 특징 (유사한단일 분자에 형광) FRET. 형광 염료의 셋째, 부하 농도가 최상의 영상 품질을 달성하기 위해 경우에 따라 최적화되어야한다. 넷째, T 세포 또는.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 논문과 관련된 연구와 Zhu 실험실의 fBFP 기술 개발은 NIH 보조금 AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 및 TW008753의 지원을 받았습니다. 이 강력한 실험 도구를 발명한 Evan Evans와 BFP를 구축하는 데 도움을 준 Evans 연구소의 구성원인 Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, Ken Halvorsen에게 감사드립니다. 또한 기기 개발에 도움을 주신 다른 Zhu lab 구성원인 Fang Kong, Chenghao Ge 및 Kaitao Li에게도 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | 인산염 완충액 준비 |
| Anhy. 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 인산나트륨 완충액 준비 |
| 탄산나트륨(Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | 탄산염/중탄산염 완충액 준비 |
| , 중탄산나트륨(NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | 탄산염/중탄산염 완충액 제제 |
| 염화나트륨(NaCl) | 시그마-알드리치 | S7653 | N2-5% 완충액 제제 |
| 염화칼륨(KCl) | 시그마-알드리치 | P9541 | N2-5% 완충액 제제 |
| 인산칼륨 일염기성(KH2PO4) | 시그마-알드리치 | P5655 | N2-5% 완충액 제 |
| 자당 | 그마-알드리치 | S0389 | N2-5% 완충액 제제 |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | 비드 기능화 |
| 비오틴-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC 비오틴화 |
| 니스타틴 | 시그마-알드리치 | N6261 | RBC 삼투압 조정 |
| 수산화암모늄(NH4OH) | 시그마-알드리치 | A-6899 | 유리 구슬 실란화 |
| 메탄올 | BDH | 67-56-1 | 유리 구슬 실란화 |
| 30% 과산화수소(H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | 유리 구슬 실란화 |
| 아세트산(빙차) | 시그마-알드리치 | ARK2183 | 유리 구슬 실란화 |
| 3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | 유리 구슬 기능화 |
| 붕규산 유리 구슬 | Distrilab Particle Technology | 9002 | 유리 구슬 기능화 |
| Streptavidin− Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | 유리 구슬 기능화 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | 리간드 기능화 |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | 세포 내 칼슘 형광 염료 로딩 |
| 디메틸 설폭시드 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | 세포 내 칼슘 형광 염료 로딩 |
| Quantibrite PE 비드 | BD Biosciences | 340495 | 밀도 정량화 |
| 유세포 분석기 | BD Biosciences | BD LSR | II 밀도 정량화 |
| 모세관 0.7-1.0 mm x 30 인치 | Kimble Chase | 46485-1 | 마이크로 피펫 |
| 제작 불연성 / 갈색 마이크로 피펫 풀러 | 셔터 기기 | P-97 | 마이크로 피펫 제작 |
| 피펫 마이크로 포스 | Narishige | MF-900 | 마이크로피펫 제작 |
| 미네랄 오일 | Fisher Scientific | BP2629-1 | 챔버 어셈블리 |
| 현미경 커버 유리 | Fisher Scientific | 12-544-G | 챔버 어셈블리 |
| 마이크로 인젝터 | 월드 정밀 기기 | MF34G-5 | 챔버 어셈블리 |
| 1 ml 주사기 | BD | 309602 | 챔버 어셈블리 |
| 마이크로피펫 홀더 | Narishige | HI-7 | 챔버 어셈블리 |
| CNC 가공을 사용하여 집에서 설계한 기계 부품 및 어댑터 제작. | 생물 물리학 기기 | : 모든 부품은 CAD 설계에 따라 맞춤화됩니다. | BFP 시스템 |
| 현미경(TiE 반전) | Nikon | MEA53100 | BFP 시스템 |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP 시스템 |
| 카메라, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, 모노 | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP 시스템 |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP 고해상도 |
| Karl Suss | PH400 | BFP 시스템 | 수동 서브 미크론 프로브 헤드 |
| TMC | 77049089 | BFP 시스템 | |
| 3D 수동 번역 스테이지 | Newport | 462-XYZ-M | |
| 솔리드 웍스 3D CAD 소프트웨어 | SOLIDWORKS Corp. | 버전 2012 SP5 | BFP 시스템 |
| LabVIEW 소프트웨어 | National Instruments | 버전 2009 | BFP 시스템, BFP 프로그램 |
| 3D 피에조 변환 단계 | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP 시스템 |
| 선형 피에조 어큐에이터 | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP 시스템 |
| Micromanager 소프트웨어 | 버전 1.4 | fBFP 시스템, 형광 이미징 프로그램 | |
| 듀얼 캠 (DC-2) | 광 | 77054724 | fBFP 시스템 |
| 듀얼 캠 방출 필터 (T565LPXR) | 광도 | 77054725 | fBFP 시스템 |
| 형광 카메라 | 하마마츠 | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP 시스템 |
| 플라스틱 파라핀 필름 (파라 필름) | Bemis Company, Inc | PM996 | 병 밀봉 |
| 탄산염/ 중탄산염 완충액 (pH 8.5) | 8.4 g / L 탄산나트륨 (Na2< / sub>CO3< / sub>), 10.6 g / L 중탄산 나트륨 (NaHCO3< / sub>) | ||
| 인산염 완충액 (pH 6.5-6.8) | 27.6 g / L NaPhosphate monobasic (NaH2< / sub>PO4< / sub> • H2O), 28.4 g/L Anhy. NaPhosphate 이염기성(Na2HPO4) | ||
| N2-5% 완충액(pH 7.2) | 20.77g/L 염화칼륨(KCl), 2.38g/L 염화나트륨(NaCl), 0.13g/L 인산칼륨 일염기성(KH2PO4), 0.71 g/L anhy. 인산나트륨 이염기성 (Na2HPO4), 9.70 g/L 자당 |
참고문헌
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
