방법 논문

주문 제작 미세 투석 프로브 디자인

DOI:

10.3791/53048

⸱

2015년 7월 21일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

이 논문에서

요약

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미세 투석은 신경 과학 연구에 일반적으로 사용되는 기술이다. 따라서 상업 프로브는 큰 demand.In에 프로브 어셈블리가 $ 10 미만의 신뢰성, 동심, 맞춤형 미세 투석 프로브를 구축 상세하게 설명이 작품이다.

초록

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미세 투석은 신경 과학 연구에 일반적으로 사용되는 기술이다. 따라서 상업 프로브는 뇌척수액에, 생리 약리학과 병리학 적 변화를 모니터링하는 수요에 있습니다. 불행하게도, 상업 프로브는 공공 기관의 연구 그룹에 대한 비싸다. 본 연구에서는 프로브 어셈블리는 $ 10 미만의 신뢰성, 동심, 맞춤형 미세 투석 프로브를 구축 상세하게 설명한다. 미세 투석 프로브는 30 kDa의의 분자 컷 - 오프와 폴리 설폰 막으로 구성되어 있습니다. 프로브는 시험 관내 (100-1,600 다의 범위에서) 다른 분자량이 서로 다른 물리 화학적 특성을 가진 물질의 회수율을 비교한다. 프로브는 작은 화합물 포도당, 락 테이트, 아세틸 콜린 및 ATP에 대한 약 20 %의 체외 회수를 산출. 2~6%에 1,000-1,600 다 량 사이의 분자량을 갖는 신경 펩타이드에 대한 시험 관내 회수율. 따라서, 고 분자량 w 반면신경 펩티드의 팔은, 체외 복구 값을 분자량의 낮은 범위 (최대 500 다)의 화합물의 투석 체외 회복 속도에는 큰 영향을주지 않습니다를 하향 조정했다. 본 방법은 다른 컷오프 값 및 멤브레인 재료와 투석막의 이용을 허용한다. 따라서,이 특별 주문품 프로브 조립체는 광범위한 분자량 범위의 물질을 투석하기에 충분한 유연성 이점을 갖는다. 여기, 우리는 마우스와 쥐의 뇌 영역에서 미세 투석에 적용 2mm의 교환 길이와 미세 투석 프로브를 소개합니다. 그러나, 탐침의 치수는 쉽게 큰 동물에 사용되는 큰 길이 교환하도록 할 수있다.

서론

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미세 투석은 신경 과학 연구에 일반적으로 사용되는 기술이다. 지난 50 년 동안, 최소 침습 미세 투석 기법은 계속적으로 세포 외 공간에서 작은 분자량 화합물의 지방 농도를 모니터링하는 방법은 잘 확립 될 수 있도록 개선되었다. 거의 모든 조직 간질 유체가 자유롭게 움직이는 동물에서 연구 될 수있다.

Gaddum는 1960 년대에 푸시 - 풀 기술을 소개했다. 그는 Feldberg 등으로부터 접근 방식을 수정했습니다.하는 tubocurarine는 정맥이 측면 뇌실로 끝나는 및 정맥 (1)를 통해 또한 폐수를 수집을 통해 관류 하였다. Gaddum 동시에 끝이 주변의 뉴런으로부터 방출 신경 전달 물질을 제거하는 동안 두 개의 동심 강철 바늘로 이루어진 용액을 캐 뉼러에 의해 별개의 뇌 영역에 주입하고 관류시킨 푸시 풀 기술을 개발 하였다. 불행하게도, 조직 DAMA팁 주위의 정맥에 의한 GE는이 법의 적용을 제한했다. 이 방법의 추가의 발전으로, 비트 2 및 동료 수거 용액을 투석막에 의해 주변 조직으로부터 분리시킨 투석 백 방법을 도입했다. 그들은 개 목의 피하 조직에 투석 주머니를 이식. 투석 백의 함량은 무 단백질이며 이온 및 아미노산 많은 3 주 후에 분석 될 수있다. 다음 개발 dialytrode 원래 1972 4에 의해 설명되었다 델가도 프리미티브 미세 투석 프로브이었다.이 작았 적은 조직 5 변위되도록 마지막 Ungerstedt과 동료들은 미세 투석 프로브의 디자인을 향상시켰다.

동심 미세 투석 프로브는 모세 혈관과 유사하게 동작합니다. 시스템은 끊임없이 피검 결여하면서 주위 조직 유체 조성물을 갖춘 이온 용액으로 관류된다. 목외부 용액 또는 조직에 노출되는 전자 투석막이 반투과성이다. 그것은 자신의 농도 구배를 따라 6 프로브로 물질의 수동적 확산을 허용한다. 투자율은 분자량, 모양, 전하 및 화합물의 산도와 같은 많은 변수에 의존한다. 멤브레인 재료의 특성, 멤브레인의 기공 크기 및 레이트 7 흐름 인해 또한 제한된다.

도 1 및도 2는 동심원 미세 투석 용 프로브를 나타낸다. 관류 유체는 용융 실리카를 둘러싸는 금속 슬리브 내로 유입 관을 통해 들어간다. 금속 슬리브의 내부에서, 상기 용융 실리카를 따라 다운 스트림 및 그 선단에 나뭇잎. 투석막 및 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) (테플론 등) -tubing 사이의 공간에 관류 액은 상향 흐른다. 여기서, 조직으로부터 물질의 확산은 막을 둘러싸 이는 일어난다. 투석액은 PTF 통해 프로브 잎튜브를 콘센트에 접속되고, 회수 할 수있다 E-튜빙.

미세 투석 기법은 생체 내에서의 다른 기술에 대하여 여러 가지 장점을 갖는다. 프로브가 더 투석액 효소 또는 세포를 포함하지 않는 결과와 물리적 장벽을 구성한다. 따라서,이 종래 분석 용출액 정화용 필요가없고, 분석 물의 효소 적 분해는 더 일어나지 않는다. 산화 분해가 튜브에 분석 물이 통과하는 동안 발생할 수 있지만, 이것은 종종 관류에 산화 방지제 (예 : 아스코르브 산)를 추가로 방지 할 수있다. 대안 적으로, 신경 펩티드에 산화 적 손상은, 예를 들면, 효과적으로 투석액 8 수집 팁 출구 튜브를 대체함으로써 억제되었다. 투석액은 분석 방법의 거의 모든 종류를 직접 조사 할 수 있고, 다수의 분석 물을 동시에 회수 할 수있다. 이 시스템은 웨이크 동물에서 사용될 수 있으며, 거의 모든 뇌 영역이 될 수있다조사했다. 또한, 상기 프로브를 통한 약물의 주입이 가능 (retrodialysis)이다. 그러나, 또한 미세 투석 기술의 한계가있다. 다소 낮은 시간 해상도는 신경 전달 물질의 변화에​​ 관한 실시간 정보를 제공하지 않는다. 이 침습 기술이기 때문에, 프로브 주입이 단계 7,9,10 중에 요구되는 신경 전달 물질의 농도에 영향을 미칠 수있는 외과 외상 및 마취,시킨다.

투석액의 화합물의 농도는 세포 외액에서 실제 화합물 농도의 소량만을 포함한다. 세포 외액에서 미지 화합물의 농도 계산을 위해, 상대 체외 복구 계산되어야한다. 각각의 모든 프로브에 대한 시험 관내 회복 상대와 모든 화합물의 결정은 생체 내 실험을 시작하기 전에 필요하다. 이를 위해, 프로브를 함유하는 용액에 침지관류 유체 반면 관심 분석 종은 피검 결여 같은 해결책이다. 투석액 중의 화합물의 농도를 측정 한 후,이 데이터는 주위의 유체에서의 농도라고 할 수있다. 여러 가지 물질의 체외 회수 결정 구 동시에 구현 될 수있다.

많은 신경 과학 연구 그룹은 별개의 뇌 영역의 세포 외 공간에서 신경 전달 물질 및 대사 물질을 조사하기 위해 미세 투석 기법을 사용한다. 따라서, 상업 프로브는 신경 과학 연구 환경에서 큰 수요에 있습니다. 시중에서 판매하는 프로브의 큰 장점은 고 기능성 신뢰성이다. 상업 프로브 실험 장치는 잘 설립과 많은 잘 알려진 신경 전달 물질과 대사 산물에 대한 검증됩니다. 그러나, 시판되는 미세 투석 장비는 고가이고 번째로, 애플리케이션 (11)에서 적은 유연성을 갖는다 반면어떤 애플리케이션에 적용 할 수 있고, $ 10 미만으로 제작 될 수있는 마이크로 다이 프로브 조립체 상세히 제시 일이다. 이 주문 제작 프로브는 다양한 뇌 영역 (8)의 조사 시험을 동심 미세 투석 프로브입니다.

다른 분자량 (100-1,600 다의 범위)와와와 물질의 체외 프로브 회복에서 다른 물리 화학적 특성을 비교. 분자량과 분자량 200 미만 다, ATP와 포도당, 젖산 및 아세틸 콜린의 체외 복구 결정을 약 500 다 신경 펩티드 및 안지오텐신 II, 1000 다 상기 분자량 물질 P 및 소마토스타틴이 수행된다.

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프로토콜

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1. 준비 PTFE - 튜브

  1. 2.5 형상 조각으로 PTFE-튜브를 줄이십시오. 물리적 크기를 추정하는 규모의 용지를 사용하십시오. (그림 3a 참조)
  2. 출구 배관의 연결 용이하게하기 위해 각도에 하나의 끝을 잘라. (그림 3a 참조)
  3. 사포를 이용하여 거칠게 PTFE - 튜브 에폭시 접착제의 부착을 허용합니다.

2. 용융 실리카 준비

  1. 2.25 형상 조각으로 용융 실리카를 줄이십시오. (그림 3a 참조)

3. PTFE - 튜브에 용융 실리카를 삽입

  1. 평면 끝에서 1cm의 거리를 관통하는 중공 PTFE 섬유에 30 G 정맥을 삽입합니다. 프로세스를 단순화하기-PTFE 튜빙을 굽히고. (그림 3b 참조)
  2. 지도로 캐 뉼러를 사용하여 PTFE - 튜브에 용융 실리카를 삽입합니다. (도 3c 참조)
  3. 조심스럽게 정맥을 제거하고 용융 실리카를 고정합니다. (참조그림 3D)
  4. 용융 실리카는 평면 끝에 5mm을 투사 할 예정이다. (그림 3E 참조)
  5. 시아 노 아크릴 레이트 접착제에 의한 펑크 사이트에서 장소에 용융 실리카 접착제하고 밤새 강화 할 수 있습니다. (그림 3E 참조)

4. 준비 에폭시 접착제 (두 구성 요소 접착제)

  1. 미세 바늘의 도움으로 블랙 에폭시 접착제 (70) 부분에 노란색 경화제 (30) 부분을 추가하고 부드럽게 섞는다. 그것은 직접 사용할 수 있습니다.

5. 멤브레인 (모든 추가 단계가 현미경으로 수행해야하고, 규모 용지가 물리적 크기를 추정하는 데 사용되는) 적용

  1. 다음 PTFE - 튜브에 막 당겨 조심스럽게 용융 실리카를 통해 폴리 설폰 막을 당겨 날카로운 메스를 사용하여 5.5 mm로 멤브레인을 조정합니다. (그림 3 층 참조)
  2. 2mm의 교환 길이를 정의하는 좋은 펜으로 막에 표시 점을 설정막의 끝에서.
  3. 미세 바늘의 도움으로 멤브레인의 선단을 덮도록 에폭시 계 접착제의 적은 양을 적용한다. (그림 3g 참조)
  4. 에폭시 접착제와 단계 5.3에서 사용 된 것과 같은 미세 바늘)의 도움을 받아 투석막 및 PTFE 섬유 간의 접합부를 폐쇄한다. (그림 3g 참조)
  5. 2mm의 교환 길이를 보장하기 위해 표시 지점까지 막에 충분히 에폭시 접착제를 추가합니다. 이 밤을 통해 강화하도록 허용합니다. 교환 길이 결정하기 전에 (도 3g 참조), 상기 멤브레인은 5.5 mm이다. 막에 에폭시 접착제를 적용한 후, 멤브레인의 2mm 확산 사용할 수 있습니다.

6. 금속 슬리브를 적용

  1. 굽​​힘 펜치의 도움으로 1cm 금속 슬리브 조각으로 25 G 바늘을 잘라.
  2. 용융 실리카의 나머지 부분에 1cm 금속 슬리브 (25 G)를 당겨. 금속 슬리브 나중에 MICRODIA와 입구 관의 연결을 가능하게용해 프로브. (그림 3H 참조)
  3. 나머지 에폭시 접착제 금속 슬리브 및 PTFE - 튜브 사이의 공동 인감. 적어도 24 시간 동안 강화하도록 허용합니다. (그림 3I 참조)
  4. 추가 고정 및 안정화를위한 프로브의 분기 주위에 뜨거운 접착제를 적용.
    주 : 프로브의 입구 내부 용적은 0.045 μL와 출구 내부 부피가 2.5 μL이다. 따라서, 1 μL의 유량 / 분, 그 투석액의 수집을 시작하는 주입 관을 연결 한 후 약 2.5 분 걸린다. 본 프로토콜에 의해, 프로브 조립체 절차는 95 %의 신뢰성을 미세 투석 프로브를 산출한다.

체외 복구 실험 7. 성능

  1. 100을 함유 CSF로, 30 kDa의 컷오프와 ACSF 별도 실험에서 1 mM의 포도당과 1mM의 락트산을 함유 이루어지는 원액으로 2mm의 교환 길이 프로브를 담궈나노 ATP와 100 nm의 아세틸 콜린 (acetylcholine).
  2. ACSF으로 프로브를 관류. 1 μL / 분 유량을 설정하고 실내 온도 (22 ° C)에서 실험을 수행한다. 프로브는 원액에 1 시간 동안 평형 및 측정 할 때까지 -80 ° C에서 샘플마다 30 분 후 저장을 수집 할 수 있습니다.
  3. 체외 회수율의 산출에, 원액에 알려진 분석 농도 dialysates에서 분석 물의 농도를 비교한다. 원액 대 투석액에서 물질 농도의 비율과 같은 결과를 표현한다.

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결과

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동심 맞춤형 미세 투석 프로브는 30 kDa의의 분자 컷 - 오프와 폴리 설폰 막으로 구성되어 있습니다. 프로브 조립체는도 3에 도시되어있다.

그것은 각각 19.10 ± 1.2 % 21.2 ± 1.6 %의 작은 에너지 대사 포도당 (180.16 다) 및 락 테이트 (112.06 다)에 대한 시험 관내 회복을 나타내었다. 다 181.66의 분자량 양전하 아세틸 콜린의 경우, 22.6 ± 1.4 %의 체외 회수 값을 나타내었다. 551.62 다 세 음으로 하전 된 인산 잔류의 분자량 ATP는 유사한 정도 (22.4 ± 0.7 %)로 체외 복구를했다. 작은 분자의 체외 회복은 그림 4A에 표시됩니다.

작은 분자 (<500 다)에 비해 1000 다 위의 분자량 신경 펩타이드는 생체 복구 ...

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토론

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도 3은 예시적인 프로브 조립체를 도시한다. 올바른 내부 및 외부 직경의 크기는 밀접하게 관 관찰 할 필요가 (OD 1.6 mm, ID 350 μm의), 용융 실리카 (OD 105 μm의; μm의 ID 40)와 투석막 (OD 245 μm의; ID 210 μm의). 이 멤브레인 (105 μm의)와 막뿐만 아니라 튜브 (105 μm의) 사이의 용융 실리카 사이의 공간을 유지하는 것도 중요하다. 값이 다른 경우, 프로브의 압력이 상승하고 막 유출로 이어질 수 있습니다.

여기에서 우리는 마우스 뇌 영역의 미세 투석에 적용 2mm의 교환 길이와 미세 투석 프로브를 소개합니다. 그러나, 치수가 쉽게 큰 동물에 사용되는 더 큰 길이를 교환하도록 구성 될 수있다.

어셈블리의 일부는 대체 될 수있다. 예를 들어, PTFE-튜브를 사용할 필요가 없다. 폴리에틸렌 튜브의 응용 프로그램은 동일한 외부 및 여관 가능합...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 에폭시 접착제를 제공해 준 G. Barka(SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany)에게 감사를 표합니다. 또한, 저자는 모세관 혈액 모열 필터 FXCorDiax를 공급한 Fresenius Medical Care(독일 바트 홈부르크)에 감사를 표합니다. 자금은 프랑크푸르트 괴테 대학교(Goethe University of Frankfurt)에서 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
에폭시 접착제SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany     
용융 실리카 ID 40 µ m OD 105 &마이크로; mZiemer-Chromatographie, 만하임, 독일Art. 아니오 : 6.040105
폴리 설폰 멤브레인 (혈액 투석 필터 FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany참조 : F00001593
Cyanacrylate 접착제 (Pattex® 초강력 접착제 플라스틱)Henkel AG & Co. KGaA, D ü 독일
테플론 튜빙 1.6 x 0.35 mmSunChrom® GmbH, Friedberg, 독일Art. 아니오: 969-195.219
메스 (깃털® 외과 블레이드 번호 10)pfm 의료 ag, 쾰른, 독일Art. 아니오: 07310
현미경MEIJI Techno EMZ-8TR
30 G x 11" (0.3 x 25 mm) 캐뉼라  스테리칸® ZB.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany참조: 9324500
25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) 캐뉼라 100 Sterican®B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany참조: 9186166
파인 펜 (Stabilo 포인트 88 파인 0.4)Schwan-STABILO Schwanhä uß 어 GmbH & (주) KGArt. 아니오: 88/36
뜨거운 접착제  (글루 스틱 ULTRA Power x 11mm)스타이넬® GmbH, Herzebrock-Clarholz, 독일미술. 아니오: 4007841046910
사포 P60 230 x 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, 독일카탈로그 번호: 2608605397
셀도르프

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

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