표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

요약

싹트는 효모에서 염색체를 표면으로 퍼뜨리는 방법이 제시됩니다. 이 방법은 이전에 Loidl과 Klein이 설명한 방법에서 파생되었습니다. 또한, 퍼진 염색체의 면역 염색 절차를 시연합니다.

초록

싹트는 효모 Saccharomyces cerevisiae의 핵 크기가 작기 때문에 염색질 결합 단백질의 핵 미만 분포 분석을 위한 광학 현미경의 유용성이 제한됩니다. 효모 핵의 표면 퍼짐은 결합된 단백질의 손실 없이 염색질의 확장을 초래합니다. 표면 확산 방법은 세제 처리와 DNA 결합 단백질의 고정 균형을 맞춥니다. 시연된 방법은 Josef Loidl과 Franz Klein^1,2에 의해 기술된 것에서 약간 수정되었다. 이 방법은 유사분열 세포주기의 다양한 단계에서 많은 염색질 결합 단백질의 국소화를 특성화하는 데 사용되었지만 감수분열 재조합솜 및 시냅톤말 복합체와 같은 감수분열 염색체 구조 연구에 특히 유용합니다. 우리는 또한 원래 절차에서 요구되었지만 더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않은 독점 세제인 Lipsol의 사용을 필요로 하지 않는 변형에 대해 설명합니다. 염색체 확산 방법과 호환되는 면역염색 프로토콜도 설명합니다.

서론

출아 효모 사카로 마이 세스 세레 비지 염색체 기능을 조절하는 단백질에 대한 연구를 포함한 생물학적 과정의 분자 메커니즘의 연구에 많은 이점을 제공한다. 유전 적 분자 및 생화학 적 연구를위한 효모 신진의 공지의 장점이 있지만, 세포의 핵 단백질의 분포의 세포 학적 연구는 작은 크기에 의해 복잡하게된다. 전형적인 효모 핵은 가시광의 단지 약 5 배의 해상도 한계 미만 1 미크론의 직경을 갖는다. 따라서, 종래의 면역 염색에서 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그를 사용함으로써 얻어 질 수 핵 단백질의 분포에 대한 정보의 양이 제한된다. 단백질 subnuclear 분포를 특성화하는 유용한 방법은 확산 염색체 표면이다. 이 접근법은, 세포벽을 제거하고 세포 핵막 및 중단을 포함llowing 핵의 불용 내용 현미경 슬라이드의 표면에 정착한다. 이 불용성 성분은 핵 매트릭스와 염색체를 포함한다. 염색질 결합 단백질을 감지하는 능력을 향상 가용성 핵 콘텐츠의 삭제를 가능하게하는 것 외에도, 이러한 확산 핵 주위이 3 μm 내지 5의 직경을 가지고 (이배체 감수 핵 대) 염색체의 실질적인 신장에있어서의 결과를 확산 염색체 2 배체 유사 분열 핵에 대한 μm의 3. 이 압축 해제는 그대로 핵에 해결할 상대적으로 어렵거나 불가능 핵 하부의 검출 할 수있다.

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프로토콜

참고 : 프로토콜의 일부 단계 아래 깨끗한 흄 후드에서 작업이 필요합니다. 또한, 상기 방법은 spheroplasting을 모니터링 10X 작동 거리가 긴 대물 렌즈를 구비 한 효모 테트라 해부 현미경을 필요로한다. 현미경은 미리 후드에 설치해야합니다. 범위에서 미세 조작기의 팔과 판 홀더를 제거하고 멀리 작업 영역에서 안전한 장소에 이러한 항목을 배치합니다.

Spheroplasts 1. 준비

1. 원하는 조건 하에서 효모 성장. OD600 = 1.4 5 × ¹⁰⁷ 세포 / ㎖에서 각각의 샘플에 대해 2 × ¹⁰⁸ 세포, 즉 배양 4㎖를 사용. 샘플의 즉각적인 처리가 어떤 경우에는 바람직 할 수 있지만, 대부분의 애플리케이션에 대해, 세포 분취 액 처리되기 전 최대 8 시간 동안 얼음 상에 저장 될 수있다.
2. 세포 펠렛 3 분 5 (2345 RPM / 857.5 XG)를 설정에서 임상 원심 분리기에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다.
3. 펠렛에서 세포를 잃지 않도록 매체 복용 치료를 가만히 따르다. 부드럽게 1 ML의 ZK 버퍼에있는 세포를 재현 탁하고 40 μL 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. 부드러운 ....

결과

확산 핵의 모양은 매우 염색체 고정 및 드 압축 사이의 균형에 따라 달라집니다. 시약이 적절하게 균형 때에도 염색체 디 응집도의 변동 및 / 또는 다른 슬라이드 간 동일한 슬라이드의 상이한 영역에서 발생할 수있다. 화상 해석되기 전에 따라서, 슬라이드의 소정 영역에 확산의 품질을 평가한다.

'전면 도포'와 'underspreading "의 효과는 감수 분열 재조합 단백질에 대한 항체를 사용하여 설명 될 수있다. 그림 1에서 감수 핵은 DAPI와 DNA에 대한 염색이 진핵 가닥 교환 단백질 RAD51 및 Dmc1 및 카운터에 대한 면역 염색 더블 있습니다. 최적 확산 핵의 두 가지 예는도 1a에 도시되어있다.도 1b는 두 underspread 핵에 퍼지 핵도 1C 예의 예를 도시한다. 노트RAD51 및 Dmc1의 적은 초점이 제대로 핵 확산에 비해 이상과 u.......

토론

확산 핵의 모양은 고정과 용해/세제 처리 사이의 균형에 결정적으로 의존합니다. 위에서 논의한 바와 같이, 다양한 세포 구조를 보존하려면 다양한 PFA 농도를 사용해야 합니다. 대부분의 단백질에는 3% PFA가 최적입니다. 그러나 스핀들을 보존하려면 4% PFA를 사용해야 합니다. 단일 시약 세트를 사용하더라도 고정에 대한 용해 시기도 확산 핵의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 가장 일관된 결과를 얻으려면 광학 현미경으로 용해를 직접 관찰하여 각 스페로플라스트 샘플에 대한 용해 시간을 정규화해야 합니다. 훈련된 눈에는 둥근 구형체가 용해 전에 부풀어 오르면서 어두워집니다. 용해 후 세포 잔해는 떠다니는 "유령"으로 나타납니다. 실험적으로 최적화된 시약 농도와 타이밍의 샘플 간 표준화의 조합은 일관되게 잘 퍼진 핵을 산출합니다.

확산 염색체를 시각화하는 데 사용되는 형광단과 현미경의 선택은 원하는 구조에 따라 다릅니다. 일반적으로 퍼진 핵은 매우 얇고(약 200nm 이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Zymolyase	미국 생물학적	Z1004	20% 포도당이 보충된 50mM Tris pH 7.5에 2mg/mL 용액을 준비합니다. 신선한 각 실험을 준비하고 4°C에 보관하십시오. 사용할 준비가 될 때까지 C.
립솔	L.I.P. 주식회사	더 이상 상업적으로 이용 가능하지 않습니다	.물에 1%(V/V) 용액을 준비합니다. 얼음에 보관하세요.
NP-40	USB	19628	물에 1%(v/v) 용액을 준비합니다. 얼음에 보관하세요.
Tween 20	Sigma	P2287
슬라이드	Corning	2948-75x25
표준 커버슬립	Fisher	12-544-E 또는 12-540-B
고해상도 커버슬립	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 솔루션	Kodak	P-7417	물 속에 0.2% (v/v) 용액을 준비합니다.
TBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	TBS에서 1 % (w / v) 용액을 준비합니다. 4 °C에 보관하십시오. C를 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.
1차 항체
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) 항체
Vectashield mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Plastic slide box	Fisher	03-448-1	건조 스프레드가 들어있는 슬라이드를 -20°C의 슬롯에 보관하십시오. 또한 습식 챔버로 사용하십시오.
골판지 슬라이드 박스	Fisher	12-587-10	스테인드/밀봉된 슬라이드를 편리하게 운반하거나 4°C에 보관하는 데 사용합니다.
코플린 항아리	피셔	08-816	슬라이드용 세면대로 사용하세요.