방법 논문

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

DOI:

10.3791/53099

⸱

2015년 10월 19일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University, 4Regional Center for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, 5Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다. 이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

초록

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세포 치료제의 표적 전달이 오프 - 표적 부위에 악영향을 최소화하면서 목표 부위에 치료 효과를 집중하여 의치 광범위한 애플리케이션 혜택 것이다. 자기 세포 타겟팅, 효율적인 안전하고 간단 전달 기술이다. 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPION)은 생체 적합성, 생분해 성이며, 자기장에 응답들을 렌더링하기 위해 세포로 endocytosed 수있다. 합성 과정은 마그네타이트 FE (3 O 4)를 생성하는 것을 포함하는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 코팅을 형성하는 고속 유화 나노 입자. PLGA-마그네타이트 SPIONs는 약 10 nm의 직경을 포함 마그네타이트 코어 직경이 약 12​​0 나노 미터이다. 문화 매체에 배치 할 때, SPIONs 자연스럽게 세포에 의해 endocytosed 및 세포질 엔도 좀 내 작은 클러스터로 저장됩니다. 이들 입자는 세포에 충분한 질량을 부여 자성자기장 내에서 대상을 허용합니다. 수많은 세포 정렬 및 대상 응용 프로그램은 자기장에 반응하는 다양한 세포 유형을 렌더링하여 사용할 수 있습니다. SPIONs뿐만 아니라 종양 치료 또는 조직 솔더링 로컬 고열증의 의료 영상 조영제로 사용, 표적 유전자 또는 약물 전달, 진단 분석 및 생성을 포함하는 다른 생물 의학 다양한 애플리케이션을 갖는다.

서론

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신체 내 특정 부위로의 세포 표적 전달 및 포획은 다양한 생체 의학 응용 분야에 바람직합니다. MRI 유도 집속 초음파를 통해 신경 줄기세포를 뇌로 전달하는 것은 신경퇴행성 질환, 외상성 뇌 손상 및 뇌졸중에 대한 가능한 치료 옵션으로 제안되었습니다1. 중간엽 줄기세포는 자연적인 종양-트로픽 특성으로 인해 종양에 항암제를 전달하는 능력에 대해 연구되고 있습니다2,3. 심장 줄기세포는 심근경색의 가능한 치료법으로 심장에 전달되었습니다4,5. 혈관 스텐트는 순환하는 전구 세포를 포획하기 위해 CD34 항체와 함께 개발되었습니다6. 이러한 세포 표적화 접근법은 유망하지만 세포 특이성 부족, 일관되지 않은 세포 보유 및 비표적 세포 전달과 같은 단점이 있습니다.

현재 방법의 전반적인 목표는 다양한 세포 전달 및 분류 응용 분야에서 세포의 자기 유도 표적화를 가능하게 하는 것입니다. 자기 표적화는 최소한의 off-target effect로 특정 세포를 특정 표적 부위에 제어된 전달을 가능하게 합니다7. 자기장은 신체 내에서 자기적으로 표지된 세포의 움직임을 안전하게 지시하기 위해 이식된 장치 또는 외부 장치에 의해 생성될 수 있습니다8. 수많은 연구 노력은 재생 결과를 개선하기 위해 심장9-14, 망막15, 폐16, 피부17, 척수18, 19, 뼈20, 간21 및 근육22, 23과 같은 손상된 조직에 줄기 세포를 자기적으로 표적으로 삼는 데 중점을 두었습니다.

세포의

Magnetic targeting of cells는 이식형 심혈관 장치를 내피화하는 수단으로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 균일하고 완전한 내피는 혈전증과 염증을 완화하기 위해 장치와 순환 혈액 요소 사이에 장벽을 제공합니다. 내피 세포는 이식 전 또는 이식 후 혈관 시스템을 통해 장치로 전달될 수 있습니다. 두 경우 모두 자기장을 사용하여 세포를 장치 표면으로 포획하고 혈액 순환에 의해 생성된 전단 응력을 받을 때 세포를 유지합니다. 자기 혈관 스텐트(24-27) 및 혈관 이식편(28)은 모두 이러한 목적을 위해 제작 및 테스트되었습니다.

자기 세포 타겟팅에는 자기 운반체 입자로 세포를 라벨링하는 전략이 필요합니다. 이러한 입자는 항체 또는 리간드/수용체 쌍을 통해 세포 표면에 결합되거나 세포 내포작용(endocytosation)될 수 있습니다. 초상자성 산화철 나노입자(SPION)는 생분해성이고, 생체 적합성이 있으며, 다양한 세포 유형에 의해 쉽게 세포내이입됩니다29. 이러한 입자는 자기장에 반응하는 세포를 효과적으로 렌더링하고 시간이 지남에 따라 자연적으로 분해됩니다. SPION은 다양한 자기 표적화 및 분류 응용 분야를 위해 배양 중인 세포를 자기 라벨링하는 간단하고 안전한 수단을 제공합니다. SPION을 마그네타이트(Fe3,O4) 코어 및 폴리(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 쉘과 합성하는 방법이 제공됩니다. 또한 SPION으로 배양된 세포를 표지하는 방법이 제공됩니다.

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프로토콜

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자철광 젤 1. 합성

  1. 에틸 알코올 다음에 탈 이온수 다음에 진한 염산을 사용하여 모든 유리 제품을 씻으십시오. 바람직하게는 건조 오븐에서, O / N을 건조하도록 허용합니다.
    주의! 염산 유해 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용; 에틸 알코올은 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  2. 탈 가스 탈 H 2 O의 500 mL로 부드럽게 30 분 동안 N 2 가스 버블 링에 의해 Dreschel 병을 사용합니다.
  3. 셋업 화학 물질 흄 후드 내에서 자철광 합성 장치.
    1. isomantle 히터 내에 500㎖의 3 구 둥근 바닥 플라스크를 놓고 클램프를 사용하여 중심 목을 고정 및 스탠드.
    2. 환저 플라스크의 목의 측면에 하나의 고무 격막 나머지 측 경부에 고무 격막과 환류 냉각기를 설치한다. 지속적으로 환류 냉각기를 통해 차가운​​ 물을 실행합니다.
    3. 펑크 일E 환저 플라스크의 고무 N 2 가스 라인에 연결된 바늘을 격막과 기포에 실행 가스 라인에 연결된 바늘을 환류 응축기의 고무 격막을 천공 (즉, 물을 플라스크) 가스 유출을 시각화.
    4. 패들 어댑터를 통해 둥근 바닥 플라스크의 중심 목에 블레이드 패를 설치합니다. 스탠드에 장착 된 오버 헤드 교반기에 블레이드 패의 샤프트를 연결합니다.
  4. N 2 가스로 둥근 바닥 플라스크를 제거하고 낮은하지만 검출 속도로 흐르는 N 2 가스를 둡니다.
  5. 둥근 바닥 플라스크에서 환류 응축기를 제거하고, 철 (III) 클로라이드, 철 0.6125 g (II) 클로라이드 수화물 1.000 g을 추가하고, 탈기 H 2 O 50 ㎖
    주의! 철 (III) 클로라이드 및 철 (II) 클로라이드 테트라는 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  6. 50 가열하면서 환류 냉각기를 교체하고 1,000 rpm에서 교반° C. 이러한 조건에서 교반은 10 나노 미터 직경의 마그네타이트 나노 입자를 생성합니다.
  7. 일단 50 ℃에서 계속 교반 둥근 바닥 플라스크에 고무 격막을 통해 주입하여, 28 % 수산화 암모늄 용액 10 ㎖를 추가한다.
    주의! 수산화 암모늄은 유해한 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    주 : 수산화 암모늄 용액 마그네타이트를 침전 사용되고 용액 검게한다.
  8. 계속 교반하면서 암모니아 가스를 끓여 90 ℃로 둥근 바닥 플라스크 및 열에서 고무 격막 및 N 2 가스 라인을 제거합니다.
    주 : 환류 응축기의 고무 격막을 천공하여 둥근 바닥 플라스크에 N (2)의 흐름을 유지하는 것이 선택적이다, 그러나, 마그 헤 마이트에 마그네타이트의 산화가이 단계에서 무시할 수있다.
  9. 계속 교반하면서 한 번에 90 ℃에서, 둥근 바닥 플라스크에 올레산 1 ㎖를 추가한다. 올레산 노나 코팅 마그네타이트를 사용noparticles는 마그네타이트 겔을 형성한다.
    주의! 올레산은 유해 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  10. 둥근 바닥 플라스크에 고무 격막 및 N 2 가스 라인을 교체하고 환류 냉각기를 제거합니다.
  11. 2 시간 동안 500 rpm에서 열 및 교반을 끕니다.
  12. isomantle 히터에서 둥근 바닥 플라스크를 꺼내고 마그네타이트 겔을 보유하는 형틀의 저부에 대해 유지 강력 자석을 사용하는 동안 남아있는 액체를 가만히 따르다.
    주의! 손상이나 부상을 방지하기 위해 극도의주의 강한 자석을 처리합니다.
  13. (선택 사항) / N은 ​​공기 건조 O에 자철광 젤을 허용합니다.

자철광 젤 2. 정제

  1. 마그네타이트 겔을 용해시키기 위해 둥근 바닥 플라스크에 헥산 40 mL로 추가
    주의! 헥산 유해한 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용하십시오.
  2. 잔류 H 2 O를 제거하는 이리저리 탈기 H 2 O 40 mL를 분별 깔때기를 사용하여마그네타이트 용액 미터.
    1. 천천히 분리 깔때기 내의 H 상 자철광 솔루션 2 O을 부어 부드럽게 5 분 동안 2 상 액체 소용돌이 친다.
    2. 밖으로 배출 및 하부 수성 부분을 폐기합니다.
    3. 천천히 마그네타이트 용액 아래가 침전되도록 분별 깔때기로 탈기 H 2 O 40를 가하여 천천히 소용돌이 이전 드레인.
    4. 세 번째 씻어 반복합니다.
  3. , 삼각 플라스크에 마그네타이트 용액을 전송 무수 황산나트륨 상당 몇 주걱을 추가 소용돌이 마그네타이트 용액에 남아있는 잔류 H 2 O를 제거 하였다.
  4. 황산나트륨 및 잔류 H 2 O를 제거하는 필터 깔때기 1 ㎛ 여과지 마그네타이트 용액 필터
    참고 : 진공 지원이 좋습니다.
  5. 50 ㎖ 플라스크에 증발 마그네타이트 용액을 옮기고 용 헥산을 증발시켜, 회전 증발기를 사용하여다음의 조건으로 2 시간 : 중간 회전 속도, 진공을 50 ℃의 수욕을 증발 플라스크에, 도포하고, 24 ° C의 물을 순환하는 콘덴서.
    참고 : 선택적으로, PLGA으로 코팅하기 전에 자철광 젤을 저장합니다.

PLGA 셸 자철광 나노 입자의 코팅 (3)

  1. 1.5 % (m / v)의 용액을 만들고, 에틸 아세테이트 240 ㎖ 중의 3.60 g의 PLGA (75/25 블렌드)를 녹인다. 주의 : 에틸 아세테이트는 유해한 - 흄 후드에서 개인용 보호 장비는 작업을 착용하십시오.
  2. 5.0 % (m / v)의 용액을 만들기 위해 자석 교반기를 사용하여 탈기 H 2 O 500ml에 플루로 닉 F-127 25.00 g을 용해.
    주 : 플루로 닉 F-127은 생체 적합성 계면 활성제로 작용 비이 온성 양친 성 블록 공중 합체이다. 이 단계 3.3.2 중유 에멀젼을 안정화하는데 도움.
  3. microspatula를 사용하여 가중 유리 병 안에 여섯 0.040 g 씩에 자철광 젤를 수집합니다. 반환 한각 나누어지는에 대한 다음과 같은 코팅 및 세척 과정을 ORM.
    참고 : 분취 액을 4 단계에서 분해 이전하는 동결 건조를 최소화하면서 순도와 수율을 극대화 효율적 처리 및 자기 경사를 보장하기 위해 필요하다.
    1. 10 분 동안 초음파 세척기에서 0.040 g의 마그네타이트 겔의 분취 량과 플라스틱 비이커 및 초음파 처리에 PLGA 용액 40 ml를 추가하기.
    2. 플라스틱 비이커에 플루로 닉 용액 80 ml에 첨가하고 약 7 분은 수 중유 에멀젼으로서 마그네타이트 PLGA 나노 입자에 코팅을 형성하기 위해 즉시 높은 설정으로 실험실 혼합기 유화.
    3. 즉시 에틸 아세테이트를 증발시켜 화학 퓸 후드에서 1 시간 동안 탈 H 2 O 및 초음파 처리의 1 L에 SPION 용액을 희석.
    4. SPION 솔루션 옆에 강력한 자석을 놓고 부드럽게 자석에 갈색 SPIONs를 수집 저어.
      참고 :이 간헐적으로 몇 시간 동안 교반 할 필요가있다솔루션 전에 s는 SPIONs의 대부분은 수집 된 것을 나타내는 하얗게 변합니다.
    5. 자석 비이커 SPIONs을 유지하면서 수용액 따르다.
    6. 다음과 같이 SPIONs 세 번 씻으십시오.
      1. 탈 H 2 O 1 L에 SPIONs 일시 중단
      2. 20 분의 SPION 솔루션을 sonicate하세요.
      3. SPION 솔루션 옆에 강력한 자석을 놓고 부드럽게 자석에 갈색 SPIONs를 수집 저어. 이 용액 SPIONs 대부분 수집 된 것을 나타내는 명확한 꺼질 때까지 몇 시간 동안 간헐적으로 교반 할 필요가있다.
      4. 자석 비이커 SPIONs을 유지하면서 수용액 따르다.
  4. 수성 현탁액과 같은 단일 가중 된 유리 바이알에 여섯 마그네타이트 겔 분취 각각으로부터 합성 SPIONs 수집. 필요에 따라 선택적으로 자기 여분의 물을 가만히 따르다.

4. 동결SPIONs의 -drying

  1. SPION 솔루션을 동결.
  2. 동결 건조 동결 건조기에서 SPION 솔루션 O / N을.
  3. 동결 건조 SPIONs 무게. 셀 라벨에 사용 전까지 동결 건조 SPIONs은 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
    참고 : -20 ° C 극적에 저장이 분해 반응 속도를 줄이고 수명을 증가시킨다.

SPIONs와 세포의 5 라벨링

  1. 40 mg / ml의 농도로 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 SPIONs의 분취 량을 중단하고 30 분 동안 초음파 처리.
  2. 세포 배양 배지의 5 μL / ㎖의 농도에서 세포의 거의 합류 플라스크 SPION 용액을 추가한다. 조심스럽게 플라스크를 흔들어 균일 한 분포를 확인합니다.
  3. 37 ° C에서 16 시간 동안 세포를 배양한다.
  4. 부드럽게 문화 매체를 대기음하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
  5. 자기 표지 세포를 수집하고 실험을 위해 사용합니다.
  6. 미사용 SPION 용액을 4 ℃에서 저장 될 수 있고, 우리되어야몇 개월 이내에 에드. 각 사용하기 전에 30 분 동안 초음파 처리.

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결과

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마그네타이트 나노 입자는 50 ℃, 1000 rpm으로 (도 1) 및 철 (III) 클로라이드, 철 (II) 클로라이드 수화물 수용액을 교반 한 결과, 직경이 약 10 나노 미터이다. 이러한 결과는 마그네타이트 나노 입자가 성공적으로 합성을 보여준다. 이것은 처음으로 합성을 시도 할 때의 배치 작은 샘플로부터 취한 마그네타이트 나노 입자의 크기와 모양을 확인하는 것이 중요하다. 투과 전자 현미경 (TEM)이 입자를 시각화하는 바람직한 방법이다. 배치는 폐기되어야하고, 마그네타이트 나노 입자는 직경이 약 10 nm의하지 인 경우도 1에 나타낸 바와 같이 구면 합성을 다시 시도한다.

120 나노 미터 (도 2) 직경의 PLGA-마그네타이트 SPIONs에서 고속 유화제 결과를 사용하여 PLGA와 마그네타이트 나노 입자를 코팅. 이러한 결과는 성공적인 보여PLGA - 자철광 SPIONs의 합성...

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토론

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모든 나노 입자 합성 프로토콜로서, 화학 반응물의 순도는 최소한의 세포 독성 효과를 가질 것이다 고품질 SPIONs 달성을위한 중요하다. 이것은 올레산 (≥99 %), 철 (II) 클로라이드 수화물 (≥99.99 %), 철 (III) 클로라이드 (≥99.99 %), 에틸 아세테이트를 포함하여 매우 순수한 시약을 구입하는 것이 중요하다 (HPLC 등급, ≥99.9 % ), 헥산 (HPLC 등급, ≥97.0 %), 수산화 암모늄 (≥99.99 %) 및 ​​황산나트륨 (≥99.0 %). 그것은 상대적으로 비용이 많이들 수 있습니다 매우 순수하고 높은 품질의 PLGA를 구입 특히 중요하다. 또한, 모든 유리 제품은 완전히 염산, 탈 이온수, 및 에틸 알콜로 세척하고, 사용하기 전에 건조되도록해야한다.

마찬가지로, 프로토콜 내의 정화 및 세척 단계는 최종 SPIONs 높은 품질의 최소한의 세포 독성 영향을 미칠 것입니다 보장하기 위해 매우 중요합니다. 자철광 젤이 없어야합니다PLGA와...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 유럽지역개발기금(European Regional Development Fund)인 FNUSA-ICRC의 자금 지원을 인정하고자 합니다. CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0123), 미국심장협회 과학자 개발 보조금(AHA #06-35185N) 및 미국 국립보건원(NIH #T32HL007111).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
수산화 암모늄 용액, H<>sub>2O, &ge에서 28% NH; 99.99% 트레이스 메탈 기반Sigma-Aldrich338818-100ML 해로운 시약 - 개인 보호 장비를 착용하십시오.
Dreschel 병, 500 ml에이스 글라스5516-16
에틸 아세테이트, CHROMASOLVR Plus, HPLC용, 99.9% Sigma-Aldrich650528-1L유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업
에틸 알코올Sigma-AldrichE7023유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용
증발 플라스크, 50ml, 24/40 조인트Sigma-AldrichZ515558윤전 증발기와 함께 사용
여과지, 직경 3cm, 등급1 Fisher09-805P유리 필터 퍼넬
유리 비커, 1 LFisherFB-101-1000SPIONs 세척용
유리 필터 퍼널, 진공 호스 어댑터, 24/40, 30 mLFisherK954100-0344에
유리 바이알 캡Fisher03-391-46유리 바이알과 함께 사용
유리 바이알, 2mlFisher03-391-44자철광 젤 및 자철광 수집용 SPIONs
헥산, CHROMASOLVR, HPLC 용, ≥ 97.0% (GC)시그마-알드리치34859-1L 유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.
염산Sigma-AldrichH1758유해 시약 - 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업
철(II) 염화물 사수화물, ≥ 99.99% 미량 금속 기준 Sigma-Aldrich380024-5G유해 시약 - 개인 보호 장비
착용 염화철(III) 무수, 분말, ≥ 99.99% 미량 금속 기초Sigma-Aldrich451649-1G유해 시약 - 개인 보호 장비 착용
이소맨틀 히터, 500mLVoight GlobalEM0500/CEX1
실험실 믹서SilversonL5M-A
동결건조기Labconco7670520
MicrospatulasFisher21-401-25A자철광 이송용 젤
NdFeB 자석, 1 in x 1 in x 1 in놀라운 자석C1000H-M매우 강한 자석, 조심스럽게 다루십시오
올레산, ≥ 99% (GC)시그마-알드리치O1008-5G 냉장고에 보관하십시오. 유해한 시약 - 개인 보호 장비를 착용하십시오
오버헤드 교반기IKA2572201
오버헤드 교반기 클램프IKA2664000오버헤드 교반기와 함께 사용
오버헤드 교반기 H-standIKA1412000오버헤드 교반기와 함께 사용
인산염 완충 식염수Life Technologies10010-023
플라스틱 비커, 250mlFisher02-591-28
PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend)PuracPDLG 7502PDLG 7502A도 사용될 수 있습니다. 냉동고에 보관
Pluronic F-127 분말, BioReagent, 세포 배양에 적합Sigma-AldrichP2443-250G 
PTFE 확장 가능한 블레이드 패들, 8mm 직경SciQuipSP4018
PTFE 용기 어댑터, 24/40, 8mm 직경 패들에 적합Monmouth ScientificPTFE 용기 어댑터 A480PTFE 확장 블레이드 패들과 함께 사용
재순환 냉각기Clarkson696613회전 증발기
역류 응축기와 함께 사용, 24/40, 250mmAce Glass5997-133에 적합
회전 증발기Clarkson216949
고무 세프타, 24/40Ace Glass9096-56
분리 깔때기와 스토퍼, 250 mlFisher10-438E
황산나트륨 ACS 시약, ≥ 99.0%, 무수, 과립Sigma-Aldrich239313-500G 
3 목 둥근 바닥 플라스크, 각진, 24/40 조인트, 500mlAce Glass6948-16
초음파 세척기 천공 팬Fisher15-335-20A초음파 세척기와 함께 사용
초음파 세척기, 2.8LFisher15-335-20
진공 컨트롤러Clarkson216639rotoevaporator와 함께 사용 (옵션)
진공 펌프Clarkson219959회전증발기와 함께 사용
맞음;

참고문헌

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