Method Article

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

DOI:

10.3791/53152

⸱

August 29th, 2015

 , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Sunnybrook Research Institute, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 새로운 신호 전달 경로를 밝히기 위해 사용될 수 인산화 기판 전용 인간 단백질 키나제를 식별하기위한 스크리닝 플랫폼을 개발했다. 우리의 접근 방식은 정제 GST - 태그 인간의 단백질 키나아제의 라이브러리와 관심의 재조합 단백질 기판의 사용을 특징으로한다. 우리는, CREB-규제 전사 보조 활성화 인자 2 (CRTC2)에 글루코스 조절 사이트 키나아제 MAP / 미세 소관 연관 조절 키나제 2 (MARK2)를 식별하는 베타 세포의 증식에 필요한 단백질뿐만 아니라을이 기술을 사용한 티로신의 액슬 제품군은 어댑터 단백질 엘모의 인산화에 의한 세포 전이의 규제로 키나아제. 우리는이 기술을 설명하고 세포가 환경 자극에 반응하는 방법의 포괄적 인지도를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단백질 번역 후 변형 (PTMS)는 세포 내 통신을위한 필수적이다. 아마도 모든 PTMS의 연구 최고 세포 내 현지화, 형태, 안정성, 생화학 적 활동을 포함한 단백질 기능의 무수를 조절 단백질 인산화 효소에 의해 촉매 인산화이다. 표적 단백질의 인산화 부위의 식별은 트립신 포스 포 매핑 또는 인산화 펩티드 1,2- 위해 농축 된 샘플을 이용하여 현재 표준 프로테옴 기법에 의해 달성 될 수있다. 발현 프로테옴 사분의 삼가 3 인산화 될 것으로 예상하고 100 만 6까지 예상치 200,000 인산화 부위 5를 식별하는 동안, 이들의 대부분은 통로 또는 단백질 키나제 시그널링 어떠한 할당 생물학 없다.

인산화 사이트의 식별은 비교적 큰 도전이고, 비교적 간단하지만기판 쌍 :이 사이트를 대상으로 동족 키나제 (들), 우리가 매핑 키나제로 참조하는 프로세스를 식별합니다. 기판 쌍이 설명되었지만, 어느 주목 키나아제로 시작하고 그 기판을 찾고 관심 또는 기판에서 시작하여 개질 키나아제 7-11 또는 실험적 계산 (12)을 찾기 위해 시도 : 키나아제를 식별하기위한 여러 가지 방법. 공지 인산화 기판 키나제를 식별하는, 생물 정보학 기판과 강수량 복합체를 형성 키나제 인산화 잔사 (컨센서스 사이트) 측면뿐만 아니라 식별 아미노산의 짧은 보존 된 서열을 포함하는 단백질을 식별하는 데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되어 종종 성공을 충족하지 않습니다.

우리는 주어진 빠르게 기판 (13)을 인산화 키나아제를 식별 체계적인 접근 기능을 개발 하였다. 스크린 분석법 우수한 특정을 생산잠재적 인 동족 키나제에 대한 아주 명확한 선택과 성만. 생물학적 신호에 인산화의 중심성을 감안할 때, 스크린은 거의 모든 세포 신호 전달 경로 14-16에서 발견에 유용합니다. 스크린은 인간 단백질 키나제의 라이브러리로 대규모 키나아제 분석을 수행하는 것을 포함한다. 키나아제는 박테리아 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) 단백질로 태그 된 재조합 효소 즉, 포유 동물 세포 추출물로부터 정제 - 박테리아로부터 제조 된 것과 달리 - 종종 필요한 상류 단백질 키나제의 존재하에 생성되고 재조합 효소는 시험 관내에서 활성을 갖는. 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 활성이 하류 키나제 활성화에 필요하면서 실제로 효모 (10)에 존재하는, 효모 게놈은 500 유전자 17 포유류 kinome는,하기 위해 훨씬 더 복잡해질 것을 나타내는, 122 단백질 키나제를 코딩 REGULA고차 생물에 고유의 프로세스를 테. 또한, 세포 생물학 및 (등과 소분자, 성장 인자, 호르몬 등) 인간의 질병과 관련된 다른 자극의 효과는 적절한 컨텍스트 (14, 15)는 조절 키나제 활성에 사용될 수있다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시약, 플레이트, 및 세포의 1. 준비

  1. 25 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 50 mM의 불화 나트륨, 0.5 mM의 EDTA pH를 8.0, 0.5 % 트리톤-100, 5mM의 베타 - 글리세로 포스페이트, 5 % 글리세롤 : 500 ml의 용해 완충액을 만든다. 4 ℃에서 보관하십시오. 사용 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 및 1 mM의 나트륨 바나 데이트를 추가하기 직전. 이 단계 후에, PMSF가 임의의 세정 완충액으로 요구되지 않는다.
  2. 200 mM 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 베타 글리세 (FW 216), 2 mM의 나트륨 바나 데이트 : 10 배 키나제 버퍼의 20 mL로한다. -20 ° C에서 1 ml의 튜브에 나누어지는 및 저장. 사용 5 mM의 DTT를 추가하기 직전.
  3. 300 μM 아데노신 삼인산 (ATP), 66 밀리미터의 MgCl 2, -20 ° C에서 33 mM의 MnCl 2 1 ml의 튜브에 나누어 저장 : 10 배 M-ATP 버퍼의 20 mL로한다.
  4. 배 도데 실 황산나트륨 100 mL로 (SDS)를 용해 완충액 : 1.5 g 트리스베이스, 글리세롤 20 ㎖, 30 ㎖의 H 2 O. 용해 및 HCl로 6.8에 산도를 조정합니다. 40 추가ml의 10 % SDS는 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 25 mg의 브로 모 페놀 블루를 추가합니다.
  5. 스팟 따라 96 웰 플레이트와 라벨 플레이트 세트에서 잘 당 GST-키나제 (14)를 인코딩 (25) NG / μL 포유 동물 발현 플라스미드의 4 μL. 사용할 때까지 -20 ° C에서 인감 및 동결 판.
  6. 형질 전환 1-2 일 전에, CO 2 (최종 5 %)로 보충 된 37 ℃ 배양기에서 배양 HEK293T의 완전한 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 항생 물질의 세포. 트립신과 통로는 주식이 확장시> 80 % 합류가 될 수 없습니다. 6 × 10 7 세포의 최소 화면 (80 % 합류에 HEK293T 세포의 약 3 × 15cm 요리)가 필요합니다.

2. 형질

참고 : 전체 프로토콜의 흐름도는 그림 1을 참조하십시오.

  1. 키나아제 플라스미드를 함유하는 플레이트를 동결 되었으면, 실온에서 해동차 우물의 바닥에서 습기를 수집하기 위해 3 분 동안 1,900 XG에 원심 분리기.
  2. 지질 기반 형질 전환 시약의 312.7 μL와 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM)의 8.6 ml의 혼합. 5 분 동안 앉아 보자.
  3. 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 각 웰에 감소 혈청 매체의 10 μl를 추가합니다.
  4. 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용 단계 2.2에서 감소 된 혈청 배지 / 형질 전환 시약 믹스 잘 당 10 μl를 추가합니다. 20-45 분 동안 앉아 보자.
  5. 전체 80ml의 DMEM에 7.5 × 105 세포 / ml로 재현 탁 293T 세포. 잘 표준 볼륨 카세트 ​​장착 자동 액체 디스펜서를 사용하여 당 세포 현탁액 (즉, 7.5 × 10 4 세포)의 100 μl를 추가합니다.
  6. 균일 한 세포 분포에 대한 현미경으로 우물을 확인하고 24 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.

3. GST-키나제 풀다운

  1. F 확인resh : H 2 O의 540 μL와 0.2 M 나트륨 바나 데이트 60 μl를 혼합하여 4 mM의 pervanadate 솔루션 제 2 튜브 믹스 30 % 과산화수소 2.7 μL와 PBS 1.4 ml 중에. 함께 두 가지 솔루션을 추가하고 사용하기 전에 15 분 동안 앉아 보자.
  2. (이것은 또한 너무 많은 난류를 생성로서 자동화 액체 디스펜서를 사용하지 않는) 단계 3.1에서 제조 pervanadate 2.5 μL,이어서 각 웰에 0.25 M CaCl2를 2 μL 분주 멀티 채널 피펫을 사용. 10 분 동안 37 ℃에서 각각의 판을 품어 후 얼음에 배치합니다.
  3. 제 1 (시약의 제조)에 나타낸 바와 같이 DTT, PMSF, 나트륨 바나 데이트를 첨가하여 용해 완충액 35 mL로 제조.
  4. 얼음에 판을 유지, 각 웰 진공 흡입기를 사용하는 매체를 제거합니다. 즉시 표준 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 50 μL / 웰의 차가운 얼음 용해 버퍼를 추가합니다. 를 Lyse에 얼음에 30 분 앉아 보자 (옵션 : 작은지면을 밀봉하여 여기에 필요한 경우 중지 할 수 있습니다전자 및 -80 ° C에서 저장. 얼음에, 해동 판)을 계속합니다.
  5. 4 ℃에서 3 분 동안 1,900 XG에 스핀 판.
  6. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하는 세포를 긁고 모든 내용을 전송 적절 V 바닥 96 웰 플레이트를 표시합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,900 XG에 스핀 판.
  7. 회전하는 동안, 린스 100 μL / 웰의 (PMSF)없이 차가운 얼음 용해 버퍼와 글루타티온 코팅 된 플레이트 (각 96 웰 플레이트에 대해 하나)를 입력합니다. 얼음에 판을 보관하십시오.
  8. 원심 분리기에서 V-바닥 플레이트를 제거합니다. 한 번에 하나는 종이 타월에 용해 버퍼와 얼룩을 흔들 싱크를 통해 글루타티온 판을 반전. 하단에있는 펠렛을 방해하지에주의하면서 판을 기울 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타티온 판에 V-바닥 판에서 용해 버퍼를 전송합니다. 판 커버와 결합하는 최소 2 시간 동안 얼음에 둡니다.
  9. 2 시간 바인딩 단계의 마지막에 가까운, T을 보장 방사능 워크 스테이션을 준비그는 필요한 안전 조치는 방사성 작업 장소에 있습니다. 30 ° C로 설정 하이브리드 오븐.
  10. 이 단계에서 필요하지 않은 제 1 절 PMSF에 표시된 추가 DTT 나트륨 바나 데이트에 의해 용해 완충액 200 ㎖를 준비합니다.
  11. 용해 버퍼를 흔들 종이 타월에 가릴 수있는 싱크대 글루타티온 플레이트 전환. 헹구고 웰 (PMSF)없이 100 ㎕의 용해 완충액으로 3 배. 진행 할 준비가 될 때까지 세정에 보관 - 우물이 마른 앉게하지 마십시오.
  12. 10 배 주식을 희석하고 표준 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 1X KB의 50 μL 1. 린스 판 한 번 섹션에 표시된대로 DTT를 추가하여 1X 키나제 버퍼 (KB) 55 mL로 준비합니다. 솔루션이 준비가 될 때까지 우물에 1X KB를 남겨주세요 :
    1. 15.9 ml의 최대 530 관심있는 기판의 μg의, 미엘린 염기성 단백질 500 μg의 (MBP), 10 배의 2.65 ml의 KB, 1 M DTT의 13.25 μL, 및 H 2 O 500을 추가하여 솔루션을 준비합니다.
  13. 한 번에 하나씩, 1X KB 린스를 제거 종이 수건에 오점, 바로 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하는 솔루션의 30 μl를 추가 싱크대 위에 접시를 반전. 얼음에 판을 보관하십시오.
  14. 2.5 ml의 10 배 M-ATP, 500 μCi를 감마 (32) P의 ATP, 및 H 2 O에 10 ㎖를 첨가하여 방사능 작업 영역 용액 B를 준비한다.
    1. 잘 배출 힘에 의한 혼합에 도움 리피터 피펫을 사용하여 당 용액 B 20 μl를 추가합니다. 덮고, 30 분 동안 30 ° C의 오븐에서 혼성화 부화.
  15. 30 분 후, 얼음에 다시 접시를 전송합니다. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 2 배 SDS 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 다음 단계로이 시점에서 진행, 또는 편리한 때까지 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장과 번호판을 봉인 할 수 있습니다.

4. 달리기, 염색, 건조 젤

참고 : 모든 작업은 지역 DESIGNA에서 수행되어야한다방사능에 대한 테드.

  1. 하이브리드 오븐의 전원을 켜고 85 ℃로 설정합니다. 실온에서 해동 판. 일단 오븐 오븐 10 분 샘플을 변성하는 동안 배양 온도, 이전 판에 도달했습니다.
  2. 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 반응의 15 μL와로드 26 웰 프리 캐스트 젤은 한 번에 여러 우물을 채우기 위해. 케어는 모든 팁 대응도 전에 샘플을 추가로 정렬 않도록주의해야합니다. 이 비법 인 ATP를 포함로 추적 염료 (파란 선)은 젤의 바닥 떨어져 실행하지 못하게 150 V.에서 젤을 실행합니다.
  3. 젤을 해체하고 메스하거나 영화를 과다하므로 직선을 사용하여 비법 인 ATP (파란 선)을 차단. 라벨이 붙은 용기에 젤을 놓고 15 분 동안 쿠마 얼룩 커버.
  4. 간단히, 쿠마 얼룩을 제거 물 젤을 씻어 및 솔루션을 destain 추가합니다. 젤 Destain 단백질은 명확하게 볼 수 있습니다 때까지. MBP를위한 밴드 및 기판 밴드해야각 샘플에 대한 표시.
  5. 젤을 건조 :
    1. 필터 큰 종이를 잘라 건조기에 놓습니다.
    2. 이 부드러운 때까지 증류수에 셀로판 시트를 적시고 무료 주름, 용지의 상단에 배치.
    3. 젤의 순서를 기록하고, 셀로판 시트의 상단에 젤을 놓습니다. 두 번째 셀로판 시트를 적시고 젤 위에 놓습니다.
    4. 좋은 균일 한 표면에 대한 모든 거품을 (플레이트 밀봉 롤러이 잘 작동) 출시. 플랩을 닫고 진공 켜고 80 ℃에서 3 시간 동안 젤을 건조.
  6. 겔이 건조되면, 신호를 강화하기 위해 스크린을 사용 XAR 필름에 노출. 사란 랩 또는 비닐 봉지와 카세트를 감싸고 서리을 유지하기 위해 테이프로 밀봉. -80 ° C 하룻밤에 카세트를 저장합니다.

5. XAR 필름 개발

  1. 다음 날, 냉장고에서 카세트를 제거하고 실온에서 해동을 할 수 있습니다. 의 필름 개발암실은 제조자의 지시에 따른 필름을 사용하여 프로세서.
    참고 : 키나제 기판 쌍의 증거에 대한 영화를 검사합니다. 두 번째 이상 노출도 약한 인산화 이벤트를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다.

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Results

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화면에서 대표적인 결과는도 2에 도시되어있다. 180 키나아제는 CRTC2뿐만 아니라 고전 키나아제 검정 기질 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로부터 AA 2백68부터 2백83까지 대응 GST 표지 된 펩티드 기질을 사용하여 스크리닝 하였다. 단 두 키나제, MARK2와 매우 관련 키나아제 MARK3는 CRTC2 펩타이드를 인산화. 그것은 많은 phosphorylatable 잔류 물을 포함하고 젤의 아래쪽으로, 18 kDa의에서 실행되는 MBP, 모든 분석에서 내부 통제 포함되어 있습니다. 이 특이성의 해석을 허용 : 일부 키나제는 견고 기판과 MBP를 인산화합니다. 여기에 참고로하여 항상 분석에서 배경 인산화가, (노 키나제 컨트롤 IE) 혼자 GST가 포함 된 우물은 항상 어떤 내인성 키나제 활성을 정화한다는 것입니다. 이 기판의 인산화가 진짜임을 배제하지 않지만, 그것은 이하 선택적 일 수있다 키나아제 설정 체외에서 그 제안 않는다.그것은 키나제 - 기질 특이성...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

14,15 접근법을 설명 원래 공보 이후, 180 GST-키나제의 원래 라이브러리는 인간 단백질 kinome 420 부재, 또는 ~ 80 %로 확대되었다. 확장 된 라이브러리와 같은 설명 프로토콜 (필요하다고 인정하는) phosphorimaging 및 디지털 신호 향상의 사용에 의해 단축 될 수있는 필름을 개발 4~5일 다음 1~4일 걸립니다. 주의를 기울여야합니다 몇 가지 주요 단계 (프로토콜의 개요를 그림 1 참조)이 있습니다. 우선, 세포의 콘텐츠의 상태이다 (마이코 플라스마 무료, 팽창 중에 합류에 도달 할 수 없다, 각 통로에서 트립신) 배치 팽창 단계 동안 및 트랜시의 96 웰 플레이트에서. 형질 장소 (단계 1.5)를 취한다 때 세포는 균일 시드, 그리고 80 %의 합류해야한다.

둘째로, 그것은 볼륨 TRANSF을 최소화 자동화 액체 분배기를 사용하는 형질 감염 동안 적합ER 오류, 따라서 웰 사이의 변동 계수 (...

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 NSERC 부여에 의해 지원되었다 386634. 우리는 도움이 토론 Screaton 연구소의 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
용해 완충액내에서프로토콜 단계 1.1
10x 키나아제 완충액사내에서프로토콜 단계 1.2
참조 10x M-ATP사내에서프로토콜 단계 1.3
인간 키나아제 플라스미드Orfeome, Invitrogen, OrigeneGST 태그 하우스
96 웰 플레이트Fisher ScientificCS003595참조
293T 세포ATCCCRL-11268
DMEMFisher ScientificSH3002201100  보충제; U/ml 페니실린, 100  μ g/ml 스트렙토마이신, 10% 태아 송아지 혈청.
CO2 인큐베이터SanyoMCO-17AIC
15cm 세포 배양 접시Fisher Scientific877224
환원 혈청 배지Invitrogen22600-050
지질 기반 형질 주입 시약Invitrogen11668-019
자동 액체 분주기Thermo Scientific5840300
소형 카세트 부착Thermo Scientific24073295
표준 카세트 부착Thermo Scientific
4 mM pervanadate사내에서단계 3.1
0.25 M CaCl2사내
멀티채널 피펫 (20-200 μ l)Labnetp4812-200
멀티채널 피펫 (1-10 μ l)Thermo Scientific4661040
V-bottom 6-well platesEvergreen Scientific290-8116-01V
글루타티온 코팅 96-웰 플레이트Fisher ScientificPI-15240
혼성화 오븐Biostad350355
GST 태그 기질사내
미엘린 염기성 단백질(MBP)SigmaM1891
리피터 피펫 (1 ml)Eppendorf22266209
32P 감마-ATPPerkin ElmerBLU502Z500UC
2x SDS 용해 버퍼 (100  ml)집에서프로토콜 단계 1.4
참조 26-웰 프리캐스트 TGX 겔BioRad567-1045겔 필요한 비율은 관심 기질의 분자량에 따라 달라집니다
쿠마시 염색집에서0.1% 쿠마시 R250, 10% 아세트산, 40% 메탄올
쿠마시 염색집에서10% 아세트산, 20% 메탄올
라벨이 붙은 젤 용기집에서빈 팁 상자에서 나온 플라스틱 뚜껑을 사용했으며, 젤 Whatman 여과지 하나를 담을 수 있을 만큼 큰
Fisher Scientific57144
셀로판 시트 (2)BioRad165-0963
젤 건조기Labconco 4330150
이중 에멀젼 자가방사선 촬영 필름VWRIB1651454
필름 카세트Fisher ScientificFBAC-1417
강화 스크린Fisher ScientificFBIS-1417
플레이트 씰링 고무 롤러SigmaR1275
사 제작 제작 제조 물 물 14072670 제작 프로토콜 제작제작 제작 제조 제조 만든 크기입니다

References

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