Described는 부착 세포와 미세 구조 기질 사이의 기계적 상호 작용을 정량화하기 위한 프로토콜입니다. 이러한 상호 작용은 이동, 증식, 분화 및 세포사멸을 포함한 필수 세포 행동과 밀접하게 연결되어 있습니다. 이 프로토콜은 MechProfiler라는 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 제공하며, 이를 통해 각 마이크로포스트에 관련된 힘을 결정할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
유연한 마이크로포스트가 통합된 세포 배양 기질을 통해 사용자는 세포와 주변 환경 간의 기계적 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 특히, 세포-기질 상호 작용이 주요 관심사입니다. 오늘날 마이크로포스트 어레이는 지난 10년 동안 발표된 광범위한 응용 분야에서 잘 특성화되고 확립된 방법입니다. 그러나 생물학자들 사이에서는 마이크로포스트 제조의 길고 까다로운 과정과 마이크로포스트와 상호 작용하는 세포의 이미지를 분석하기 위해 쉽게 접근할 수 있는 소프트웨어가 없기 때문에 이 기술을 적용하는 데 유보적인 것 같습니다.
마이크로포스트에서 포스 판독은 놀라울 정도로 쉽습니다. 마이크로포스트는 세포가 끝에 이상적으로 부착된 스프링과 같은 역할을 합니다. 크기에 따라 세포는 하나 또는 여러 개의 초점 접착점을 통해 세포골격에서 미시포스트로 힘을 가하여 미시포스트를 편향시킵니다. 처짐의 양은 방향과 크기에서 적용된 힘과 직접적인 관련이 있습니다. 세포가 덮고 있는 micropost의 수와 post deflection pattern은 특징적이며, post당 force와 같은 값과 세포 표현형의 "mechano-profiling"을 가능하게 하는 많은 생물학적으로 관련된 매개변수를 결정할 수 있습니다.
메카노 프로파일링을 위한 편리한 방법은 바로 사용할 수 있는 상용 마이크로포스트의 1세대와 현재 모든 연구자가 액세스할 수 있는 자체 개발 소프트웨어 패키지를 결합한 것입니다. 일반적인 응용 분야의 시연으로, 전이된 세포주 모델의 기계 프로파일링을 위해 명시야 현미경에서 골암 세포의 단일 이미지를 촬영했습니다. 이러한 상용 견인력 센서와 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어의 결합을 통해 비전문가 사용자가 수행하는 일상적인 실험실 작업에 마이크로포스트 어레이 기술을 처음으로 신속하게 구현할 수 있습니다. 또한 강력하고 간소화된 분석 프로세스를 통해 사용자는 매우 시간 효율적인 방식으로 많은 수의 마이크로포스트 이미지를 분석할 수 있습니다.
서론
- 기계에 민감한 세포 기반 분석은 역학 세포 생물학에서 재생할 수있는 중심적인 역할을 반영하는 다양한 애플리케이션으로, 부착 세포를 조사 할 수 있습니다. 이 애플리케이션은 세포 내 프로세스 또는 전체 셀 동작을 구동하는 기본 메커니즘에 초점을 맞추고있다. 한편, 예컨대 세포 외 매트릭스 조성물 또는 매트릭스 강성 같은 외부 환경 요인 극적 셀의 기계적 및 생물학적 반응에 영향을 미칠 수있다. (1) 같은 약학 적 활성 화합물의 많은 클래스의 사용 후에 관측 될 수 있고, 효과가있는 아르 종종 세포 배양 모델을 이용하여 특징으로한다. (2) 등의 골격 구조 및 기능의 변화와 관련된 세포 표현형으로 표시 변경을 유도 할 수 자발 또는 실험적으로 유도 된 유전자 돌연변이에 의한 것과 같은 다른 한편 유전자형 특성에서. (3)이 예는 많은 수의 몇 가지주제에있는 세포의 기계적 표현형 관련이며,이 모든 유용하게 micropost 배열로 조사되었다.
이 글을 쓰는 시점에서, 약 200 기사 세포 micropost 상호 작용을 설명하는 발표되었다. 이 작품은 micropost 편향 원칙의 이론적 인 측면뿐만 아니라 제조에 실제적인 지침을 설명합니다. 세포와 유연한 micropost 배열의 상호 작용을 설명하는 첫 번째 기사는 연속 부드러운 기판을 탄 등 nanonewton 규모의 세포 수축력을 추정하는 데 사용되는 고전적인 견인 힘 현미경 (TFM)과는 대조적으로 2003 년 4 탄 및 동료에 의해 출판되었다. 실리콘 엘라스토머로 이루어지는 다수의 근접하게 이격 된 수직 빔을 사용하는 방법을 설명했다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 주요 기능에서 등장. 유지하면서 제 휴대 명백 기판의 강성을 변경하기 위해 하나의 유일한 micropost 치수를 변경해야달리 일정하므로, 표면 토폴로지 및 화학의 차이를 피하는 기판 조성물. 둘째 microposts는 이산 개별 초점 유착 정도의 힘과 공간 해상도로 분석 할 수 있습니다 및 표준 TFM에 의해 유사한 분석에 고유 한 분석 문제를 줄일 수있는 개별 스프링과 같은 역할을합니다.
오늘 micropost 배열에 대한 응용 프로그램의 범위는 크게 몇 하나의 셀에 대한 힘의 단지 매핑을 초과합니다. 예를 들어, 아키야마는 곤충 근육 탑재 자율 마이크로 로봇을 개발하기 위해서는, micropost 어레이 액츄에이터 방 애벌레로부터 격리 등쪽 혈관 조직의 사용을보고한다. (5)
그러나 microposts 대부분의 게시 된 응용 프로그램은 감염이나 암과 같은 질환의 연구에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, micropost 어레이는 나이 세리아 gonorrh 번들의 타입 IV의 필리의 구동력 발생을 연구하기 위해 사용되어왔다. 신호 캐스케이드 감염 향상과 연관된 6 기타 세포 골격 타겟팅 약학 화합물로 처리 유방암 세포를 연구 microposts를 사용한 콜로니 OEA. 7
micropost 편향 종종 셀을 가정 단부 하중 고전 캔틸레버 빔 이론을 이용하여 설명하는 매우 micropost의 선단에 부착. 편향 δ 원인이 여기에 적용되는 힘 (F)은 micropost의 "휨 강성"K에 의존에 의해 계산된다 :
(1)
E, I, L 및 인 영률 각각 관성 빔 길이의 면적 모멘트. 기판 휨이 교류로 촬영되지 않습니다 그러나,이 방정식의 결과는 빔 전단 이후 작업뿐만 아니라 굴곡의 힘의 근사치를 제공카운트. microposts 전형적 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)와 같은 부드러운 재료로 제조되는 것을 고려할 때 이러한 요소가 포함될 필요가 실리콘 고무 기반. . Schoen 외는 micropost (L / D) 및 해당 중합체의 포아송 비 (V)의 종횡비에 기초하여 이러한 교정 인자가 있다는 것을 증명 8 그것은로 주어진다. :
(2)
T 기울기는 (V) 동일한 문서에서 발견 될 수있는 피팅 파라미터 = 1.3를 포함 틸팅 계수되면서 :
(3)
즉 micropost 보정의 강성 K CORR은 순수한 굽힘 강성 K = K 벤드의 생성물 및 보정 계수 CORR 의미주어진:
(4)
따라서, 셀 력 계산 이제 판독 식 (1)의보다 정교한 변형을 사용하여 수행한다 :
(5)
보정의 영향은 즉시 micropost 치수에 대한 일반적인 값을 사용으로 더 분명해진다. 예를 들면, 원형 단면과 PDMS 계 실리콘 고무로 만들어진 5 ㎛의 직경 15 마이크론 길이 micropost는 0.77의 보정 계수에 이르게하기 때문에 보정 전 계산은 23 %가 소비 된 전지의 힘을 과대 평가한다. 이것은 훨씬 더 심각한 작은 종횡비 microposts에 대한된다.
전통적으로, micropost 이미지 분석은 이상적인 빔 굽힘 이론에 근거하고있다. 2005 년 MICR의 사용을 개척 한 그룹opost 어레이 micropost 분석에 적합한 이미지 분석 소프트웨어를 발표 9 소프트웨어는 소프트웨어 라이센스가 필요하고 사용자가 각각의 위치에 대한 세 개의 이미지를 취한다.; 전송 모드와 스테인드 세포에 형광 모드에서 또 하나의 micropost의 상단과 하단면에서 한 각. 각각의 상부 및 하부 위치를 비교 한 후 소프트웨어가 힘 벡터 필드를 결정하고, 포스트 당 힘과 같은 관련 파라미터를 계산 micropost. 기타 소프트웨어 패키지는 존재와 그 분석의 원칙은 간단하게 그들을 설명하는 해당 기사에 언급되어 있지만, 이러한 분석 소프트웨어 패키지는 일반적으로 공개적으로 사용할 수 없습니다. (10, 11)
셀 매핑 힘을 위해 설계 micropost 어레이는 모든 이웃 microposts 사이의 등거리 간격 장점이 후자의 직교 micropost 레이아웃 또는 육각형 하나에 되로 분류 될 수있다. 일반적인 microposts 하원형 단면을 적이 그들의 사이즈 타원 또는 사각형 단면 microposts 또한보고되었다 그러나, 길이가 50 ㎛ 인 내지 1.0 μm의 직경이 10 ㎛ 내지 2. (4)를 배열한다. 12,13
micropost 재료로서 PDMS 기반 실리콘의 혼합물의 혼합물을 사용하는 나노 입자를 추가로 허용한다. 코발트 나노로드를 추가 예를 들어 micropost의 자기 활성화를 가능하게하고, 따라서 잠재적 인 실험 디자인에 자유의 또 다른 학위를 제공합니다. 14 대부분의 그룹은 커버 유리와 같은 또는 페트리 접시 내부 평면 딱딱한 기판 상에 자신의 micropost 배열을 생산하고 있습니다. 그러나 맨과 동료들은 최근에 신축 막에 형성된 micropost 배열을보고했다. 15 세포 수축성의 관점에서 라이브 셀 세포 내 동적 응답을 공부하는 동안이 부착 세포에 세포 스트레칭 힘의 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
널리 사용되는 가장 맛 음료SU8 포토 레지스트를 이용하여 실리콘 웨이퍼 위에 마이크로 구조를 생성하는 데 사용되는 간단한 표준 클린 룸 공정에서 Sniadecki 동료. 16-18의 통찰력 프로토콜에 기재된 바와 같이 micropost 어레이 제작 오리스 공정은 소프트 리소그래피에 기초한다. 이것은 실리콘 고무 몰드로 이송 구조 위에 캐스팅 된 상기 복사 프로세스가 이어진다. 제 2 단계에서, 이들 몰드 선택된 기판 위에 실리콘 고무를 사용하여 초기 미세 구조를 복제하기 위해 사용된다. 그러나 microposts위한 제조 공정을 확립 그들의 애플리케이션과 관련된 서적의 큰 증가에도 불구하고 마이크로 공학 전문가에도 상당한 시간이 소요; 허용 가능한 품질 레벨을 산출하기 위해 특정 테스트 환경과 micropost 레이아웃 최적화 및 적응을 필요로하는 많은 공정 단계가있다.
상업 micropost 배열은 준비-T에 사용할 수 있습니다지속적으로 높은 품질의 오 사용 ( "기성") 형식입니다. 따라서 그들은 현장 생산에 필요한 복잡하고 긴 제조 공정에 대한 대안이다. 이 논문에서 시판 micropost 어레이는 단일 시야 현미경 이미지를 사용하여 셀룰러 힘을 매핑하는데 사용 하였다. 더 중요한이 문서에서는이 원고에 대한 보충 자료 등을 다운로드 할 수 있습니다 MechProfiler라는 이름의 완전한 기능을 오픈 소스 소프트웨어를 설명합니다. 소프트웨어 적극적 유지 버전도 http://www.orthobiomech.ethz.ch에서 찾을 수있다.
"기성품"분석과 호환 오픈 소스 분석 소프트웨어의 조합은 현저히 TFM 정확한 실험을 달성하기 엔트리 장애물을 낮춘다. 클린 룸 시설이나 소프트웨어 개발 전문 중 하나에 대한 액세스 권한이없는 연구원은 성공적으로 세포의 힘을 분석 할 수 있습니다. 이 메케에 초점을 사용자로 하여금ensitivity 분석 출력보다는 기술 자체, 및 더 넓은 지역에 사용할 견인력을 측정한다. 또한, 이것은 micropost 어레이 전자동 스크리닝 향해 방법을 포장하는 중요한 단계이다.
MechProfiler 분석 소프트웨어는 파일 형식 TIFF, PNG, BMP와 JPG의 이미지를 처리합니다. 이미지는 형광, 위상차 또는 밝은 장광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 독립 실행 형 프로그램은 (이용 가능한 그림 12) 무료 matlab에 컴파일러 런타임과 함께 실행하고 기본 알고리즘은 약 1 분에 하나 또는 여러 개의 세포와 이미지를 처리하는 사용자 수 있도록 효율적인 이미지 처리를 위해 수 있습니다. 또한, 이들 세포 중 살아있는되거나 "고정".
MechProfiler 소프트웨어 크게 상업용 품질 micropost 어레이의 재현성에 의존하여 데이터 분석 처리량을 증가시킬 수있다, 구체적으로는, 기본 및 #8220은 비 - 편향 "배열의 각 포스트의 위치가 이상적 그리드에 대해 추정 될 수있다 (본 연구에 사용 된 배열에서 그리드 제조 편차를 100nm 이하였다).
단 하나의 관심 영역에 작물, 분석 용 이미지 파일의 선택이 열리면 세포에 의해 덮여 게시물을 정의되거나 또는 폐기해야하는 사후 위치를 결정하고, 편향 / 이상적 그리드에 대해 힘을 산출하고, 최종적으로 표준 Office 스프레드 시트에 포함, 수출 가능성을 가진 모든 세포 관련 데이터를 저장합니다.
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프로토콜
Micropost 배열 1. 배양 세포
참고 : 모든 단계는 불임을 보장하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. 여기에 지정된 볼륨은 T25 세포 배양 플라스크에 대한 것입니다. 세포 배양 배지 및 세포 레시피 파종 밀도 골암 세포주 HuO9 및 M132에 최적화되어있다.
- micropost 배열에 파종을위한 세포 배양을 준비합니다.
- 표준 광학 현미경에 배양 플라스크를 배치하여 세포 배양 품질을 검사한다. 세포가 덮여 얼마나 많은 문화 플라스크 바닥의 추정에 의한 전형적인 성장과 형태를 보여 있는지 확인합니다. 70 % -80 %의 범위는 건강한 성장 속도를 반영한다. 그들은 죽은 세포 및 / 또는 자란 문화를 대표로 세포를 부동의 양에주의를 기울이십시오.
- 4 ㎖의 1X 인산염과 중간 및 세척을 제거하여 세포를 Trypsinize은 식염수 (PBS) 버퍼를 버퍼. 셀 때까지 실온에서 0.8 ㎖의 1X 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 첨가하고, 배양약 2-4 분 소요 S를시키다. 현미경으로 프로세스를 확인하고 가끔 빠지을 지원하기 위해 조심스럽게 플라스크를 누릅니다.
- 5 ml의 세포 배양 배지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS와 / F12), 1 % 페니실린 / 스트렙 (PEN / 패 혈성)) 반응을 정지하고 가만히 잔여 세포를 씻어을 추가 플라스크의 바닥에. 그 후 균일 한 혼합물을 얻기 위해 상하 수회 현탁액을 피펫. 효과적인 빠지을 얻기 위해 플라스크의 원래의 성장 영역에서 모든 솔루션을 피펫해야합니다.
- 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 3 분 동안 0.5 XG에서 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 원심 분리.
- 상층 액을 제거하고 최대 피펫 팅에 의해 5 배 아래로 5 ml의 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 그렇게하는 동안 거품의 발생을 방지해야합니다.
- 셀 카운팅 챔버와 microsco 광을 사용하여 세포 농도를 결정PE. 세포 집합체에 대한 세포 계수 챔버에서 세포 현탁액을 확인하고 다음 실험을 위해 단지 하나의 세포를 가지고 확인합니다. 피펫은 세포를 분리 집계를 형성하기 위해 다시 여러 번 아래로 경향합니다.
- 25,000 세포 / ml의 세포 용액을 얻기 위해 충분한 배지로 세포 현탁액을 희석. 밀폐 튜브를 수회 반전시킴으로써 잘 섞는다.
- 세포 파종을위한 micropost 배열을 준비합니다.
중요 참고 :이 잠재적 microposts를 손상시킬 수있는 직접적으로 불필요한 거품이 소개되어 특히, micropost 배열에 피펫하지 마십시오. 또한, micropost 배열이 결코 모세관 힘이 microposts의 붕괴로 이어질 발생하는 것으로 밖으로 건조하지 있는지 확인하십시오.- 핀셋을 사용하여 12- 웰 플레이트의 웰에 직면하고 1 ㎖의 에탄올 (99 %)을 첨가하여 습윤 micropost 어레이 부착 유리 기판을 배치했다. 20 ~ 30 초 동안 실온에서 품어.
- 에탄올을 희석잘 측에 약 1 ㎖의 멸균 탈 이온수 (DI 물)을 첨가하고 전사 피펫 또는 흡인 장치를 사용하여 약 1ml의 흡입에 의해 단계적. 이 단계에서 적어도 3 번 반복합니다.
- 추가하고 약 1 ml의 흡입에 의해 같은 방식으로 PBS 버퍼와 DI-물을 교체합니다. 이 단계를 3 번 반복합니다.
- 추가하고 약 매체의 1 ml의 흡입에 의해 매체와 PBS 버퍼를 교체합니다. 이 단계를 3 번 반복합니다.
- 각 준비 micropost 배열의 상단에 피펫 1 ml의 세포 용액 (25,000 세포). 멀티 웰 플레이트 닫고 인큐베이터로 전송 (CO 2 5 %, 37 ° C). 세포 부착 및 6 -7 시간 동안 microposts 위에 성장 보자.
- 가벼운 현미경을 사용하여 때때로 접착 공정을 검사합니다. 세포의 대부분은 여러 microposts에 걸쳐 퍼져 나타납니다 있는지 확인합니다.
2. 고정 및 염색 세포
참고 : 모든 단계를하고여기에 주어진 볼륨은 12 웰 플레이트의 단일 잘위한 것입니다. 그것은 microposts의 붕괴가 발생합니다 액체의 흡인 후 우물에서 건조를 방지하기 위해 한 번에하지 더 열두 우물의 네 이상을 처리하는 것이 좋습니다.
- 우물에서 대기음 매체와 세척 세포를 1 ml의 PBS 버퍼로 2 배. 배양 동안 micropost 배열에 축적 된 세포 파편을 제거하고 죽은 세포를 분리 PBS로 세척하는 동안 부드러운 힘을 적용해야합니다.
- 5 분 동안 0.5 ml의 3.7 % 완충 포르말린 용액으로 세포를 고정한다.
- 1 ml의 멸균 탈 이온수와 micropost 배열 배를 세척하여 포름 알데히드 용액을 교체합니다.
- 약 90 초 동안 (50 % 물, 40 % 에탄올 및 10 % 아세트산 0.05 % 쿠마시 브릴리언트 블루)와 색소 세포를 염색. 1 ml의 멸균 탈 이온수로 2 배 오프 초과 염색 액을 씻으십시오. 배열을 micropost 1 ml의 탈 이온수를 추가합니다.
- 광학 현미경을 사용하여 염색 결과를 확인한다. 반복 T세포체가 가시화 되기에는 너무 희미 경우 그 단계를 염색.
- 4 ° C에서 냉장고에 상단에 염색 된 세포에 저장 micropost 배열. 항상 물 속에서 그들을 유지하기 위해 확인합니다.
3. 세포 이미징
참고 : 4 단계는 무한 보정 광학없이 현미경에 적용됩니다.
- 고해상도 이미징을위한 얇은 유리 바닥 페트리 접시에 2 ml의 디 - 물을 추가합니다.
- microposts면이 위를 향하도록하여 영상 접시에 핀셋을 사용하여 micropost 배열을 전송합니다.
- 광학 현미경의 이동 무대에 영상 페트리 접시를 놓습니다.
- 스케일 수가 유리 기판, 실리콘 엘라스토머와 위에 액체의 굴절률 부정합을 보상하기 위해, 광 경로를 따른 모든 재료의 전체 두께를 나타낸다까지 촬상에 사용 렌즈의 보정 링을 돌려. 이 microposts의 밝은 모습으로 이어질한다코어.
- 다운 50 %, 조명 측에 조리개를 닫고 일반 명 시야 모드 활성화 광로에서 어떠한 위상차 링을 제거한다.
- microposts가 관찰 들판을 가로 질러 수평 라인을 형성 micropost 배열을 맞 춥니 다. 시작점 (예를 들어, 왼쪽 상단)을 정의하고 다수의 이미지를 복용하는 동안 micropost 배열을 스캔 스테이지에서 페트리 접시 단계적으로 이동합니다.
- 20 배 또는 40 배 목표를 사용하여 카메라의 최고 해상도 설정으로 모든 이미지를 가져 가라. 이미지의 중심에서 단일 세포를 목표로.
- micropost 팁에 초점이 될 때까지 기판을 통해 Z 축을 따라 스윕. 현미경의 미세 조정 초점 휠을 사용하여 약 2 ~ 3 μm의에 대한 micropost 바닥에 초점을 향해 돌립니다.
- (한 번에 하나의 촬상 파라미터 휩쓸고 하나의 어레이 부분의 테스트 이미지의 시리즈를 취함으로써 표준 촬상 확립 수순 예, 노출 시간,조리개 설정, 램프 설정 등). MechProfiler 이미지를 분석하고 빠르고 신뢰성있는 분석을위한 적절한 매개 변수 세트를 결정합니다.
오픈 소스 소프트웨어 "MechProfiler"4. 이미지 분석
주 : 모든 소프트웨어 기능은 마우스 왼쪽 버튼을 이용하여 포인팅 디바이스로 활성화 될 수있다. 그러나, 숙련 된 작업자가 양손 효율적인 이미지 처리를 가능하게하는 키보드의 좌측 절반으로 설계 문서화 단축 키를 사용한다.
- 이미지 분석 소프트웨어 MechProfiler를 시작하고 "열기"를 클릭하여 분석 할 필요가 이미지의 범위를 엽니 다.
- 소프트웨어 개발자에 의해 주어진 "설정"섹션에 모든 매개 변수를 삽입합니다. 맞춤형 소프트웨어 매뉴얼 상세히 기재된 절차에 따라서 (즉, 형상 및 최소 임계 거리)를 구성해야 파라미터를 결정.
- 이미지 분석의 - 한 - "자르기"를 사용하여 관심 영역에 자르기로 (클릭하고 마우스 버튼으로 드래그 누름). 그려진 사각형 안에 두 번 클릭하여이 작업을 완료합니다.
- "세포 윤곽을 그리기"및 셀에 연결된 모든 microposts을 포함하여 도면에 대한 십자 커서를 사용을 클릭하여 각각의 눈에 보이는 세포 개요 하나씩을 표시.
- "취소 게시물"을 클릭하여 원치 않는 microposts을 취소하고 그리기 십자 커서를 사용합니다. 이미지 섹션 외부의 셀에 속하거나 그 어떤 다른 이유가 아니라 관심의 세포에 의해 편향되는 모든 microposts을 묶습니다.
- 소프트웨어 서브 루틴 마우스 클릭하여 "무게 중심 찾기"를 시작합니다. 바로 옆에 자신의 중앙에 붉은 십자가가 눈에 보이는 모든 microposts가 등록 될 때까지 "무게 중심 찾기"버튼에 필터 설정을 조정합니다. 필터 설정이 너무 경우가 너무 높은 경우, MU 낮은 microposts은 무시 될 것이다ltiple 위치는 하나의 micropost에 대해 표시됩니다. 분석 세션 동안 일정하게 설정 필터를 유지합니다.
- 여러되거나 누락 micropost 위치와 무게 중심의 매뉴얼 편집 기능 "수동 편집"를 사용합니다. 클릭을 가로 질러 드래그하여 문제의 micropost을 선택하려면 마우스 크로스 헤어를 사용합니다. 사각형 내부를 두 번 클릭하고 자동으로 닫힙니다 확대 된 이미지 섹션에서 누락 된 빨간색 마커를 배치합니다. 이 그린 셀 개요를 벗어나면 이러한 micropost 폐기 진행하기 전에 (단계 4.5 참조).
- 마우스 클릭으로 "그리드 생성"기능을 활성화하여 이상적인 micropost 그리드를 찾아보십시오. 위치 그린 셀 내부 윤곽선 블루 링으로 도시 진정한 micropost 헤드, 대응 확인.
- 마우스 클릭으로 해당 "마누엘 편집"기능을 사용하여 필요한 셀 영역 내부에 잘못 그리드 메이커를 수정합니다. 한때의 micropost을 선택 십자선을 사용하여클릭을 가로 질러 드래그하여 estion. 나타나는 사각형 내부를 두 번 클릭하고 자동으로 닫힙니다 확대 된 이미지 섹션에서 누락 된 파란색 마커를 배치합니다.
- micropost의 화상 부 내측 위치 및 생성 된 이상적 그리드 간의 차이에 기초하여 계산 된 편차 값들의 히스토그램을 얻기 위해 마우스 버튼을 클릭하여 "계산 처짐"를 사용.
- "저장"에 마우스를 클릭하여 값의 테이블을 포함한 완전한 분석을 저장합니다.
- "보기 재설정"편리 오른쪽 키보드 커서 키를 사용하여 수행 할 수 있습니다 "다음 이미지"에 다른 이미지 섹션 또는 마우스 클릭을 분석 클릭하거나 이미지 분석을 계속합니다.
5. 데이터 분석 - Mechanoprofiling
- 분석 된 이미지가있는 폴더에서 오피스 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 파일 "results.xls"를 엽니 다. 그것은 알루미늄과 데이터를 포함분석 된 셀의 모든 micropost의 처짐 및 작업 (즉, 기판의 변형 에너지)와 같은 표준 파생 조치를 포함하여 L 계산 된 값.
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결과
설명 된 기술의 주요 장점은 일상적인 실험실 작업에 신속하고 효율적인 통합을위한 단순하고 잠재력에있다. 오픈 소스 소프트웨어와 결합 고품질 상용 센서 어레이의 조합하고자 달리 이미지 분석 소프트웨어 개발의 지식 크린룸 시설 및 심층 액세스해야 - 기계 감도에 대한 정보를 제공한다. (1)가 제공 방법의 흐름을 도시한다. 그것은 micropost 배열에 세포를 준비 시드로 시작합니다. 세포를 고정하고 염색 후 micropost 어레이는 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 기술의 중앙부는 MechProfiler 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석이다. 사용자는 즉시 GUI의 "설정"에 관련된 모든 매개 변수를 입력 한 후 이미지를 analyszng 시작할 수 있습니다. 대응하는 픽셀의 크기는 단일 픽셀로 표현하고, 사용자의 설정에 따라 결정되는 길이이다. 그것은 필요알려진 크기와 물체의 이미지를 고려하여 각각의 사용 확대에 대해 개별적으로 설정할 수 있습니...
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토론
이 작품은 실질적으로 진입 기술 및 실제적인 장벽을 낮춤으로써 견인 힘 현미경 분야의 발전을 추구한다. 이 장벽은 양측에서 온다. 가장 먼저 재현성 제조 및 실험적 micropost 배열을 의뢰하기 위해 극복해야 할 많은 비 사소한 기술적 문제가 있습니다. 전형적인 실험이 수백 또는 세포의 수천의 분석이 필요할 수 있습니다 염두에두고 - 둘째, 마찬가지로 적지 않은 단일 셀 힘의 신뢰할 수있는 반자동 분석이 필요하다. 전술 한 기술은 주민 엔지니어링 전문 지식이없는 세포 생물학 실험실 내에서 micropost 기반 견인 힘 현미경에 액세스 할 수 있도록하기 위해 개발되었습니다. 이 문서에 제시된 센서 및 분석 기술은 비전문가가 쉽게 정확하게 하나의 세포에 의해 가해지는 힘을 분석 할 수 있어야합니다.
그렇다 세포 생물학 (L)에 액세스로부터적어도 중급 밝은 필드 현미경 AB는 설명 방법은 몇 가지 추가 기술적 인 요소가 필요합니다. 여기에 대부분의 사용자는 기술의...
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공개 사항
수석 저자(NG)는 이 연구에 사용된 마이크로포스트 어레이의 상업적 공급업체인 MicroDuits GmbH의 공동 창립자입니다. 다른 저자는 이 작업과 잠재적인 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 CTI(Committee Technology and Innovation) 스위스 보조금 14796-PFLS-LSCTI의 지원을 받았습니다. MicroPost 어레이는 MicroDuits GmbH에서 아낌없이 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| T25 세포 배양 플라스크 | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml 원심분리기 바이알 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 콜라겐 I/피브로넥틴 | MicroDuits | MPA-col1/FN | 포스트 어레이 마이크로포스트 치수: Ø=6.4 &마이크로; m, l=18.2 &마이크로; m; 그리드=13 &마이크로; m, kcorr=2.87 nN/&마이크로; m |
| 에탄올 abs PA | Merck | 100.983 | |
| 12웰 플레이트 | Nunc | 150628 | |
| 포르말린 용액, 중성 완충 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| 메탄올 ACS PA | Merck | 1.06009 | |
| 아세트산 | 시그마 | 695092 | |
| 유리 바닥 접시 | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm 직경, 조리개 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | 해당 없음 | 도립 현미경 |
| D3-L3 | Nikon | 해당 없음 | 카메라 컨트롤러 |
| DS Fi2 | Nikon | 카메라 |
참고문헌
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