3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

Summary

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

Abstract

이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.

Introduction

미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음^1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸⁴ 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP⁵,⁶시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.

정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마)....

Protocol

피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성.

1. 형광 Immunohistochemistry

1. intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준비 펀치 생 검:
   1. 수행 3mm 피부 biopsies 의료 여 직원을 1.5에서 전체 생 장소 mL 잠 ' s 통 솔루션 (2 %paraformaldehyde, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4에에서 0.3% 포화 picric 산) 4 ° C 하룻밤에.
   2. 16-24 h 또는 샘플 싱크 때까지 4 ° C에서 30% 자당의 솔루션 샘플 PBS에 린스.
   3. 최적의 절삭 온도에 소스 샘플 화합물 (10 월)는 cryomold를 사용 하 여. 금형에서 아래로 향하게 하는 표 피와 전체 3mm 생을 놓고 약 2 mL 10 월 동결 건조 얼음에 형의 몰드를 채울 합니다. 저장소 사용 하 여 준비까지-80 ° C에.

Results

시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화

형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루션의 12 단계를 통해 처리 될 8 섹션까지 보여준다. 무료-부동 메서드 플랫 로커와 부드러운 동요와 결합 항 체 양쪽에서 섹션 침투에 대 한 충분 한 액세스는 보장 합니다. 프로토콜 기본 및 보조는 항 체 4 ° C에서 지속적으로 신경 및 미토 콘 드리 아를 라벨에 하룻밤 외피 때문에 크게는 완료, 3 일이 걸린다.

Discussion

이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구^44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및 3D 분석에 필요한 50 µ m 섹션에 걸쳐 이미지 수집을 극대화 하기 위해 조직에 항 체의 침투에 대 한 수 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 이미지 수집 매개 변수를 측정 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 해상도 유지 하면서 이미지 당 충분 한 신경을 캡처 사이 균형 이다. 조직 섹션에 사용 하 고 표준 피부 생 검 프로토콜은 약 3 m m 긴^45,,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Zamboni's Fixative	Newcomer Supply, 위스콘신주 미들턴	1459A	2% 파라포름알데히드, 0.2% 포화 피크르산 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4
10x 인산염 완충 식염수(PBS)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP399-4	1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	I36933	비특이적 결합을 줄여 Alexa Fluor 염료 신호를 향상시킵니다
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)	Proteintech Group Inc. Rosemont, IL	14730-1-AP	PGP9.5로 약칭되며 단종된 AbD Serotec(Cat. No. 7863-0504) 항체
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)	abcam, Cambridge, MA	ab110333	약칭
PDH Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11034	red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11032	녹색 형광 접합 2차 항체
알부민, Bovine Serum	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A7906-100	BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T9284	TX-100
0.22 µ로 약칭; m 필터	EMD Millipore, Billerica MA	MILLEX GP SLGP 033NS	0.22 &마이크로; m Millipore 필터
Parafilm M	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	13-374-10	Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-032092	Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate	Corning Incorporated, Corning, NY	3603	96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	P-36931	핵의 DAPI 염색
현미경 커버 유리 50 x 24 mm	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-544E	Coverslips
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-550-15	현미경 슬라이드
Leica SP5 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5	컨포칼 현미경
Volocity x64 소프트웨어	Perkin Elmer, Waltham, MA	버전 4.4.0	Volocity 소프트웨어는 이미지 처리
Imaris x64 3 차원 분석 소프트웨어	Bitplane, Concord, MA	버전 7.7.1	Imaris 소프트웨어는 이미지 분석 프로토콜의 3.3 단계부터 3.5 단계까지 사용됩니다
Excel	Microsoft, Redmond, WA	버전 Office 2013	엑셀 스프레드시트 소프트웨어는 형태 측정 기능을 요약하기 위해 프로토콜의 3.6단계에 사용됩니다
최적 절단 온도 화합물	Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA	4583	약칭 OCT
Leica Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL	CM1850	Cryostat for cutting 50 µ m 절편
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	C10600	녹색 형광 신호로 미토콘드리아를 표지하기 위한 포지티브 컨트롤로 사용