3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

Summary

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

Abstract

이 프로토콜의 목표 intraepidermal 신경 섬유 내에서 미토 콘 드리 아 연구입니다. 따라서, 3D 이미징 및 분석 기술은 신경 특정 미토 콘 드리 아를 격리 하 여 평가 하는 감각 신경의 말 초에 있는 미토 콘 드리 아의 질병 유발 변경 개발 되었다. 프로토콜 형광 immunohistochemistry, confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 분석 기법을 결합 합니다. 상세한 매개 변수는 이러한 기술을 사용 하 여 신경 특정 미토 콘 드리 아를 분리 하는 방법의 구체적인 예를 제공 하기 위해 절차를 통해 정의 됩니다. 항 체 신경 라벨을 사용 했다 하 고 피부의 조직 섹션에서 미토 콘 드리 아 신호 펀치 생 검는 각각 신경 및 미토 콘 드리 아 녹색과 적색 형광 신호를 시각화 하는 간접 면역 형광에 의해 그 뒤를 이었다. 부터 Z-시리즈 이미지 confocal 현미경 검사 법으로 인수 했다 고 3D 분석 소프트웨어 처리 하 고 신호를 분석 하는 데 사용 되었다. 그것은 정확한 매개 변수, 설명에 따라 필요가 없습니다 하지만 얼룩, 수집 및 분석 단계를 통해 선택 하는 것 들과 일치 하는 것이 중요 하다. 이 프로토콜의 힘 그것은 다양 한 상황에 적용 한 형광 신호를 사용 하 여 그렇지 않으면 불가능 한 것을 혼자 공부 하는 다른 신호를 분리 하는 곳입니다.

Introduction

미토 콘 드리 아 세포 에너지, 칼슘, 그리고 괴 규제, apoptotic 세포 죽음^1,2,3버퍼링 생산을 포함 하는 중요 한 세포 기능을 제공 합니다. 신 경계는 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 뉴런 아데노신 3 인산 염 (ATP)의 형태로 세포 에너지의 높은 수준의 생성 제안 몸⁴ 에 비해 높은 신진 대사 속도 있다. 많은 신경 기능 ATP⁵,⁶시 냅 스 특히 의존 하는 증거 문서. 따라서, 신경 세포 내 미토 콘 드리 아의 유통이 중요 합니다.

정보를 많이 보여주었다는 인신 매매와 신경 미토 콘 드리 아의 도킹 지난 10 년 동안은 매우 통제. 모터 단백질 신경 통해 특정 세포 구획을 미토 콘 드리 아를 배포에서 포함 된다. 뉴런 프로젝트 축 삭과 dendrites soma에서 멀리 떨어져 있기 때문에 미토 콘 드리 아의 인신 매매 하는 것이 특히 중요 합니다. Kinesin 모터 단백질 주로 직접 (소마)에서 참가자 다 모터 단백질 직접 (소마) 쪽으로 역행 운동^7,,89 동안 microtubules 따라 미토 콘 드리 아의 매매 ^{, 10}. 같은 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 존재와 미토 콘 드리 아 밀매^11,,1213의 방향에 영향을 주는 충 동 전도 셀룰러 신호가 있다.

미토 콘 드리 아, 수송 이외에 미토 콘 드리 아 노드의 Ranvier, 시 냅 스^8,14, 등의 높은 에너지 요구를 있는 특정 세포 구획을 지역화 하려면 특수 단백질 ¹⁷. 사실, 축 삭 내의 미토 콘 드리 아의 대다수는 비 운동^9,13,18. Syntaphilin 앵커 걸 골격^19-21을 다른 단백질 앵커 미토 콘 드리 아 동안 축 삭을 따라 microtubules에 미토 콘 드리 아 같은 특수 단백질. 성장 인자와 같은 칼슘 이온의 미토 콘 드리 아 운동 어디 그들은 필요한^21,,2223지역에 지역화를 지원 하기 위해 보고 되었다.

함께 찍은, 밀매 하 고 미토 콘 드리 아의 도킹 뉴런의 적절 한 기능을 위해 생명 이다. 이 지원 중단 미토 콘 드 리아 인신 매매에 연결 되었습니다 Alzheimer의 질병, 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, Huntington의 질병, 유전 경련을 포함 하 여 여러 신경학 상 조건 paraparesis, 그리고 광섬유 위축^{15,,2425,26,27}. 최근 연구 결과 당뇨병 신경 병, 당뇨병^{28,,2930,31과 관련 된 감각 손실에 대 한 잠재적인 메커니즘으로 미토 콘 드 리아 기능 장애 및 병 리에 집중 했다 ,,3233}. 가설은 당뇨병 피부 신경 결말의 감각 계획 내의 미토 콘 드리 아의 배포 변경입니다. 따라서, 기술은 시각화 하 고 계량 미토 콘 드리 아 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs), 지 루트 신경 절 감각 afferents의 원심 끝에 내에서 개발 되었다. 기술을 결합 하 여 특정 미토 콘 드리 아와 신경 섬유 라벨의 형광 immunohistochemistry confocal 현미경 검사 법부터 z-시리즈 수집 관련 신경의 분포를 측정 하기 위해 강력한 3 차원 이미지 분석 소프트웨어와 신호 미토 콘 드리 아에서 인간의 피부 펀치 생 검이이 목표를 달성 하기 위해.

Protocol

피부 펀치 생체 검사 (솔트 레이크 시티, 유타) 유타 대학 당뇨병 센터에서 큰 지역 사회 기반의 1 차 진료소 네트워크에서 모집 된 과목에서 얻은 했다. 이 연구는 미시간 대학 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었고 헬싱키의 선언의 신조를 준수. 테스트 하기 전에 각 주제에서 동의 얻어 작성.

1. 형광 Immunohistochemistry

1. intraepidermal 신경 섬유 immunohistochemistry 위한 준비 펀치 생 검:
   1. 수행 3mm 피부 biopsies 의료 여 직원을 1.5에서 전체 생 장소 mL 잠 ' s 통 솔루션 (2 %paraformaldehyde, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.4에에서 0.3% 포화 picric 산) 4 ° C 하룻밤에.
   2. 16-24 h 또는 샘플 싱크 때까지 4 ° C에서 30% 자당의 솔루션 샘플 PBS에 린스.
   3. 최적의 절삭 온도에 소스 샘플 화합물 (10 월)는 cryomold를 사용 하 여. 금형에서 아래로 향하게 하는 표 피와 전체 3mm 생을 놓고 약 2 mL 10 월 동결 건조 얼음에 형의 몰드를 채울 합니다. 저장소 사용 하 여 준비까지-80 ° C에.
   4. 잘라 50 µ m 두께 cryostat를 사용 하 여 횡단면 고 180 µ L 부동 액 스토리지 솔루션을 사용 하 여 잘 (30% 에틸렌 글리콜, PBS에서 30% 글리세롤) 당 96 잘 접시의 개별 우물에 저장 합니다. 다음 방향 96 잘 접시의 8 우물입니다. 서로 떨어져 200-300 µ m에서 각 생 사이트 섹션 얼룩.

1 일:

2. 지층 corneum의 일반적인 라벨 끄다:
   1. 레이블 96 잘 접시 그림 1에서 보듯이.
   2. 피펫으로 150 µ L 줄이기 위해 각 우물에 이차 항 체 ^{34 , 35}의 일반적인 바인딩 재고 신호 증강 솔루션의. 전송 섹션 inoculating 루프를 사용 하 여 신호 증강 솔루션으로.
      참고: 조직 손상 또는 찢 어 조직 섹션을 피하기 위해 함께 작업 하는 동안 주의. 플랫 로커에 실 온에서 30 분 동안 신호 증강 솔루션에서 유지.
   3. 준비 린스 각 우물에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 150 µ L을 추가 하 여 행 2와 3 96 잘 접시의 우물.
   4. 신중 하 게 행 2와 실 온에서 10 분의 1 x PBS에 린스 섹션 전송.
   5. 린스 (3 행) 실 온에서 10 분에 대 한 1 x PBS에 두 번째 시간.
3. 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 솔루션 준비:
   1. 준비 5 %BSA 포함 하는 솔루션을 차단 하는 5%와 0.3% 트리톤 X 100 (TX-100) 0.1 M PBS (표 1 참조) 섹션 동안에 잠복기는 신호 증강 해결책입니다. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.
   2. 각 우물에 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 4 행에 차단 우물 준비.
   3. 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 개별 우물으로 섹션을 전송 하 고 섹션 평면 로커에 실 온에서 1-2 h에 대 한 솔루션을 차단 하는 5 %BSA 품 어.
4. 1 %BSA 솔루션 및 주요 항 체의 희석을 rinsing 준비:
   1. TX-100 0.1 M PBS (표 2 참조) 동안 섹션 준비 1 %rinsing 솔루션 1 %BSA 0.3%를 포함 하는 5 %BSA 차단 솔루션에서 잠복기. BSA는 솔루션으로 쉽게 이동 하지 않습니다. BSA는 완전히 해소 될 때까지 소용돌이 솔루션.
   2. 섹션 5 %BSA 차단 솔루션에 잠복기는 하는 동안 1% BSA rinsing 솔루션에서 기본 항 체 희석.
      1. 1500 µ L의 1 차적인 항 체 솔루션을 만들고 각 추가 행 5에서 잘.
      2. 희석 주 항 체: 신경 관련 레이블, 토끼 polyclonal 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5)를 사용 하 여 1:1, 000에. 미토 콘 드리 아-특정 라벨을 사용 하 여, 단일 클로 널 항 pyruvate 효소 E2/E3bp 항 체 (PDH) 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 1: 100에서 마우스.
5. 준비 1 차 항 체:
   1. 피펫으로 150 µ L 각 1 차적인 항 체의 잘에 96 잘 접시의 5 행.
   2. 루프 도구를 사용 하 여 1 차적인 항 체를 포함 하는 5 행에 차단 솔루션 (4 행)에서 전송 섹션.
   3. 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 parafilm으로 접시 포장.
   4. 1 시간 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 º C에서 샘플을 품 어.

주 2:

6. 린스 샘플:
   1. 행 6, 7, 8 각 우물에 솔루션을 rinsing 1 %BSA 150 µ L을 추가 하 여 96 잘 접시의 준비 린스 우물.
   2. 첫 1% BSA rinsing 솔루션 (6 행)에 섹션을 전송 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 린스 섹션 1 %BSA 실 온에서 7과 1 시간에 8 행에 솔루션을 rinsing에 잠복기에 의해 두 번 더 반복.
7. 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 이차 항 체 희석:
   1. 이차 항 체 솔루션 섹션 1 %BSA 솔루션 (8 행)을 rinsing의 마지막 린스에 잠복기는 하는 동안 만들 1500 µ L.
   2. 이차 항 체 희석: PGP9.5 (녹색 형광 활용된 염소 안티 토끼 항 체, 1:1000), 1 %BSA 솔루션을 rinsing에 PDH (레드 형광 활용된 염소 반대로 마우스, 1:1, 000)에 대 한 대 한.
8. 준비 이차 항 체:
   1. 96 잘 접시의 9 행으로 이차 항 체의 피펫으로 150 µ L.
   2. 부드럽게 이차 항 체 웰 스 (행 9)에 해결책 (8 행)을 rinsing 1 %BSA 섹션을 전송.
   3. 사용 parafilm 랩 단단히 밖으로 건조에서 그것을 지키려고 접시. 커버 알루미늄 호 일. 1 시간에 대 한 실 온에서 평면 로커에 샘플을 놓고 다음 하룻밤 플랫 로커에 4 ˚C에서 샘플을 품 어.

제 3 일:

9. 준비는 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 여 1 x PBS 청소:
   1. 피펫으로 150 µ L의 행 10, 11 및 12에 1 x PBS를 필터링.
   2. 행 10 샘플을 전송 하 고 실 온에서 1 h 1 x PBS에 씻어. 커버 알루미늄 호 일로 96 잘 접시 고 린스 동안 플랫 로커에 놓습니다. 반복 필터링 PBS 린스 2 x 1 번 더 각 행 11 및 12에에서 실 온에서 1 h.
10. 현미경 슬라이드 조직 단면도 장착을 위한 준비:
    1. 장소 50 µ L의 필터링 슬라이드 1 x PBS.
    2. 50으로 1 x PBS (행 12)에서 전송 섹션 µ L 드롭. 신중 하 게 조직 전개 하 고 부드럽게 유리 슬라이드에 병합 하 여 PBS의 드롭에 섹션을 배치 합니다. 유리 피 펫을 장착 시 약 희석을 피하기 위해 초과 PBS를 제거 합니다. 섹션 유리 전구를 만지지 마십시오.
    3. 피펫으로 1-2 방울 DAPI를 포함 하는 사용 하 여 현미경 슬라이드 섹션 위에 직접 장착 시 약의 관리 섹션의 방향을 방해 하지. 부드럽게 섹션 50 mm x 24 mm #1.5 현미경 유리 coverslip 장소.
    4. 고는 coverslip 배치 하면서 형성 된 기포는 coverslip 가장자리에서 과잉 액체를 닦아. 새 슬라이드를 준비 하 고 장착 홍보를 반복각 섹션에 대 한 ocess.
    5. 치료/건조 실 온에서 어두운 하룻밤에 슬라이드를 삽입 하 여 설치 미디어. 슬라이드 4 ° C 또는-20 ° C (2 주 이상) 장기 저장을 위한 단기 (1-2 주)에 대 한 전송.
       주: 부정적인 컨트롤 단계 1.4.2.2에서에서 PGP9.5 또는 PDH에 대 한 1 차 항 체를 생략 하 고 신경이 나 표 피에서 미토 콘 드리 아의 구별할 수 없는 라벨 표시. 컨트롤이 수행한 긍정적인는 PDH에 대 한 항 체 그것을 증명 하기 위해 레이블이 모든 미토 콘 드리 아 (데이터 표시 되지 않음). 녹색 형광 단백질 (GFP) 신호 레이블 미토 콘 드리 아를 잠재로 불리고 그리고 다음 고정 되었고 PDH 항 체와 붉은 형광 스테인드 교양된 기본 마우스 지 루트 ganglion 신경에 긍정적인 컨트롤 수행 이차 항 체입니다. GFP를 표현 했다 모든 미토 콘 드리 아 공동 PDH immunohistochemistry (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 레드 라벨으로 분류 했다.

2. Confocal 영상

1. confocal 영상 수행:
   1. 수집 이미지는 거꾸로 한 현미경에 기름 침수 (1.25 숫자 조리개 (없음)) 목표 X 40 confocal 현미경 스캐닝 레이저를 사용 하 여.
      1. 각 초점면에서 순차적으로 형광 신호 취득:
         핵: 여기 λ = 405 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 420-480 nm
         신경 섬유: 여기 λ = 488 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 505-560 nm
         Mitoch ondria: 여기 λ = 543 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 606-670 nm
   2. 현미경 소프트웨어에 다음과 같은 검색 매개 변수를 입력: 2 프레임 평균 및 2.2;의 확대와 함께 600 Hz의 스캔 속도 12 비트 강도 해상도 (4096 회색 수준)입니다.
      1. 설정 최적화 측면 검사용 현미경 소프트웨어 (스캔 해상도 1024 x 1024 =) 및 축 해상도/광학 단면 (confocal 조리개 z 단계 크기 210의 = 1 공기 단위 (AU) nm).
         참고: 결과 XYZ 해상도 172.2 x 30-50 µ m x 176.1 µ m x 176.1 µ m의 이미지 크기와 172.2 nm x 210 nm nm.
   3. 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 실시간 검색을 활성화 하 고 찾아서 설정 상단 z-초점 조정 조직 섹션 내에서 신경 신호를 포함 하는 현미경 소프트웨어에 초점 비행기를 내립니다. 총 z 범위는 일반적으로 30-50 µ m 50 µ m 조직 섹션.
   4. 표 피는 가로 또는 세로로 위치에 이미지 라이브 검색 중 현미경 소프트웨어 검색 필드를 회전.
   5. 별도로 각 신호를 스캔 하 고 검출기 (광 전 증폭 관 관, PMT) 조정 전압 및 오프셋 어떤 이상과 포화 픽셀에서 최소화/제거.
      참고: 위의 매개 변수 검사 시간이 걸릴 z 조각 수에 따라 약 20-40 분.

3. 3D 시각화 및 분석의 미토 콘 드리 아 내에서 인간 Intraepidermal 신경 섬유

1. 3D 표 피 분리:
   1. 원본 이미지를 복제 하 고 최대 강도 사용 하 여 식별 하 고 표 피를 분리 하는 이미지의 (초점 보기 확장) 프로젝션.
   2. 결 석 지층 corneum 피부 등의 원치 않는 영역을 제거 하려면 표 피의 위쪽과 아래쪽 가장자리를 따라 추적 도구 관심의 영역을 사용 intraepidermal 신경 섬유의. 이 선택 영역을 자르기.
2. 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호에 사용 deconvolution:
   참고: Deconvolution 형광 신호 무결성을 복원 하는 데 도움이. 이미지에 그들의 원래 소스에서 신호를 확산 하는 얼마나 많은 결정 하는 형광 신호를 사용 하기 때문에이 프로토콜에서 사용 하는 복원 장 님 deconvolution 이라고 (지점 확산 기능). 프로세스는 그것의 원래 위치에 다시 확산 신호를 재할당 함으로써 신호 해상도를 향상 시킵니다.
   1. 계산 지점 확산 기능 (PSF) 녹색 형광 신경 신호 (그린 형광)에 대 한 다음 매개 변수:
      1. 설정 계산된 PSF confocal. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기 1 공기 단위 (거리)를 설정 합니다. 설정된 레이저 여기 파장 488 nm 및 방출 파장 515 nm.
   2. PSF 빨간 형광 미토 콘 드리 아 신호 (레드 형광)에 대 한 다음 매개 변수 계산:
      1. 세트 confocal PSF 계산. 1.25 1.515 숫자 조리개를 중간 굴절 인덱스를 설정 합니다. 핀 홀 탐지기를 1로 설정 AU. 617 543 nm 및 방출 파장을 설정된 레이저 여기 파장 nm.
   3. Deconvolution 해당 PSFs를 사용 하 여 신경 및 미토 콘 드리 아 형광 신호는 위에 나열 된 최적화와 반복 복원 기능 설정 100% 자신감 10 사이클의 반복 제한.
3. 신경 특정 표면 작성:
   1. 사용은 " 서피스를 생성 " 도구 deconvolved 녹색 형광 보조 라벨에 PGP9.5의에서 신경의 단단한 표면을 식별 신경.
   2. Uncheck는 " 부드러운 " 기능을 사용 하 여 절대 강도 기능 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 상당히 밝은 배경 형광 보다.
   3. 절대 강도 기능 사용 하 여 신경 신호에 대 한 임계값을 설정 하는 때문에 그것은 크게 배경 형광 보다 밝은. 정확 하 게 식별 하는 신경을 충분히 낮은 임계값 설정.
   4. 필터 작은, 비 신경 표면 밖으로 크기에 따라.
      참고: 필요한 경우 수동으로 편집 내 추가 비 신경 서피스는 " 편집 " 여러 개체를 강조 하기 위해 제어 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.
4. 격리 신경 특정 형광 미토 콘 드리 아 신호:
   1. 볼 신경 표면의 편집 탭을 선택 하는 " 마스크 속성 " 기능. 단계 3.3에서에서 만든 신경 표면은 keratinocytes와 관련 된 미토 콘 드리 아 신호에서 그 신경 내의 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 됩니다.
   2. 로 " 마스크 모든 ' 엽니다 단추는 " 마스크 채널 " 창, 풀 다운 메뉴 아래에서 deconvolved 레드-형광 신호를 선택 " 채널 선택 " 미토 콘 드리 아 신호.
   3. 확인 표시를 넣어 하 고 상자에 클릭 합니다 " 마스크를 적용 하기 전에 중복 채널 " 옵션.
   4. 클릭 라디오 버튼의 앞에 " 일정 내부/외부 " 확인 표시를 넣어 하 고 마스크 설정 상자에서 클릭 옵션은 " 설정에 외면 복 " 옵션 및 입력 값에 대 한 0.00. 확인을 클릭 버튼을 만들 신경 표면 내 미토 콘 드리 아 신호를 나타내는 새로운 채널.
5. 미토 콘 드리 아-특정 표면 작성:
   1. 사용은 " 서피스를 생성 " 도구를 신경 특정 미토 콘 드리 아 신호를의 새로 만든된 형광 채널에서는 미토 콘 드리 아의 단단한 표면 3.4 단계.
   2. Uncheck는 " 부드러운 " 기능 및 선택은 " 배경 빼기 " 임계값을 설정 하는 기능. 이 기능은 미토 콘 드리 아 신호 주변 지역 대비를 사용 하 여 배경에서 미토 콘 드리 아를 식별.
   3. 세트 미토 콘 드리 아를 정확 하 게 식별 하 게 충분히 낮은 임계값 값입니다. 이 예제에서 더 낮은 임계값 2000 16 비트 (65536) 규모에 대 한 설정 했다.
   4. 필터 크기에 따라 미토 콘 드리 아 표면. 이 예제에서는 1.0 복 복 제한 설정, 최저는 제한 가능 합니다. 필요한 경우 수동으로 내 미토 콘 드리 아 비 표면에 밖으로 편집 된 " 편집 " 여러 개체를 선택 하려면 CONTROL 키를 누른 다음 Delete 키로 삭제 탭.
      참고: 때때로, 소프트웨어가 만들어집니다 구별할 수 형광 미토 콘 드리 아 신호 연결 되지 않은 표면. 이러한 경우에, 그것은 그들을 제거할 수 있는 " 편집 " 탭
6. 수출 분석에 대 한 형태학 값 계산:
   1. 신경 및에서 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 값을 내보내기는 " 통계 " 전자 스프레드시트 소프트웨어와 추가 분석을 위해 탭.
   2. 신경 및 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 값을 내보낼.
   3. 개별 신경 섬유에 각 이미지의 수를 세 고 전자 스프레드시트에 값을 기록.
   4. 각 이미지에 대 한 전자 스프레드시트에서 분석에 대 한 다음 잠재적인 값 계산:
      1. 모든 신경 표면 위한 볼륨 합계.
      2. 필터 보다 0.02 µ m ³와 빈의 볼륨 아래 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 밖으로 표면 크기. 예를 들어 0.02-같은 저장소를 사용 하 여 0.04 0.04-0.08, 0.08-0.16, 0.16-0.32, 0.32-0.64, 0.64-1.28 1.28-2.56, 2.56 µ m ³ 보다 큰.
         참고: 0.02 µ m ³ mitonchodria ^{36 , , 37 38}의 이전 게시 된 볼륨에 따라 미토 콘 드리 아 볼륨의 하한값 설정.
      3. 쓰레기통 (0.02-2.56 µ m ³ 이상)를 통해 각 빈 내 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 수와 표면의 총 수를 계산.
      4. 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면 각 빈에서의 비율을 계산합니다. 수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 표면의 총 수로 나눈 빈 당.
      5. 모든 신경 특정 미토 콘 드리 아 표면에 대 한 볼륨 합계.
      6. 모든 미토 콘 드 리아 표면 볼륨의 합으로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 미토 콘 드리 아 신호 신경의 비율을 계산.
      7. 모든 미토 콘 드 리아 표면 수로 총 신경 표면 볼륨을 분할 하 여 신경 볼륨 당 미토 콘 드리 아의 수를 계산.

Results

시각화 및 인간 IENFs 내 미토 콘 드리 아의 정량화

형광 immunohistochemistry 신경, 미토 콘 드리 아, 그리고 핵 시각화를 인간의 피부 생 검으로 여러 신호 동시 라벨에 대 한 수 있습니다. 96 잘 접시 immunohistochemistry 절차의 단계를 구성 하는 편리한 방법입니다. 그림 1 는이 구성 계정에 대 한 솔루션의 12 단계를 통해 처리 될 8 섹션까지 보여준다. 무료-부동 메서드 플랫 로커와 부드러운 동요와 결합 항 체 양쪽에서 섹션 침투에 대 한 충분 한 액세스는 보장 합니다. 프로토콜 기본 및 보조는 항 체 4 ° C에서 지속적으로 신경 및 미토 콘 드리 아를 라벨에 하룻밤 외피 때문에 크게는 완료, 3 일이 걸린다.

Discussion

이 프로토콜은 분리, 계량 및 크기와 인간의 피부 생 검에서 3d에서 IENFs 내 신경 특정 미토 콘 드리 아의 분포 분석 설계 되었습니다. 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 부동성 형광 immunohistochemistry는 얼룩 답사 연구^44,45에 대 한 다양 한 방법론을 제공 하는 각 샘플에서 여러 신호를 분석 하 고 설계 되었습니다. 이 절차는 confocal 현미경 이미지 및 3D 분석에 필요한 50 µ m 섹션에 걸쳐 이미지 수집을 극대화 하기 위해 조직에 항 체의 침투에 대 한 수 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 이미지 수집 매개 변수를 측정 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 해상도 유지 하면서 이미지 당 충분 한 신경을 캡처 사이 균형 이다. 조직 섹션에 사용 하 고 표준 피부 생 검 프로토콜은 약 3 m m 긴^45,,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% Zamboni's Fixative	Newcomer Supply, 위스콘신주 미들턴	1459A	2% 파라포름알데히드, 0.2% 포화 피크르산 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4
10x 인산염 완충 식염수(PBS)	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	BP399-4	1x PBS
Image-iT FX Signal Enhancer	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	I36933	비특이적 결합을 줄여 Alexa Fluor 염료 신호를 향상시킵니다
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)	Proteintech Group Inc. Rosemont, IL	14730-1-AP	PGP9.5로 약칭되며 단종된 AbD Serotec(Cat. No. 7863-0504) 항체
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal)	abcam, Cambridge, MA	ab110333	약칭
PDH Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11034	red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	A-11032	녹색 형광 접합 2차 항체
알부민, Bovine Serum	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A7906-100	BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T9284	TX-100
0.22 µ로 약칭; m 필터	EMD Millipore, Billerica MA	MILLEX GP SLGP 033NS	0.22 &마이크로; m Millipore 필터
Parafilm M	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	13-374-10	Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	22-032092	Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate	Corning Incorporated, Corning, NY	3603	96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	P-36931	핵의 DAPI 염색
현미경 커버 유리 50 x 24 mm	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-544E	Coverslips
Superfrost Plus 현미경 슬라이드	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	12-550-15	현미경 슬라이드
Leica SP5 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5	컨포칼 현미경
Volocity x64 소프트웨어	Perkin Elmer, Waltham, MA	버전 4.4.0	Volocity 소프트웨어는 이미지 처리
Imaris x64 3 차원 분석 소프트웨어	Bitplane, Concord, MA	버전 7.7.1	Imaris 소프트웨어는 이미지 분석 프로토콜의 3.3 단계부터 3.5 단계까지 사용됩니다
Excel	Microsoft, Redmond, WA	버전 Office 2013	엑셀 스프레드시트 소프트웨어는 형태 측정 기능을 요약하기 위해 프로토콜의 3.6단계에 사용됩니다
최적 절단 온도 화합물	Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA	4583	약칭 OCT
Leica Cryostat	Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL	CM1850	Cryostat for cutting 50 µ m 절편
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts	C10600	녹색 형광 신호로 미토콘드리아를 표지하기 위한 포지티브 컨트롤로 사용