방법 논문

식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

DOI:

10.3791/53411

⸱

2016년 1월 21일

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1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

이 논문에서

요약

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복잡한 미생물 군집에서 박테리아 내생포자를 선별하는 방법이 개발되어 이 박테리아 그룹에 대한 맞춤형 배양 또는 분자 연구를 수행할 수 있습니다.

초록

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내포자 형성은 피르미쿠테스(Firmicutes)문의 일부 박테리아에서 발견되는 생존 전략입니다. 내포자가 형성되는 동안 이 박테리아는 불리한 환경 조건에서 생존을 향상시키는 형태 생리학적 휴지 상태로 들어갑니다. 내포자 형성 피르미쿠테스는 배양 연구에서 가장 빈번하게 농축되고 분리된 박테리아 그룹 중 하나이지만, 분자 방법에 기반한 다양성 연구에는 종종 빠져 있습니다. 포자 코어의 저항은 내생포자에서 DNA의 회복을 제한하는 요인 중 하나로 간주됩니다. 우리는 내생포자의 높은 저항성을 이용하여 물리적, 효소적, 화학적 용해 방법을 사용하여 복잡한 미생물 군집의 다른 세포와 분리하는 방법을 개발했습니다. 이렇게 얻어진 내포자 단독 제제는 재배양에 사용하거나 내생포자에 최적화된 맞춤형 DNA 추출 및 후속 DNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 퇴적물 샘플에 적용된 이 방법은 내생포자를 풍부하게 할 수 있었고 염기서열분석 후 담수호 퇴적물에서 매우 다양한 내생포자 형성 물질을 밝혀냈습니다. 이 방법을 다른 샘플에 적용하면 유사한 결과가 나올 것으로 예상됩니다.

서론

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이 연구의 목적은 환경 시료에서 식물 세균 세포에서 세균 내생 포자의 분리를위한 프로토콜을 제공하는 것이다. 박테리아 내생 포자의 형성은 문 후벽 균 1 그룹에 속하는 박테리아의 수에서 발견 생존 전략, 보통 기아에 의해 유발된다. 내생 포자 형성 세균이 잘 균주의 수는 병원균 따라서 의료의 중요성 (예를 들어, 탄저균이나 클로스 트리 디움 디피)의 주로하기 때문에, 연구한다. 내생 포자 형성 박테리아의 환경 균주는 거의 모든 환경 (토양, 물, 퇴적물, 공기, 얼음, 인간의 직감, 동물의 창자 등) 1-3에서 고립되었다. 따라서, 후벽 균 배양 컬렉션 (4)에서 두 번째로 가장 풍부한 문이다.

때문에 튼튼한 외부 피질 및 보호 핵심 단백질, 내생 포자는 FR에 이르기까지 극단적 인 환경 조건을 견딜 수높은 방사선, 극한의 온도 및 유해 화학 물질 5 옴 탈수. 이 놀라운 저항은 내생 포자 6-8에서 DNA를 추출하는 도전한다. 그들은 환경 시퀀싱 연구 9,10에서 간과 된 이유는 가능성을 설명합니다. 형광 항체 (11)에 의해 환경 시료의 내생 포자의 대....

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프로토콜

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화학 물질 및 장비의 1. 준비

  1. 1 %의 나트륨 헥사 (SHMP) (나포 3) N 용액 500 mL로하고 고압 증기 멸균에 의해 소독.
  2. 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 멸균 니트로 셀룰로오스 (NC) 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 47mm).
  3. 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 NC 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 25mm)를 소독.
  4. 무게 (에 캡) 멸균 50 ㎖ 튜브의 빈 무게 (샘플 당 하나의 튜브를) 참고.
  5. EDTA 트리스 완충액 (TE 버퍼) (1X)를 준비 : 10 mM 트리스 (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄) 및 1 mM의 EDTA 완충액 용액을 만든다. 8 산도를 조정하고 고압 증기 멸균에 의해 소독.
  6. 1 ㎖의 TE 완충액에 리소자임 0.02 g을 용해하여 리소자임 용액 (20 ㎎ / ㎖)을 제조. 이상적으로, 때마다 신선한합니다. 더 이상 1 이상 주 4 ℃에서 보관하십시오.
  7. 8g / L 염화 나트륨을 용해시켜 용액을 제조 생리증류수 (염화나트륨). 고압 증기 멸균에 의해 소독.

퇴적물....

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결과

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여기에 제시된 결과는 이전 10,21 발표되었다. 데이터의 환경 적 해석과 설명은 해당 문서를 참조하십시오.

전체 절차를도 1에 요약 및 세 개의 주요 단계에 해당된다 : 첫째, 침전물 또는 다른 환경적인 행렬에서의 바이오 매스의 분리; 둘째, 식물 세포의 파괴; 그리고 세 번째, 분리 된 내생 포자의 하류 분석. 하류 분석 다양성을 결정하는 DNA 추출 및 앰플 리콘 서열, 예를 들어, 구성 될 수있다. 내생 포자의 용해를 확보 할 수 있도록 DNA 추출을 최적화 할 필요가있다. 침전물 시료에서는 강제 순차 DNA 추출 과정 (10)를 이용하여이를 달성했다. 퇴적물에있어서의 애플리케이션은 분리 후 내생 포자 형성 후벽 균의 분획의 상당한 증가를 보여준다. 16S rRNA의의 앰플 리콘 시퀀싱에서유전자 치료 샘플 후벽 균 (전체 커뮤니티) 만에 8.0 시퀀스의 19.0 % (표 1)

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토론

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외부 공격적인 물리 화학적 요인 (예를 들면, 온도 또는 세제)에 내생 포자의 저항은 환경 시료에서 식물 세포에서 세균 내생 포자를 분리하는 방법을 고안 하였다. 이것은 비파괴 방식으로 환경 시료로부터 내생 포자를 분리하는 제 광범위한 방법이다. , 양을 감지하거나 샘플 내생 포자를 분석하는 이전 방법 등 dipicolinic 산 또는 특정 마커 유전자와 같은 내생 포자에 대한 특정 프록시의 측정을 기반으로했다. 대조적으로, 프로토콜, 여기에 제시된 내생 포자 이외의 샘플 성분은 제거되고 있으므로 결국 내생 포자 시료의 단독 및 정제 된 잔재로 남아있다. 이러한 살균 또는 밀도 구배 원심 분리 등의 다른 방법이 내생 포자 22 풍부 제안하였으나, 우리의 실험은 밀도 구배 원심 분리는 환경 시료에 대한 일반적인 방법으로 적합하지 않은 것으로 밝혀인해 생리적 차이 내생 포자 형성 제의 여러 종의 다른 밀도로 (데이터는 미도시). 대조적으로, 우리는 프로토콜을 쉽게 환경 시료의 모든 유형에 적용되.......

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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저자는 그랜트 번호 31003A-1분의 132,358, 31003A_152972 및 번호 151948에 대한 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 인정하고 Fundation 피에르 메르 라 과학을 붓는다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Whatman 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터, 0.2 μ m 기공 크기, 직경 47mm시그마-알드리치WHA7182004 알드리치 
트리스(하이드록시메틸)아미노메탄시그마-알드리치252859 시그마-알드리치CAS 77-86-1
EDTA시그마-알드리치E9884 시그마-알드리치CAS  60-00-4 
닭 달걀 흰자위의 라이소자임Sigma-Aldrich62971 플루카분말, CAS  12650-88-3 
Ultra-Turrax 호모게나이저 T18 기본IKA3720000
유리 필터 홀더 47  mm 멤브레인, Pyrex 유리EMD MilliporeXX10 047 00
화학 듀티 진공 펌프MilliporeWP6122050220 V/50 Hz
매니폴드 샘플링 여과 25  mm 멤브레인Millipore1225 샘플링 매니폴드폴리프로필렌
DnaseNew England BiolabsM0303SRnase 무료
NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
나트륨 도데실 설프페이트 (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Whatman 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터, 0.2 μ m 기공 크기, 직경 25mm시그마-알드리치WHA7182002 알드리치

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White....

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재인쇄 및 허가

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