정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Summary

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

Abstract

인간 심장 조직 공학은 3차원 네이티브 인간 심근의 생체 충실도를 복제하는 새로운 종 특이적 스크리닝 시스템의 개발을 통해 치료 발견에 근본적으로 영향을 미칠 수 있으며, 생물학적 복잡성을 통제할 수 있는 수준의 생물학적 복잡성을 가능하게 하고 조직 수축 기능의 비파괴 종적 모니터링을 가능하게 합니다. 초기에는 인간 만능 줄기세포의 유도 분화에서 얻은 전체 세포 집단을 사용하여 인간 공학 심장 조직(hECT)을 만들었으며, 일반적으로 심근세포를 50% 미만으로 산출했습니다. 그러나 인간 심근에 대한 신뢰할 수 있는 예측 모델을 만들고 이세포 상호 작용의 메커니즘을 규명하기 위해서는 조작된 조직의 생물학적 구성을 정확하게 제어하는 것이 필수적입니다.

이 한계를 해결하기 위해 심장 표면 마커 SIRPα 및 섬유아세포 마커 CD90에 대한 살아있는 세포 분류를 활용하여 이러한 세포 유형이 각각 3:1 비율로 포함된 조직을 만든 다음 함께 혼합되어 콜라겐 기반 매트릭스 용액에 추가됩니다. 따라서 생성된 hECT는 세포 및 세포외 기질 구성 모두에서 완전히 정의됩니다.

여기에서는 현재 인간 임상 시험에 사용되고 있는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hMSC)의 예를 사용하여 세포 치료에서 세포-세포 상호 작용의 메커니즘을 이해하기 위한 모델 시스템으로 정의된 hECT의 구성을 설명합니다. 정의된 조직 구성은 hMSC가 조직 기능을 향상시키기 위해 내인성 심장 세포 유형과 어떻게 상호 작용할 수 있는지 이해하는 데 필수적입니다. 또한 6개의 hECT를 동시에 배양하여 분류 후 세포를 보다 효율적으로 사용할 수 있는 생물반응기 시스템도 설명됩니다.

Introduction

심장 조직 공학은 최근 두 쥐의 심근 ^1-6과에서 만든 완전한 기능을, 구타 조직, 인간 줄기 세포 유래 심장 근육 세포 ^7-12의 결과를 게시하는 여러 그룹으로, 지난 10 년간 크게 발전하고있다. 심근 조직 공학 분야는 두 가지 주요 본질적으로 독립적 인 목적에 의해 구동된다 : 1) ^기능을 개선하기 위해 ^4-6 하트 실패에 이식 할 수 외래 이식을 개발; 2) 생리 및 질병 연구를위한 체외 모델에서 개발, 또는 치료 개발 ^2,7 선별 도구로합니다.

3 차원 (3-D) 세포 배양 물은 3-D 행렬은 기존의 2-D 단층 세포 배양 물보다 더 자연 심장 미세 환경을 반영하는 바와 같이, 차세대 스크리닝 도구 개발에 필수적인 것으로 간주된다; 실제로 세포 생물학의 일부 측면은 2-D 대 3-D 배양 ^13,14 근본적으로 다르다 . 세포 외 기질 및 세포 인구 : 또한, 설계 심장 조직이 완전히 정의 된 구성 요소로 구성되어있다. 세포 외 기질 성분 (일반적 피브린 ⁹ 콜라겐 ^7,8,10)이 엄격하게 통제하면서 전통적인 설계 인간의 심장 조직의 경우, 입력 셀 조성물은 덜의 지시 심장 분화에서 세포의 전체 혼합물로 정의된다 어느 배아 줄기 세포 (ESC ^7,9) 또는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC ^{10, 12)는} 조직에 추가. 특정 세포주에 사용 된 분화 프로토콜의 효율에 따라, 심근의 생성 비율이 90 % 이상 25 % 미만에서 특정 심근 표현형의 범위 일 수있다 (즉, ventricular-, atrial- 심박 형 또는) 수도도 아닌 심근 분획 ^{(15, 16)을} 매우 이질적인하고 차별화 된 심장 m의 성숙을 변경할 수 있습니다 다양¹⁷ yocytes.

최근 심근 조직 공학 연구는 심장 리포터 인간 배아 줄기 세포주 ⁸ 세포 표면 마커 ^(18)가 분화 심장 근세포 성분을 분리하는 데 사용되는 하나와, 셀 입력 인구를 제어하려고 하였다. 단지 심장 근육 세포로 구성 초기에 조직이 이상적 일 것 같다 있지만,이 사실이 아닌 경우에; 심장 근육 세포의 1의 비율 : 섬유 아세포가 가장 높은 트의 힘 ^(8)을 생산 전적으로 심장 근육 세포로 구성 hECTs 일부 그룹 3을 찾는, 기능 조직으로 압축하지 못한다. 생균 정렬 용 표면 마커를 포함하여 다양한 세포의 선택 방법을 이용함으로써, 한정된 세포 집단과 hECTs를 생성 할 수있다. 비 심장 기질 세포의 마커 CD90 ^19,20 이러한 추정 섬유 아세포 마커로서 당분간 사용할되었지만, 심장 근육 세포 표면 마커는보다 어려웠확인하다. SIRPα 인간 심장 근세포 ¹⁸ 식별 제 심장 표면 마커 사이이고 심장 리니지 고도로 선택적인 것으로 밝혀졌다. 세포 섬유 아세포와 같은 표현형 (Josowitz, 게시되지 않은 관찰)을 나타내는 CD90 ⁺ 인구, 거의 순수한 심근 세포를 얻을 수 ^- 최근에, 우리는 두 번 정렬 SIRPα ⁺ 및 CD90에 대한이 있음을 발견했다. 심근 세포와 CD90 ⁺ 섬유 아세포 ^- SIRPα ⁺ / CD90의 1 조합 :이 수집 된 결과를 바탕으로, 여기에 우리는 3를 사용하여 hECTs을 만들 설명합니다.

완전히 정의 인간 심장 조직을 설계하는 능력은 강력한 선별 도구를 만드는, 또한 새로운 세포 - 기반 유전자 심장 치료를 조사하기위한 모형을 개발하는 시스템뿐만 아니라 필수적이다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) ^(21)를 포함한 세포 유형 이용한 심부전 특히, 다수의 세포 치료에서, , 심장 줄기 세포 ⁽²²⁾ 및 골수 단핵구 ^23-25은 임상 시험에서 시험되고있다. 초기 결과 많은 ^{21,23,25 유망되었지만,} 초기 이득은 종종 ^26-29 시간에 걸쳐 감소한다. 유사한 경향으로 인해 MSC 보충에 중요한 기능적 이득을 표시 뮤린 설계 심장 조직에서보고되었지만 이득 장기 배양 ^한 동안 유지되지 않는다. 서브 최적의 성능을 기본 것은 세포 치료를 지배하는 메커니즘의 우리의 제한된 지식이다. 자신의 유익한 영향뿐만 아니라 심근-nonmyocyte 상호 작용의 잠재적 인 부정적 영향을 미치는 방법을 치료 세포의 깊은 이해는 심부전 환자에 대한 최소한의 부작용이 임상 적으로 유의 한 지속적인 혜택을 얻었다 개선 된 치료법의 개발을 활성화합니다.

여기, 우리는 interrog 정의 hECTs의 사용을 설명세포 기반 치료의 메커니즘을 먹었다. 제어 조직 조성물은 심근 성능에 영향을 특정 요소를 식별하는 데 중요하다. 우리 래트 ECTS ^1에서 보여준 바와 같이 직접 관심 치료 세포 유형 (예, 중간 엽 줄기 세포)를 hECTs 보충, 심장 근세포의 성능에 미치는 영향을 나타내있다.

다음 다단계 프로토콜 멀티 조직 생물 반응기의 제조이어서, 조직 구조 및 기능 분석에 대한 설명으로 종결 지시 된 심장 줄기 세포의 분화와 함께 시작된다. 우리의 실험은 NIH 승인 H7 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인을 사용하여 수행됩니다. 그러나, 다음의 프로토콜들이 또한 추가 hESC의 라인과 유사한 결과 세 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 라인을 사용하여 테스트되었다. 우리는 hECT 제조에서 심근 차별화와 성공의 효율성, 특히 fo를, 세포주 의존 할 수 있다는 것을 발견했다개별 환자에서 파생 된 연구 hiPSC 라인. 이 프로토콜에 따라, 두 개의 6 잘 요리 20 일 동안 차별화 충분히 여섯 정의 된 조직을 만들기 위해, 정렬 후 약 250 만 근육 세포를 얻을 수 1,680,000 hESCs는 (물론 당 140,000 셀), 총으로 도금되어있다.

Protocol

참고 : HEPA 필터 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하여 무균 상태의 모든 세포 조작을 수행하고 0.2 μm의 필터를 통해 필터링 모든 솔루션을 소독. 같은 무균 조건 또는 층류 후드 하나로 조직 구조 및 기능 테스트를 수행한다.

심장 차별화를위한 준비에 H7 hESCs는 1. 시드

1. (주 1) 지하실 막 매트릭스 준비
   1. 4 ℃에서 밤새 얼음에 hESC의 자격을 갖춘 지하 막 매트릭스의 150 μl의 나누어지는을 녹여.
2. 코팅 플레이트에 hESCs는의 (주 0-4) 도금
   1. 얼음처럼 차가운 DMEM / F12 12 ml의에 해동 행렬을 희석하고 잘 섞는다.
   2. 전송 6- 웰 조직 배양 접시의 처리를 각 웰에 DMEM / F12 매트릭스 액 1ml. 매트릭스 캔 코팅이 6 웰 플레이트의 각 나누어지는.
   3. 적어도 1 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 인큐베이션.
      참고 :에서경험은 파라핀으로 밀봉 피복 요리를 사용하기 전에 최대 10 일 동안 39 ° C에서 매트릭스 용액에 저장 될 수있다.
   4. 약 75 % 합류에, 비 효소 분해 시약 용액 6을 사용하여 10cm 접시의 H7을 hESCs는 해리. 5 분 후, 부드럽게 일회용 셀 스크레이퍼를 사용하여 배양 표면에서 세포를 긁어 멸균 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
   5. 줄기 세포주 전파 (상기 hESCs는를 해리 해리 시약 5.5 ml를 떠나) 새로운 무균 15 ㎖의 튜브에 15 ㎖의 튜브 양도 세포 해리 용액 0.5ml를 제거.
   6. 20 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 세포의 0.5ml를 펠렛. 상등액을 제거하고 부드럽게 한 다음 새로운 코팅 10cm 조직 배양 접시로 옮기고 줄기 세포주를 유지하도록 37 ° C, 5 % CO _{2 유지} 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 %를 함유하는 다 능성 줄기 세포 배지 8 ㎖에 재현 탁.
      참고 : 미디어 변경하는 동안 얼음에 다 능성 줄기 세포 미디어를 유지합니다.
   7. 한편, 나머지 해리 5.5 ml의 용액에 10 mM의 ROCK 억제제 Y-27632 5.5 μL를 추가하여 다른 50-10 분 동안 실온에서 배양을 계속. 부드럽게 5 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 세포를 섞는다. 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지, 실온에서 5 분 동안 300 XG에 펠렛 세포 배양을 계속.
   8. 다 능성 줄기 세포 배지 5ml에 재현 탁하고 세포를 이용하여 혈구 세포 수를 수행한다.
   9. 시드 웰 당 140,000 세포의 밀도로 6 웰 접시의 각 웰. 여섯 정의 조직의 합계를 만들기 위해 두 개의 6- 웰 플레이트 종자. 도금 후 남아있는 세포를 폐기하십시오.
   10. 다 능성 줄기 세포 미디어를 잘 1 ml에 입력하고 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화. 24 시간 후, 미디어를 분리하고, 각 웰 (도 1a에 신선한 능성 줄기 세포 배지 2 ㎖를 추가 ).
   11. 매일 판의 합류를 확인하고 세포가 약 75 %의 합류에 도달하면 분화를 시작합니다 (그림 1B - D)를.

심근 ^{(30, 31)에} 인간 배아 줄기 세포의 2. (일 4-24) 차별화

1. (주 4-7, 차별화 날 0-3) 중배엽 유도
   1. 10 ㎖의 B27의 (인슐린)없이 보충 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 스톡 용액 (10,000 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 10,000 IU / ml의 페니실린) 5 ㎖를 500 ㎖의에게 RPMI 1640을 조합하여 RPMI 분화 배지 I (표 1)을 준비한다. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 얼음에 나누어지는, 저장.
   2. (4 일, 차별화 날 0) I. 각 우물에서 다 능성 줄기 세포 용지를 제거 RPMI 차별화 미디어의 12 ml의 (10 mM의 재고, 6 μm의 최종 농도) 작은 분자 GSK3 억제제 CHIR99021의 2.4 μl를 추가하여 중배엽 유도 매체를 준비 에이차 중배엽 유도 매체의 2 ㎖로 당 잘 교체합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다.
      참고 : 중요한 세포 죽음은 일반적으로 CHIR99021 (그림 1E)의 추가 발생합니다. 단층은 회복하지만 떨어져 DMEM / F12 린스와 사균 린스하는 것이 중요하다.
   3. 상술 한 바와 같이 (5 일, 차별화 1 일) 신선한 중배엽 유도 미디어를 준비합니다. 물론 각에서 기존의 미디어를 제거하고 DMEM / F12 1 ㎖로 한번 씻어 당 잘. 각 웰에 신선한 중배엽 유도 매체의 2 ML을 추가합니다.
      참고 : 하루 0-10에서 매일 세척하는 것은 크게 심장 근육 세포의 수율과 순도를 증가시킨다.
   4. (6 일, 차별화의 날 2) 심장 유도 용지를 제거하고 잘 당 1 ml의 DMEM / F12로 한번 씻어. I (더 작은 분자는하지만 여전히 인슐린) 보충없이 B27 (첨가) 2 ml의 RPMI 차별화 미디어와 린스를 교체하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
2. (주 7-13, 차별화 다Y 3-10) 심장 중배엽 유도
   1. (7 일, 차별화 3 일) RPMI 차별화 미디어 I. 12 ml의 작은 분자의 Wnt 억제제 IWR-1 (최종 10 mM의 재고, 5 μM)의 6 μl를 추가하여 심장 중배엽 유도 매체를 준비
   2. 물론 각각의 용지를 제거 웰 당 1 ml의 DMEM / F12와 함께 한 번 헹군 심장 중배엽 유도 미디어 2 ㎖로 교체 당 잘.
   3. 상기 한 바와 같이 (8 일, 차별화 4 일) 심장 중배엽 유도 매체의 추가 12 ml의를 준비합니다. 미디어가 이전에 하루를 추가 제거 웰 당 1 ml의 DMEM / F12에 한 번 씻어 잘 당 신선한 심장 중배엽 차별화 미디어의 2 ㎖로 교체하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
   4. (주 9 ~ 10, 차별화 날 5-6) 모두 일에는 심장 중배엽 유도 매체를 제거하고 DMEM / F12의 각 웰에 1 ml에 헹군다.
   5. 신선한 RPMI 차별화 매체의 2 ML을 추가 I (더 작은 분자가 여전히 인슐린없이 B27 () 보완과 추가 없음)각 웰에 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
3. (주 11-24, 차별화 날 7-20) 배아 줄기 유래 심장 심근 조직 / 성숙
   1. 10 ㎖의 B27의 (인슐린) 보충 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 스톡 용액 5 ㎖를 500 ㎖의 RPMI 1640을 조합하여 RPMI II 분화 배지 (표 1)을 준비한다. 4 ℃에서 50 ㎖ 튜브에 얼음에 나누어지는, 저장.
   2. (주 11, 차별화 7 일)도 각에서 (인슐린 제외) RPMI 차별화 미디어를 제거하고 1 ml의 DMEM / F12 씻어. 각 (인슐린) 새로운 RPMI 차별화 미디어 II 2 ㎖ 잘 교체하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
      주 : 자율 박동이 제 7 및 10 일 사이에 관찰되어야 매질이 시간 동안 관찰되지 않으면, 그것이 일반적으로 불량한 분화 효율을 나타낸다. 이 프로토콜은 박동을 관찰하기위한 노력의 일환으로 하루에 15 일까지 계속 될 수 있지만 박동이 하루 15 관찰되지 않는 경우는 일에 최고새로운 차별화 예술.
   3. (주 12 ~ 24, 차별화 날 8-20) 매일, 기존의 차별화 미디어를 제거하고 신선한 RPMI 차별화 미디어 II 2 ㎖로 교체 박동 단층의 세포 성숙과 조직을 허용하는 잘 (그림 1 층, 비디오 그림 1 당 ).
      주 : 잔류 세포사에 따라, 차별화 날 (10)을 통해 1 mL의 DMEM / F12로 세정 할 필요가있다.

3. (주 24, 차별화의 날 20) 심장 근육 세포와 섬유 아세포와 같은 세포의 분리

1. 단일 플라이에서 세포를 떼어 놓다
   1. 차별화 용지를 제거하고 1 ml의 PBS로 한번 씻어.
   2. 각 웰에 효소 분해 용액 (0.04 % 트립신 / 0.03 % EDTA) 1 ㎖의 단일 층을 해리.
   3. 10 분 동안 인큐베이터에 플레이트를 이동합니다. 한편, 트립신 중화 용액 6 ml의 ROCK 억제제의 12 μl를 추가합니다.
   4. GentlY는 트립신 중화 용액 플레이트의 각 웰에 ROCK 억제제를 함유하는 트립신 중화 액 1ml를 추가한다.
   5. 멸균 전송 피펫을 사용하여 부드럽게 세포 클러스터를 깨지 잘 각각 섞는다.
   6. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 6 웰 플레이트의 모든 12 ml에 전송합니다.
      주 : 6 개의 웰 플레이트는이 프로토콜에서 사용되기 때문에, 두 개의 15-㎖의 튜브가 필요하다.
   7. 다음 한 판의 잘, 그리고로 전송 PBS의 3 ㎖를 순차적으로 접시에 남아있는 세포를 수집하기 위해 각 후속 아니라 동일한 3 ㎖를 전송합니다. 웰 세포를 포함하는 15 mL의 동일한 원심 분리 튜브에 남아있는 마지막에서 3 ㎖를 옮긴다.
   8. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 펠렛.
2. FACS에 의해 라이브 셀의 정렬을 위해 세포를 준비
   1. ROCK 저해제 50 μl의 빙냉 PBS로 45 ml의 태아 소 혈청을 5 ml를 첨가하여 염색 버퍼를 준비한다.
   2. 셀 화소에서 뜨는을 제거(3.1.8에서)하자 염색 버퍼의 1.2 용액에 재현 탁.
   3. 얼음에 새로운 사전 냉장 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 200 μl를 옮긴다. 이것은 부정적인 염색 제어됩니다.
   4. (: 500 희석 1)의 4 μL CD90-FITC (1 : 250 희석) 2 μL SIRPα-PE / Cy7을 얼음에 새로운 사전 냉장, 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포 현탁액의 나머지 1 ml의 이동 및 추가 . 조심스럽게 전송 피펫으로 세포 현탁액을 혼합하고 얼음으로 돌아갑니다.
   5. 1 시간 동안 4 ℃에서 얼음에 로커 진탕, 음성 대조군 샘플 모두 부화.
   6. 두 개의 15 mL의 원심 분리 튜브 (인슐린) RPMI 배지 3 ㎖을 첨가하여 시료 채취 튜브를 준비한다. 각 튜브에 ROCK 저해제의 3 μl를 추가하고 얼음에 저장합니다.
   7. 39 ° C에서 5 분 동안 300 XG에서 염색 된 세포를 펠릿 린스 당 빙냉 PBS 중 적어도 10 ㎖로 두 번 씻어.
   8. 염색 버퍼 5 ㎖에 DAPI (1 μg의 / ㎖) 1 μl를 추가합니다. 부드럽게전달 피펫을 사용하여 함유 DAPI 염색 완충액 1-3 ml의 시료 펠릿을 재현 탁.
   9. 음성 대조군에 (더 DAPI가 추가되지로) 염색 버퍼의 500 μl를 추가합니다.
   10. 부드럽게 세포의 덩어리를 제거하고 얼음에 FACS 튜브 폴리스티렌 전송하는 데 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 음성 대조군과 샘플을 모두 필터링합니다. 바로 셀 소터에 샘플을 가져.
   11. 설립 살아있는 세포와 유사하게 정렬 방법 ^(18), (음 DAPI)를 살아있는 세포에 대한 선택 게이트를 설정하는 음성 대조군을 사용하고 FITC ⁺ (즉, CD90 ⁺ 섬유 아세포) 및 PE / Cy7 ⁺ (즉, SIRPα가 ⁺ 심근를 모두 수집 ) 20 PSI (그림 2)에서 독립적으로 인구.
       주 : 게이트를 설정 한 후, 대조군은 심장 트로포 닌 T-위한 염색하여 분화 효율을 결정하기 위해 4 % PFA로 고정 될 수있다.
       참고 : 일부 연구자를 사용하는 것을 선호아이소 타입 컨트롤보다 흠 제어 비특이적 항체 결합에 대해 보상하기 위해 게이트를 설정한다. 소위 형광 빼기 하나 (FMO) 컨트롤은 또 다른 가능성이다. 때문에 FITC, DAPI 및 PE-Cy7 신호의 명확한 바이 모달 분포, 우리는 보수적 가능성이 일부 사실 긍정을 제외 있지만 오탐 (false positive)을 최소화하는 데 도움이 긍정적 인 게이트로까지 목표로, 긍정적 인 인구에서 게이트.
3. 조직 공학을위한 준비에 셀 재 응집
   1. 셀 정렬 후, 10 % 신생아 소 혈청, 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 % 및 0.2 % 암포 테리 신 B ( "NBS 매체")을 함유하는 DMEM 1 ㎖에 수집 튜브 및 재현 탁 모두 펠렛.
   2. 60cm ² (10cm 접시) 당 2 백만 세포의 밀도로 배양 접시를 처리 한 비율이 아닌 조직 배양에서 세포를 결합 판 : 3 SIRPα ⁺ 및 CD90 ⁺ 세포 재결합. NBS 미디어와 (10)의 10 ML을 추가1, ROCK 저해제 Y-27632의 리터.
   3. 작은 클러스터로 셀 재 응집을 허용하도록 48 시간 동안 조직 배양 배양기에서 세포 현탁액을 놓는다.

4. 인간의 심장 조직 공학

1. 멀티 조직의 생물 반응기를 제조
   참고 : 그림 3A의 그림을 보완하기 위해, 상세한 생물 반응기 설계 회로도와 CAD 파일은 저자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
   1. 기계 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (9) X 33 X 3.25 mm의 입방에 0.5 mm 직경의 여섯 일정한 간격으로 구멍을 드릴로 PDMS 마스터 몰드.
   2. 엔드 밀, 기계 25 X 35 X 11mm ^(3)를 측정 폴리 설폰에서 프레임을 사용. 프레임의 목적은베이스 플레이트의 웰과 정렬 (위 만든 캐스트로 구성) PDMS 게시물을 유지하는 것입니다.
   3. 1 mm 엔드 밀을 사용하여, 기계 6 우물 (6 × 1 × 1mm ^3), 블랙 폴리 20 × 40 × 5 내지 ³ mm 조각으로 떨어져 4mm테트라 플루오로 에틸렌은베이스 플레이트를 형성한다.
   4. / 비 w 1w 여섯 힘을 감지 게시물의 두 행을 만들기 위해 사용자 정의 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 금형 (단계 4.1.1)에 추가하고, 밤새에서 품어 : (10)의 탄성베이스와 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)에 대한 경화제를 혼합 80 ℃에서 진공. 경화 후, 부드럽게 마스터 금형에서 PDMS를 제거하고주의 깊게 향상된 대비 및 자동화 된 실시간 포스트 편향 추적을위한 검은 영구 마커와 각 게시물의 상단을 표시합니다.
      참고 : 폴리 테트라 플루오로 에틸렌은 매우 부드럽고 쉽게 손상 될 수 있습니다. 시스템 일관성 PDMS 포스트 형상의 수명을 보장하기 위해 캐스팅 PDMS에 마스터 몰드 전에 청소시주의하십시오. 0.5 mm의 와이어를 사용 후 소식 구멍 청소하지만 구멍의 내부를 긁어하지 않도록주의를 기울여야하는데 사용될 수있다.
      주의 : 다른 실온에서 수 시간 동안 진공 하에서 탈기 PDMS 인 후 주위 압력에서 혼합물을 경화하자.이는 경화 공정 동안 PDMS 형성 적은 잔류 기포가 발생할 수있다.
   5. 증기 오토 클레이브의 모든 구성 요소를 소독.
      참고 : PDMS 마스터 몰드 (단계 4.1.1) 및 폴리 설폰 프레임 (단계 4.1.2)를 모두 재사용합니다. 캐스트 (단계 4.1.4)에서 생성 된 PDMS 포스트는 재사용 만 약 10 사용을위한 것입니다. 마스터 몰드를 사용하여 필요에 따라하지만, 더 PDMS 게시물을 작성할 수 있습니다.
2. Reaggregated 심장 세포를 수집
   1. 인큐베이터에서 reaggregated 세포를 제거하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 재 응집 매체의 10ml를 전송합니다.
   2. PBS의 3 ㎖와 함께 접시를 씻어 재 응집 매체를 포함하는 같은 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 린스를 전송합니다.
   3. 10cm 접시에 0.04 % 트립신 / 0.03 %의 EDTA의 3 ML을 추가하고 5 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.
   4. 5 분 후, 전체 셀 dissocia 있도록 10X 배율로 반전 화합물 현미경 검사 판접시에서 기. 일부 잔여 클러스터가 계속 연결된 경우, 부드럽게 덩어리를 분리 할 수​​있는 판을 선동. 클러스터가 부착 된 상태를 유지하는 경우, 다른 2 ~ 3 분 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. 이상보다 10 분 발생할 수있는 중요한 세포 사멸을 배양하지 마십시오.
   5. 일단 모든 세포는 트립신 중화 용액 3 ㎖을 추가 분리된다. 조심스럽게 재 응집 매체를 포함하는 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포를 트립신 용액 및 전송로 중화 용액을 혼합하고 PBS로 한번 씻어.
   6. PBS 5 ㎖와 전체 요리를 씻어 세포를 포함하는 동일한 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
   7. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 펠렛.
   8. 상층 액을 제거하고 NBS 미디어 1 ㎖의 펠렛을 재현 탁하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다.
   9. 실온에서 5 분 동안 300 XG에 펠릿 상청액을 제거한다. 심장 세포 (CD90 ⁺ 기질 세포와 SIRPα ^+의 myoc, 킬로바이트)는 이제 조직 건설을위한 준비가되어 있습니다.
3. (선택 사항) 관심 보충 세포를 수집
   참고 : SIRPα 심근 ⁺ CD90 ⁺ 및 ^섬유 아세포와 같은 세포를 포함하는 조직의 정의뿐만 아니라, 조직이 기능에 미치는 영향을 심문 밖의 관심 셀을 추가하는 것이 가능하다. 예를 들어 쥐의 중간 엽 줄기 세포는 쥐의 심근 조직 공학 ^(1)의 기능을 향상시키는 것으로 나타났다. 다음 선택적 단계는 정의 된 시스템에 대한 보충 세포의 컬렉션을 설명합니다.
   1. 관심 기업 셀형 0.25 % 트립신 / EDTA 0.1 %를 사용하여 (예를 들어, 중간 엽 줄기 세포)를 수집한다.
   2. 다음 관심 세포 유형에 적합한 세포 배양 배지 5ml에 재현 탁하고 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 펠렛. 예를 들어, 중간 엽 줄기 세포를 들면, DMEM 20 % 소 태아 혈청, 문화 C에 페니실린 - 스트렙토 마이신 1 %와 0.2 % 암포 테리 신 B-보충 사용ELL 학생.
   3. , 혈구를 이용하여 세포 수를 수행 한 후 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 다시 세포 펠렛.
   4. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 배양 배지와 전사를 1ml 상등액 재현 탁을 제거한다.
   5. 실온에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 펠렛.
   6. 뜨는을 제거합니다. 추가 셀은 조직 건설을위한 준비가되어 있습니다.
      주 : 보조 세포 조직 총 세포 수의 10 %의 농도로 첨가하는 경우, 각 조직 500,000 심장 세포 (CD90 ^{+ 간질} 세포가 모두 포함 같이 다음 정의 조직에 대해, 이것은 티슈 50,000 보완 세포를 필요 및 SIRPα ^+의 근육 세포).
4. 인간 공학 심장 조직 만들기
   참고 : 실온에서 얼음에 모든 솔루션과 세포를 저장합니다. 아래에 나열된 모든 볼륨은 조직 당이다. 일반적으로, 조직은 약 6 개의 구성 될 수있는 6- 웰 PL심장 분화의 ATES.
   1. 1 M NaOH를 1.5 μL, 10 배 PBS의 9.6 μL 멸균 초순수 탈 이온수의 24.9 μL와 ml의 3.125 밀리그램 /에 5 ㎎ / ㎖ 콜라겐 주식의 60.0 μl를 희석.
      중요한 단계 : 기포가 적절한 조직 형성을 방해하므로 준비하는 동안 각 솔루션에 기포의 도입을 피하십시오.
   2. 콜라겐 믹스를 만들기 위해 모두 10 배 MEM의 12.0 μL 및 희석 콜라겐 혼합물에 0.2 N HEPES pH를 9를 추가합니다. 콜라겐 믹스 기포의 유입을 방지하기 위하여 15 mL의 원심 분리 튜브의 측면 아래 두 솔루션을 추가한다.
   3. 콜라겐 혼합 용액을 0.9 밀리그램 / 최종 농도 기저막 매트릭스를 넣고 최종 혼합 조직을 생성하기 위해 얼음에 저장한다. 콜라겐의 최종 농도는 ㎖ / 2 mg을해야한다.
   4. 25 ㎕의 최종 부피 기준으로 티슈 믹스 reaggregated 셀 500,000 추가 (+ 심근 섬유 아세포 농도 20,000,000 / ㎖ 임) 및 채우기무 세포 NBS 매체 또는 관심 (예를 들면, 중배엽 줄기 세포)의 부가 셀 타입 50000 세포와 잘 혼합하거나 함께 조직에도 세포 현탁액을 형성한다.
      참고 : 보충 세포의 수는 다른 응용 프로그램에서 달라질 수 있습니다. 여기에 10 %의 보충이 사용된다.
   5. 우물에 기포를 도입없이 치료, 피펫 생물 반응기에서베이스 플레이트 여섯 각 웰에 세포 현탁액 25 μL와.
   6. 포스트의 한 쌍은 각 웰의 세포 현탁액을 포함하는 입사되도록 대향 소식 6 쌍을 형성하고, 폴리 설폰 프레임의 양측에 PDMS 힘 센서의 두 행 푸시 후베이스 플레이트의 상부에 프레임을 반전한다.
      참고 : 폴리 설폰 프레임이 PDMS의 정렬에 도움이 탭이 포함되어 있습니다.
   7. 조심스럽게 다음 10cm 접시의 안쪽 표지없이 접시를 배치, 60mm 접시에, 아래베이스 플레이트, 생물 반응기를 배치, 상단에 10cm 커버를 배치하고있는 전체 생물 반응기 어셈블리를 이동조직 배양 인큐베이터, 겔 티슈 2 시간 대기.
   8. 2 시간 후, 배양기에서 생물 반응기를 제거한베이스 플레이트를 커버 할 정도로 전체 어셈블리 NBS 매체 14 mL로 추가. 인큐베이터로 돌아 가기, 매일 미디어의 절반을 변경합니다.
   9. 48 시간 후, 신중하게, 부드럽게 한 번에 프레임 떨​​어져 몇 mm를베이스 플레이트의 각면을 이동하여베이스 플레이트를 제거 미디어를 변경 한 다음 조직은 미디어에, 아래로 향하게, 생물 반응기를 반환합니다.
   10. 매일 NBS 문화 미디어의 절반을 변경 계속합니다.
       참고 : 조직의 자발적인 수축이 빠르면 5 일 등 7 측정 가능한 트 힘을 생성, 빠르면 3 일 정도 조직을 건설 한 후 관찰 할 수있다.

Results

심장 근육 세포를 얻으려면, Boheler와 리안 분화 방법의 약간 수정 된 버전은 ^{30, 31을} 사용합니다. 분화 세포 성장의 로그 단계에서 시작되는지, 또한 출발 인구 (약 75 %가 최적 임) 정렬 후 세포의 가능한 수를 얻기 위해 충분히 융합 인 것이 필수적이다. 일반적 H7 hESCs는 들어 37 ° C로 유지 필수적 8 미디어 및 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 6- 웰 접시의 웰 당 140,000 hESCs는 밀도에서 도금은 도시 된 바와 같이, 분화를 시작 4 일 후에 충분히 융합 배양 수득 그림 1A에서 - D. 인슐린 분화 과정 동안 ³² 심장 명세서 인슐린 가능한 미디어 (분화 미디어 I, 표 1)을 방해하기 때문에 분화의 처음 10 일 동안 사용된다. 분화 GSK3 억제제 CHIR99021의 애플리케이션을 통해 시작되면중요한 세포 사멸 (그림 1...

Discussion

정의 인간 공학 심장 조직 (hECT)의 건축은 인간의 심장 심근 기능의 일관성과 신뢰성있는 모델을 제공 할 수 있습니다. 결정적으로, 시스템의 모든 세포 및 세포 외 성분은 공지되어 있으며, 따라서 분화 과정으로 인한 다른 미지의 세포 유형의 교란의 영향을 제거하고 원하는대로 조작 할 수있다. 빠른 세포 증식과 높은 수율의 균형을 위해서, 이상적으로 분화 사일 도금 후 hESCs는 75 %의 합류점에서 시작하는 것이 바람직하다. 또한, 정렬 후 세포 해리 재 응집 둘 중 ROCK 억제제 Y-27632의 사용은 크게 세포 생존 능력을 향상시킨다. 분화 과정의 자율 박동 근세포의 존재는 분화 효율 보건의 중요한 지표이다. 자연 박동이 관찰되지 않으면이는 효과 시약 또는 손실로 인한를 가난한 분화 효율을 나타낼 수있다줄기 세포의 다 능성의.

조직 건설하는 동안, PDMS 포스트는 수축 기능을 측정하기 위해 오랫동안 지속될 잘 구성된 조직을 만들 수있는베이스 플레이트의 채널을 올바...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture	Company	카탈로그 번호	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	DMSO에 2.5mg/ml 스톡을 준비하고
Insulin Life Technologies로 B27을 Insulin	없이	B27 17505055
	생명 기술	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	만들기 6 μ M 재고, 그 다음 분취 및 -20 에 저장; °C입니다.
필수 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 인간 배아 줄기 세포	WiCell	WA07
hESC 인증 매트릭스, Corning Matrigel	Corning	354277	4°C에서 얼음 위에서 해동; C 하룻밤 다음 분취 150 μ l을 별도의 튜브에 넣고 -20 에 보관하십시오. °C입니다.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	10mM 스톡 및 부분 표본을 생성합니다. -20 °에서 보관하십시오. C
신생아 송아지 혈청	Life Technologies	16010159
비효소 해리 시약: 부드러운 세포 해리 시약	줄기세포 기술	7174
페니실린-스트렙토마이신	코닝	30-002-CI
RPMI 1640	라이프 테크놀로지	11875-093	냉장 보관
Y-27632 (ROCK 억제제)	Stemgent	04-0012	10mM 재고 농도로 재현탁, 분취 및 -20 에서 보관; °C. 동결 해동 주기를 피하십시오.
Cell Sorting	Company	카탈로그 번호	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
효소 해리 시약: 세포 분리 키트 I (0.04 % 트립신/ 0.03% EDTA, 트립신 중화 용액 및 행크스 완충 염 용액)	PromoCell	C-41200
소 태아 혈청	애틀랜타 바이오로직스	S11250
SIRP&알파;-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	카탈로그 번호	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	옵션: 관심 보충 세포 수집용
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x PBS 패킷	Sigma-Aldrich	P3813
콜라겐, 소 유형 I	Life Technologies	A10644-01	얼음 유지
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
둘베코' s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials<	strong>Company	카탈로그 번호	코멘트
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Corning	352096
5 ml 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브	Corning		352235 통합 35 μ M 셀 스트레이너
50ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브	Corning	352070
6웰 플랫 바텀 조직 배양 처리 플레이트	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
폴리테트라플루오로에틸렌(테프론)	McMaster-Carr
Equipment	Company	>카탈로그 번호	Comments
Dissecting	Microscope Olympus	SZ-61	또는 이와 유사한, 고속 카메라를 부착할 수 있는 마운트가 있어야 합니다
. Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed 카메라	Pixelink	PL-B741U	또는 이와 유사하지만 정확한 데이터 수집을 위해 초당 100프레임을 사용할 수 있어야 합니다
플레이트 온도 제어			데이터 수집 중에 미디어 온도를 유지하는 데 사용됩니다.
Custom Materials	Company	카탈로그 번호	Comments
LabView Post-tracking Program			authors