방법 논문

NMR에 의해 실시간 효소 반응 속도 측정을위한 해산 동적 핵 편광 계측

DOI:

10.3791/53548

⸱

2016년 2월 23일

 ,  ,  ,  ,  , 
1LCBPT - UMR8601, Institut de Chimie, Université Paris Descartes, 2Institute of Physics of Biological Systems, EPFL, 3PARCC - INSERM U970, Université Paris Descartes

이 논문에서

요약

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용해 동적 핵 분극(DNP)이 제공하는 감도 향상으로 NMR 및 MRI에 의해 실시간으로 대사 과정을 수행할 수 있습니다. 효소 반응 연구를 위해 설계된 전용 용출 DNP 설정의 특성과 성능에 대해 설명합니다.

초록

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NMR 기반 조사의 주요 제한은 낮은 감도이다. 이 때문에 대사 변환의 실시간 NMR 측정을 방지, 긴 획득 시간에 대한 메시지를 표시합니다. 용해 DNP 통해 과분극 감도의 일부 전자 간 핵 스핀 분극 전송 따른 대형 밖으로의 평형 자화 핵 덕분 발행 우회. 얻어진 고 NMR 신호는 실시간으로 화학 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 과분극 NMR의 단점과 관련된 완화 시간 상수의 주문에 유리한 경우에는 핵 스핀 종 완화 시간 상수, T (1) 또는 주문에 통상 신호 수집에 대한 가능한 제한 시간대에 존재 결합 된 핵의 단일 상태, T LLS. 내인성 분자 대사 비율의 세포 흡수는 종양 발생 및 약물 반응에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 뉴merous 이전 과분극 NMR 연구는 생체 내에서 효소 활성을 모니터링하기위한 대사 기질로서 피루브산의 관련성을 보여 주었다. 이러한 작업은 특히, 분극 NMR에 의해 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 존재하에 피루브산 투 락트산 전환율을, 효소 반응의 연구에 필요한 실험 장치 및 방법의 상세한 설명을 제공한다.

서론

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동적 핵 편광 (DNP), 1,2- 즉, 핵 스핀 분극, '최대'와 '아래'스핀 인구 (P = 사이의 불균형을 향상시키기 위해 설계된 기술 [N ↑를 - N ↓] / [N ↑ + N ↓), 먼저 1950 년대에 도입되었다. 이러한 13 C 핵 스핀은 일반적으로 1 K 정도의 온도에서 생물학적 응용 프로그램에 대한 돌파구가 와서 3.357의 자기장 T. 3,4에 유리한 조건에서 P = 10 -1까지 편광 될 수있다 배. 저온에서 얻어진 높은 핵 편광 상태를 유지하면서 가열 된 물을 냉동 편광 샘플을 용해시키는 것으로 구성 용해 DNP 개발 2000 년대 초반 5 액상 NMR 신호 향상 10 3 -10 4에 비해 공유지RT NMR 조건 열적 편광. 용해 DNP 따라서 1 초 이하의 시간 해상도와 NMR에 의해 모니터링 역학 있도록 실시간 시츄 비 침습적으로 측정 생화학 반응 속도하는 방법을 제공 6

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프로토콜

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주 : 모든 데이터 분석은 상용 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다.

1. 편광 솔루션을 준비

  1. 1.12 M (13) C 표지 피루브산 나트륨 2 mL를 준비 (NA + [CH 3 COO -CO- 13] - 기질) 용액 라디칼 TEMPOL 33 mM의 도핑 (4- 히드 록시 2,2,6,6- 테트라 -1- 옥실, 편광 에이전트) 4 2 : 1 D 2 O / D 13 C 관측 6 에탄올. 주의 : 취급주의로 인해 D (6) 에탄올의 가연성 자연에주의해야합니다.
  2. 라디칼 농도가 달성 편광면에서 최적인지 확인합니다.
    1. (30 MM 또는 35 mm로, 예를 들어) 약간 점 1.1에서 용액의 급진적 인 농도를 변경합니다.
    2. 반복적으로, 고체 개선을 결정한다 (스텝 3), 최대 향상 리드 라디칼 농도를 찾아.

2. Polarizat이온

  1. 재사용 대기 절차를 통해 DNP의 저온 유지 온도를 낮 춥니 다. 그라 이오 스탯 소....

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결과

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용해 DNP를 사용하여 NMR 신호 이득
DNP 효과는 시료의 마이크로파 조사 하에서 통상적 안정한 라디칼 분자, NMR 비활성 핵에 부대 전자의 스핀 분극 높은 전송로로 구성된다. 가장 자주 사용되는 활성 산소는 TAM (OXO63) 및 TEMPOL이다. 4 편광 절차 TEMPOL를 사용하여가 '교차 편광'에 의해 최적화 될 수있다. (25)

고체 상태에서 최대 핵 편광을 얻기 위해 안정한 라디칼의 농도를 최적화하는 것은이 기술의 성공에 중요하다. TEMPOL 최적 농도는이 연구의 실험 조건에서 33 밀리미터이었다. 선택된 기질이 편광 실시간의 효소 전환을 수행하기에 충분하다.

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토론

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용해 DNP NMR 실험의 핵심 포인트는 실험에 필요한 최저 생성물의 농도뿐만 아니라, 수행 및 (ii) 수명 수 신호 인수의 수를 결정 (I) 기판 달성 편광 레벨 자화, 편광 검출 위치 사이의 기판의 변형 속도 전송의 지속 기간과 비교. 본원에 기재된 용출 DNP 설정의 분사 시스템은 거의 같은 3-4 초 샘플 전송을 허용한다. 전송이 S. 보웬과 C. Hilty에 의해 제안 된 방법에서와 같이 빠른 아니었지만, 피루 베이트 26 편광 손실로 인해 낮은 필드에 적당한 길이 휴식에 한정되었다. [1-13 C] 프로피온산 긴 카복실산 핵 T 1, 10-3 U / ml의 낮은 농도에서 LDH 통한 광속을 측정 할 수 있습니다.

그만큼 높은 신호 대 잡음비는 DNP가 하나 더 낮은 [1-13 C] 프로피온산의 농도 및 효소 낮은 전환율에 민감 할 수 있다는.......

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공개 사항

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저자들은 금전적 이익을 경쟁하는 것을 선언하지

감사의 글

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저자는 유용한 토론 박사 F. Kateb 박사 G. BERTHO뿐만 아니라, 장비의 선택과 어셈블리의 도움 박사 JJ 반 데르 KLINK 감사합니다. AC는 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (PPOOP2_157547을 부여)에 의해 지원되었다. 우리는 파리 소르본 시테 (NMR @ 컴, DIM 웹 로그 분석, 빌 드 파리, 파운데이션 부문 드 라 공들인 MEDICALE (FRM ING20130526708) 및 Parteneriat 휴 버트 Curien 브랑 쿠지 32662QK에서 자금 조달을 인정합니다. 우리 팀은 Equipex 프로그램 파리 - 엉 - 공명의 일부입니다 및 CACSICE.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DNP 편광자Vanderklink s.a.r.l (스위스)시료 편광을 위한 저온 유지 및 전자 장비
진공 시스템 구성 요소Edwards vacuum (프랑스)다양한

- 터보 분자 펌핑 설정

- 멤브레인 펌핑 설정

- 고용량 루트 펌핑 시스템

- 진공 피팅 및 구성 요소

DNP 3.35T MagnetBruker (프랑스)
500 MHz NMR 분광계Bruker (프랑스)
Origin 8.0OriginLab (미국)데이터 분석 소프트웨어
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13CSigma Aldrich (프랑스)490709
ETHANOL-D6, 무수, 99.5 ATOM % D시그마 알드리치 (프랑스)186414
  4-Hydroxy-TEMPO 97%Sigma Aldrich(프랑스)176141
중수소산화물Sigma Aldrich(프랑스)151882
감소 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)시그마 Aldrich(프랑스)
에틸렌-디아민테트라아세트산(EDTA)시그마 Aldrich(프랑스)
티오트레이톨(DTT)시그마 Aldrich(프랑스)
인산염 완충액, pH =  7.0Sigma Aldrich (프랑스)
LDH 효소 Sigma Aldrich (프랑스)L-2500
소 혈청 알부민, BSASigma Aldrich (프랑스)
디

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
  2. Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).
  3. Wolber, J., Ellner, F., et al.

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