적절한 번역 후 변형을 통한 진핵 단백질의 실험실 규모 생산은 상당한 장벽을 나타냅니다. 다음은 포유류 발현 시스템을 사용하여 단백질 발현을 위한 신속한 확립 및 전환을 제공하는 강력한 프로토콜입니다. 이 시스템은 선택적 아미노산, 단백질의 선택적 표지 및 글라이칸 조성의 저분자 조절제를 지원합니다.
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정오 공지
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요약
초록
복잡한 번역 후 수정 재조합 단백질을 생산하는 기술은 구조와 기능 연구를위한 주요 과제를 나타냅니다. 일시적으로 형질 감염된 포유 동물 세포주로부터 신속한 확립하고 높은 회복 자연스럽게 ER 및 골지체 매개 분비 경로를 통해 표출되는 단백질을 발현하는 효과적인 수단이 장벽을 해결하고있다. 여기서 인간 HEK293F 및 높은 단백질 수율을 위해 설계 포유 동물 발현 벡터로 형질 감염된 HEK293S 세포 라인을 사용하여 단백질 발현을위한 하나의 프로토콜이다. 이 시스템의 적용은 문화의 리터 당 회수 정제 단백질의 95-120 mg의 사이의 수익률로 표현 세 대표하는 당 단백질을 사용하여 설명된다. 이들 단백질은 인간과 쥐 FcγRIIIa α2-6 시알 산 전이 효소, ST6GalI 모두 N 말단 GFP 융합으로 표현뿐만 아니라 변형되지 않은 인간 면역 글로불린 G1 된 Fc이다. 이 강력한 시스템 요로 감염동위 원소 적으로 농축 된 단백질 및 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법을 이용한 구조 연구 탄수화물의 발현에 적응할 혈청 배지를 활용합니다. 또한, N 글리 칸의 조성물은 수율을 감소시키지 않는 방식으로 특정 당쇄 변형을 방지하는 작은 분자를 첨가함으로써 조절 될 수있다.
서론
구조와 기능에 대한 자세한 분석을 위해 적절하게 접혀 및 번역 후 변형 된 인간 단백질의 높은 수율을 생산하는 것은 중요한 과제로 남아. 발현 시스템의 많은 수의 네이티브와 같은 기능과 행동 재조합 단백질을 생산하는 사용할 수 있습니다. 효모, 식물, 곤충 및 포유 동물 시스템은도 1 ~ 4를 설명하지만 세균 발현 시스템, 주로 대장균 균주 인해 이들 발현 시스템의 단순성, 연구 분야에 가장 접근하고 일반적으로 사용되는 도구를 나타낸다. 그러나, 이들 시스템들의 대부분은 표적 단백질의 적절한 번역 후 변형 불가능하다. 바브와 Moremen 실험실의 근본적인 관심은 적절한 당질과 진핵 생물의 단백질을 생산하고있다. 대부분의 인간 단백질 (5) 적절한 기능에 적합한 글리코 실화를 필요로한다.
진핵글리코 실화가 광범위한 기계 모두 아스파라긴 (N)를 포함 변형의 다양한 범위를 제조 할 수있다 - 세린 / 트레오닌 (O)는 복합 글리 칸 6 -linked. 이것은 인간 단백질의> 50 % 7 N 글리코 실화가있는 것으로 추정된다. 글리 칸은 몇 가지 이름 인자 IX 같은 치료 단일 클론 항체, 에리트로 포이 에틴, 혈액 응고 인자 등 많은 단백질의 필수....
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프로토콜
이 프로토콜 또는 HEK293F 감염된 HEK293S 세포를 사용하여 표현하기에 충분하다.
1. 셀 설립
- 문화 접종
참고 : 모든 문화 조작 절차는 BSL-2 시설에서 실시되어야하며, 각 항목은 수용액에서 70 % 에탄올로 분사하여 살균해야하는 바이오 안전성 캐비닛에 가져왔다.- 135 rpm으로, 80 % 습도에서 인큐베이터 쉐이커를 운영하고 8.0 % CO 2, 37 ℃에서. 작업에 적어도 1 시간 전에 바이오 안전성 캐비닛의 UV 램프 "의"를 켭니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 물 욕에서 밀봉 된 중간과 중간 B 병 Prewarm.
- 수용액에 70 %의 에탄올로 분무하여 벤트 캡, 피펫, 피펫과 데워진 미디어 병 125 ml의 삼각 플라스크 성장 살균. 바이오 안전성 캐비닛에 이러한 항목을 놓습니다. 참고 : 125 ml의 삼각 문화 플라스크를 덮고 바깥 쪽 플라스틱을 소독하고, 때 나는 만 제거바이오 안전성 캐비닛 내부의.
- 흔들어 혼합 (이후 신선한 배지로 지칭) 부드럽게 30 ㎖ 배양 용 26 중간 ㎖의 중간 B의 3 ㎖ (최종 배양의 10 %)을 회수하고, 125 mL의 삼각 배양 플라스크에 옮기고.
- 얼음에 배양 공간으로 이동 -80 ° C에 냉동....
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결과
높은 수준의 단백질 발현 및 순도
이 최적화 된 발현 시스템은 단백질의 글리코 실화를 고 수율로 생성. 전형적인 패턴의 IgG1-FC (도 1)의 발현에 나타낸다. 이 경우, 주 0 조 배지에서 가용성 발현 분획을 사용하여 분석된다 주 5. 단백질 발현까지 1 일 (희석)이어서 형질 일 이후 배양 일이다. 배양 된 분취 량의 희석 배양 후 3 시간이 인출되었을 단백질 발현의 매우 소량 일 1에서 관찰되었다. 이것은 배지에서 뚜렷한 녹색을 표시 GFP 표지 된 단백질과 시각화를 용이하다. 이러한 증가는 5 일 하루 4 주 (5) 사이에 관찰의 날 (5)에 2 일에서 GFP - FcγRIIIa 및 GFP - ST6GalI의 표현에 대한 표현에 유의 한 증가가 관찰되지 않았다, 세포가 있었다 <50 %따라서 가능한 배양 단백질 분.......
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토론
이 프로토콜은 S 또는 HEK293F 세포의 일시적인 형질 감염을 통해 단백질 발현을 도시한다. 바브와 Moremen 실험실 설립 형질 최적 조건은 고효율 형질 감염을 달성 셀 밀도 및 시약 농도의 중요한 조합을 채용한다. 이 프로토콜을 구현하는 중요한 고려 사항은 다음과 같습니다 (일관된 문화는 시간을 두 배로 포함) 형질 전환 이전에 안정적인 문화를 유지하는 단계; 95 % 이상 세포 생존 능력 (1 × 106 세포 / ㎖ 24 시간 이전에 형질 전환에에 희석 세포에 의해 달성) 적극적으로 성장하는 세포의 형질; 형질 세포의 밀도가 90 % 중간 10 % 중간 B를 함유하는 배양에서 생존> 95 % (형질 밀도) 6 10 × 2.5-3.0 사이 살아있는 세포 / ml이어야한다; 그리고, ml의 3 μg의 / 각각 31 9 μg의 / ㎖에서 PEI 추가하기 전에 DNA를 첨가하는 단계; 중간 접점에 1 : 24 시간 후 형질의 문화 1을 희석ining 4.4 m.......
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공개 사항
모든 저자는 이 원고에 대해 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 재정적 보조금 K22AI099165 (AWB)에 의해, P41GM103390 (KWM)와 국립 보건원에서 P01GM107012 (KWM), 아이오와 주립 대학에서 생화학, 생물 물리학 및 분자 생물학의 로이 J. 카버 부서에서 기금에 의해 지원되었다 . 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
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재료
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| 생물 안전 캐비닛 | 주식회사 누에어레 | CellGard ES NU-S475-400 | Class II, Type A2 생물학적 안전 캐비닛 |
| 인큐베이션 쉐이커 | INFORS HT | Multitron Cell | |
| 미디엄 A: 프리스타일 익스프레션 미디엄 | Life Technologies | 12338-018 | |
| 매체 B: ExCell 293 무혈청 매체 | 시그마 | 14571C | |
| 125 통풍 캡이 있는 삼각 플라스크 | Corning Incorporated/Life Sciences | 431143 | |
| 250 통풍 캡이 있는 삼각 플라스크 | Corning Incorporated/Life Sciences | 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 ml 일회용 혈청학 피펫 | Fisher Scietific | 13-676-10B | |
| 10 ml 일회용 혈청학 피펫 | Fisher Scietific | 13-676-10J | |
| 25 ml 일회용 혈청학 피 | Fisher Scietific | 13-676-10K | |
| 피펫터 (Pipet-Aid XP) | Drummond Scientific | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | 써모 사이언티픽 | SV30084.01 | |
| 슬라이드 계산 | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 자동 세포 카운터 | 바이오 라드 | 145-0102 | |
| 폴리에틸렌이민(PEI) | 폴리사이언스 Inc. | 23966 | 25mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 150mM NaCl(pH 7.5)을 함유한 완충액에 1mg/ml 농도의 원액을 준비합니다. PEI를 완전히 용해시킵니다. 0.22 &mu를 통해 살균; M 주사기를 걸러서 -20°C에서 보관합니다. |
| 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| 25mm 주사기 필터, 0.22 & M | Fisher Scietific | 09-719A | |
| Trisaminomethane (Tris base) | Fisher Scietific | BP152-1 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 222249 | |
| Trypton | Fisher Scietific | BP1421-2 | |
| 효모 추출물 | Fluka Analytical | 92144 | |
| 나트륨 염화물 | BDH 화학물질 | BDH8014 | |
| 플라스미드 정화 키트 | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | 물 속에 220 mM 의 재고 용액을 준비하고, 멸균 0.22 mm 필터를 통해 멸균한 후 -20°C에서 보관하십시오; C |
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| Glycine | Fisher Scietific | BP381-500 | |
| 10 kDa 분자량 컷오프 Amicon® 초원심 필터 | Millipore | UFC901096 | |
| 나트륨 도데실 설페이트 | ALDRICH | L3771 | |
| 베타-메르캅토에탄올 | ALDRICH | M6250 | |
| 글리세롤 | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| 아세트산, 빙산 | Fisher Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie 브릴리언트 블루 | 바이오 라드 | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS 보이저-DE PRO | Applied Biosystems | ||
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| 15N labeled L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| 비표지 L-페닐알라닌 | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2- 데옥시-2-플루오로-L-푸코스 | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-283123 |
참고문헌
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K.
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
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