진화 방법에 감독 사카로 마이 세스 세레 비지에 : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Summary

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

Introduction

감독 분자 진화는 효소 ^{1, 2를} 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 ^{3-5 목표를} 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 ^6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다.

세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 ^(8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 ^9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 ligninases의 분자 진화 (천연 나무 붕괴시 리그닌의 분해에 관여하는 산화 환원 효소) ^{13 ~ 14를위한} 도구와 전략을 설계 지난 십을 보냈다. 이 통신에서 우리는 준비 S.에서 화면 돌연변이 라이브러리에 대한 자세한 프로토콜을 제시 모델 flavooxidase, 아릴 알코올 산화 효소 세레 비지에 (AAO ¹⁵⁾ -, 즉 쉽게 많은 다른 효소로 번역 할 수있다. 효모 전지 장치 ^(16), 도움을 (상동 생체 그룹화에 의한 돌연변이 유발 조직 된 재조합 과정 모핑) 프로토콜은 초점 지시 진화 방법을 포함한다배양액 ⁽¹⁷⁾ 내로 분비 AAO 활성을 검출하기 위해 펜톤 반응을 이용한 다 민감 스크리닝 분석법.

Protocol

1. 돌연변이 라이브러리 생성

1. 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 ^(18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다.
   1. 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 - Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로.
      참고 : 여러 세그먼트가 독립 또는 결합 방식으로 ¹⁶ 모핑으로 공부하실 수 있습니다.
2. 돌연변이 유발 PCR에 의해 대상 영역을 증폭. 정의 된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 세그먼트 사이의 영역 (~ 50 bp의 각)를 중복 작성합니다.
   1. DNA 템플릿을 포함하는 50 μL (0.92 NG / μL), 90 나노 올리고 감각 (세그먼트 MI 세그먼트 M-II에 대한 AAO-BP에 대한 RMLN)의 최종 볼륨에서 대상 세그먼트의 돌연변이 PCR을 준비, 90 nM의 a를ntisense 프라이머 (세그먼트 M-II에 대한 세그먼트 MI 및 RMLC에 대한 AAO-92C), 0.3 밀리미터의 dNTPs (0.075 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 1.5 밀리미터의 MgCl _2, 0.05 mM의 MnCl _2, 0.05 이 U / μL의 Taq DNA 폴리머 라제. 프라이머 서열은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.
   2. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 2 분 (1주기) 95 ° C를; 45 초, 45 초 동안 50 ° C, 45 초 동안 74 ° C (28 회) 95 ° C; 10 분 (1주기) 74 ° C.
3. 초고 충실도 중합 효소와 비 돌연변이 영역을 증폭 및 돌연변이 세그먼트 및 / 또는 선형화 벡터 오버행 중복 해당 지역을 포함한다.
   1. 포함 된 50 μL의 최종 부피에 반응 혼합물을 준비 : DNA 템플릿 (0.2 NG / μL), 250 nM의 올리고 의미 HFF, 250 nm의 올리고 안티센스 HFR, 0.8 밀리미터의 dNTPs (0.2 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 (DMSO)와 DNA 중합 효소 iproof 0.02 U / μL. 프라이머 서열에 자세히 설명되어 <강한> 그림 1.
   2. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 30 초 (1주기) 98 ° C를; 10 초, 25 초 동안 55 ° C, 45 초 동안 72 ° C (28 회) 98 ° C; 10 분 (1주기) 72 ° C.
      참고 : 1.2에 설명 된 조건 (43) BP (플라스미드-M1 영역)의 1.3 중복으로; 46 BP (M1 지역-HF 영역); 47 BP (HF 영역-M2 영역) 61 BP (M2 인 지역 플라스미드) 효모에서 생체 접합에서 선호하는 (그림 1) 설계되었습니다.
   3. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 겔 추출 키트 (돌연변이 및 비 돌연변이) 모든 PCR 단편을 정제 하였다.
4. 약 50 염기쌍의 영역을 플 랭킹하는 것은 표적 유전자의 5'- 및 3'- 말단에 상동이 생성되도록 상기 벡터 선형화.
   1. 2 μg의 DNA, 7.5 U의 BamHI, 7.5 U을 XhoI, 버퍼 바 20 μg의 BSA 2 μl를 함유하는 선형 반응 혼합물을 제조20 μL의 최종 부피 m HI 배.
   2. 2 시간 40 분 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 그 후, 20 분 동안 80 ℃에서 불 활성화를 진행합니다.
5. 잔류 원형 플라스미드 (도 2)의 오염을 방지하기 위해, 아가 로스 겔 추출에 의해 선형화 된 벡터를 정제.
   1. 잘 기자로 인접에 반응 믹스의뿐만 아니라 나누어지는 (5 μL) : (V 승, 0.75 %) 세미 예비 저 융점 아가로 오스 겔의 메가 우물에 소화 반응 혼합물을로드합니다.
   2. 실행 DNA 전기 영동 (전극 사이에 5 V / cm, 4 ᵒC)과 메가 웰에 해당하는 아가 로스 겔을 분리하고 1X TAE 4 ᵒC에 저장합니다.
   3. 분자량 사다리 기자와 차선 얼룩. UV 빛 아래 밴드를 시각화합니다. 닉 위치 선형화 된 벡터 곳.
      주 : 정제 선형화 된 벡터의 품질이 criti이므로칼 요인은 효모에서 성공 재조합 및 조립, 반 예비 DNA 전기 영동 젤 염색을 피하십시오. 염료 및 겔 추출 UV 노광의 사용은 생체 내 재조합 효율 저하의 DNA 벡터의 안정성에 영향을 미칠 수있다. 독성 EtBr이 염료에 대한 대안으로, 젤 빨간색과 SYBR 염료는 일반적으로 겔 염색에 사용된다.
   4. UV 광이없는 경우,이 분리 될 수 있도록 염색 리포터 레인 닉의지도를 사용하여 메가 아니라 단편의 선형 벡터를 식별한다.
   5. 아가로 오스에서 선형화 된 벡터를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따른 상업 겔 추출 키트를 정화.
      참고 : 항생제와 영양 요 마커를 사용하여 높은 복사 에피 솜 셔틀 벡터 : 우리는 효모 GAL1 프로모터의 제어하에, 우라실 독립적 인 암피실린 내성 pJRoC30 벡터를 사용이 예에서.
6. 같은 몰 마일을 준비PCR을 조각의 xture과 2에서 선형화 된 벡터와 함께 혼합 : 선형화 된 플라스미드없이 100 개 미만 NG로, 1 비율 (몰 라이브러리 / 오픈 벡터의 테스트 다른 비율은 좋은 형질 전환 수율을 달성하기 위해).
   1. 그 농도 및 순도를 결정하기 위하여 PCR 단편을 260 nm 내지 280 nm에서 선형화 된 벡터의 흡광도를 측정한다.
7. 상업적 효모 형질 전환 키트를 사용하여 DNA 혼합물로 효모 세포를 형질 전환 능력 제조업체의 지시에 따라 (공급 표 참조).
   1. 종속 S. ^- 여기서, 결핍 된 단백질 분해 효소와 URA3을 사용 cerevisiae의 변형, BJ5465. (아래 참조) 심사 중 내부 표준으로 부모의 고리 화 벡터와 세포를 변형. 또한, PCR 단편의 부재에서 선형화 된 벡터를 변환함으로써 배경을 확인한다.
      주 : 저 초기 분비 수준을 검출하는 경우, S.을 사용BJ5465 같은 cerevisiae의 단백질 분해 효소 결핍 균주 배양 상층 액에서 활성 단백질의 축적을 촉진합니다. 표적 효소를 과당 질화, 글리코 실화가 결핍 된 균주의 사용을 겪는 경우 (예, 오직 작은 만노스 올리고머 부착 할 Δ의 kre2)는 적절한 선택 될 수있다.
8. 접시 변환 SC 탈락 플레이트상에서 세포 및 3 일 동안 30 ° C에서 그들을 부화. 플레이트 (우라실 보충 SC 드롭 아웃 접시에) URA3 ^- S. 선별 음성 대조군으로 플라스미드가없는 cerevisiae의 세포 (아래 참조).

분석을 심사 2. 높은 처리량 (그림 3)

1. 피펫 로봇의 도움으로 잘 당 50 μl의 최소한의 매체 (2,000 클론의 라이브러리를 분석하기 위해 23 판) 멸균 96 웰 플레이트의 적절한 수를 입력합니다.
2. 판 밖으로 SC-드롭에서 개별 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트로 전송.
   1. 각 플레이트에서, 부모의 내부 표준 타입과 잘 URA3와 H1에서와 열 번호 6 접종 ^- S.을 음성 대조군으로 더 플라스미드 (우라실 보충 SC 매체에서) cerevisiae의 세포.
      참고 : 음 H1은 우라실 보충 드롭 아웃 미디어 구체적으로 가득합니다. 세포가없는 웰 빈 함유 배지는 추가로 멸균 대조군으로서 제조 될 수있다.
3. 자신의 뚜껑 접시를 덮고 파라 필름에서 그들을 포장. 습기 통에서 30 ° C에서 48 시간, 225 rpm으로 80 %의 상대 습도에 대한 번호판을 품어.
4. 는 파라 필름을 제거 피펫 로봇의 도움으로 각 웰에 표현 매체의 160 μl를 추가, 번호판을 봉인하고 추가로 24 시간 동안 그들을 품어.
   참고 : ¹⁹ 다른보고 된 최소 배지 표현 매체가 제조된다. 분비 수준 t, 따라서 연구중인 유전자에 따라 달라질 수있다그 시간은 모든 웰에서 세포 성장을 동기화 각 경우에 최적화되어야 인큐베이션.
5. 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 2,800 X g에서 판 (마스터 판).
6. 이송 로봇 멀티 스테이션 처리 액을 사용하여 레플리카 플레이트 마스터 플레이트 웰로부터 상층 액 20 μL.
   참고 : 효소 분비를 선호하는 것이 일반적으로 효모에서 이종 발현 (에 사용되는 신호 펩타이드에 의해 표적 단백질의 기본 신호 펩타이드를 교체하는 것이 좋습니다 예를 들면, α 계수 prepro 리더, S.에서 K ₁ 킬러 독소의 지도자 세레 비지 또는 둘 펩티드 ^13)이라도 키메라 버전. 대안 적으로, 천연 신호 펩티드 독점적 효모 분비를 위해 전개 될 수있다.
7. 피펫 로봇의 도움으로 100 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 6.0에서 2 mM의 P는 -methoxybenzylalcohol의 20 μl를 추가합니다. 96 우리 짧게 접시를 저어접시 믹서 LL RT에서 30 분 동안이를 부화.
8. 피펫 로봇으로, 각 복제 판에 FOX 시약 160 μl를 추가하고 잘 FOX 혼합물의 믹서 (최종 농도 짧게 저어 : 100 μM 크 실레 놀 오렌지, 250 μM 철 (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} 25 mM의 H ₂ SO _4).
   1. 유기 공동 용매 (DMSO, 에탄올, 메탄올) 또는 소르비톨 ^(17)의 감도를 향상시키기 위해 시약에 여러 가지 첨가제를 추가합니다. 여기서, 100 밀리미터 (도 4)의 최종 농도 소르비톨을 첨가하여 반응을 증폭한다.
9. 접시 리더에서 560 nm에서 플레이트 (엔드 포인트 모드, t _0)를 참조하십시오.
10. 색상이 개발 될 때까지 RT에서 접시를 품어 다시 (t ₁₎ 흡수를 측정한다.
    1. 배양 후 애비 값의 차이에서 상대 활성을 계산하고 초기 측정의는 PARE에 정상화각 플레이트에 대한 ntal 유형 (의 Δt ₁ - t _0).
11. 오탐 (false positive)을 배제하기 위해 두 개의 연속 재 상영에 최적의 돌연변이 안타 대상으로 할 수 없다.
    주 : 일반적으로 재 스크리닝 플라스미드 ¹⁹ 신선한 효모 세포를 형질 전환 한 다음, 대장균의 효모, 증폭 및 정제로부터 분리 된 플라스미드를 포함한다. 선택한 각 클론 pentaplicate에서 다시 상영된다.

Results

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H ₂ O _2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 ^19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리를 구성하는 조각과 선형화 된 벡터에 자신의 복제 사이의 접합을 선호하는 특정 중복 영역의 엔지니어링에 관한 가장 중요한 문제. 현재의 예에서, 각각의 PCR 반응에 모든 단편은 효모 생체에 접합 촉진 약 50 염기쌍의 오버행을 가지고 있었다. 세그먼트의 개수가 조립 선형화 된 벡터로 클로닝에 재조합 사건의 개수가 종속 (즉, ...

Discussion

이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록.

라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 ⁽¹⁶⁾ 변경되지 않은 단백질의 나머지 영역을 남기면서 작은 단백질 뻗어 무작위 돌연변이를 재결합하는 빠르고 한 냄비 방법입니다. 몇몇 돌연변이 부하 라이브러리는 용이하게 전체 자율적으로 복제하는 벡터를 생성하기 위해 상기 선형화 된 플라스미드와 함께 제조 및 생체 내에서 재결합 할 수있다. 중첩 서열은 추가 PCR 반응과 시험 관내 결찰 단계 회피 전체 유전자의 단편은 생체 내 재조합을 통해 조립 될 수 있도록 각각의 측면 연신하는 것이 중요하다. 이...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<강한>1. 배양 매체
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-포도	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 MW 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 MW 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
효모 추출물	Difco	212750
효모 질소 염기(아미노산 제외)	Difco	291940
효모 합성 드롭아웃 매체 보충제(우라실 제외	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company<	strong>카탈로그 번호	댓글
2. PCR 반응
dNTP 믹스	애질런트 유전체학	200415-51	25 mM 각각
iProof High-Fidelity DNA 중합효소	Bio-rad	172-5301
망간(II) 염화물 사수화물	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA 중합효소	Sigma-Aldrich	D4545	오류용 엎드려 있는 PCR
Name	Company	카탈로그 번호	>코멘트
3. 플라스미드 선형화
BamHI 제한 효소	New England Biolabs	R0136S
소 혈청 알부민	New England Biolabs	B9001S
XhoI 제한 효소	New England Biolabs	R0146S
Not I 제한 효소	New England Biolabs	R0189S
젤 레드	비오튬	41003	DNA 염색용
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
4. FOX 분석
암모늄 철(II) 황산염 육수화물	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 MW 392.14
Anysil 알코올	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 MW 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 MW 182.17
과산화수소 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX 표준 곡선
Xylenol 오렌지 디소듐 염	시그마-알드리치	52097	CAS Nº 1611-35-4 MW 716.62
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
5. 아가로스 젤 스터프
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
겔 레드	비오튬	41003	DNA 분석 염료
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. 표준
로딩 염료 6x	Thermo Scientific	R0611
저융점 온도 아가로스	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	>카탈로그 번호	Comments
6. 키트 및 세포 < / strong>
S. cerevisiae 균주 BJ5465	LGC Promochem	ATTC	208289 유전자형을 가진 프로테아제 결핍 균주 : MAT α ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4 :: HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue 유능 세포	Agilent genomics	200150	플라스미드 정제 및 증폭 용
NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA 겔 추출
NucleoSpin 플라스미드 키트	Macherey-Nagel	740,588,250	컬럼 miniprep 키트
효모 변환 키트	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	포함 DNA 운반체 (연어 고환)
Zymoprep 효모 플라스미드 miniprep I	Zymo research	D2001	효모에서 플라스미드 추출
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
7. 플레이트
96웰 플레이트	Greiner Bio-One	655101	투명, 비멸균, 폴리스티렌(활성 측정용)
96웰 플레이트	Greiner Bio-One	655161	투명, 멸균, 폴리스티렌(미세발효용)
96웰 플레이트 뚜껑	Greiner Bio-One	656171	투명, 멸균, 폴리스티렌(미세발효용)