진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

요약

우리는 Saccharomyces cerevisiae에서 지시된 진화 캠페인을 위한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

서론

감독 분자 진화는 효소 ^{1, 2를} 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 ^{3-5 목표를} 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 ^6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다.

세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 ^(8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 ^9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 li....

프로토콜

1. 돌연변이 라이브러리 생성

1. 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 ^(18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다.
   1. 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 - Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로.
      참고 : 여러 세그먼트가 독립 또는 결합 방식으로 ¹⁶ 모핑으로 공부하실 수 있습니다.
2. 돌연변이 유발 PCR에 의해 대상 영역을 증폭. 정의 된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 세그먼트 사이의 영역 (~ 50 bp의 각)를 중복 작성합니다.
   1. DNA 템플릿을 포함하는 50 μL (0.92 NG / μL), 90 나노 올리고 감각 (세그먼트 MI 세그먼트 M-II에 대한 AAO-BP에 대한 RMLN)의 최종 볼륨에서 대상 세그먼트의 돌연변이 PCR을 준비, 90 nM의 a를ntisense 프라이머 (세그먼트 M-II에 대한 세그먼트 MI 및 RMLC에 대한 AAO-92C), 0.3 밀리미터의 dNTPs (0.075....

결과

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H ₂ O _2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 ^19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리를 구성하는 조각과 선형화 된 벡터에 자신의 복제 사이의 접합을 선호하는 특정 중복 영역의 엔지니어링에 관한 가장 중요한 문제. 현재의 예에서, 각각의 PCR 반응에 모든 단편은 효모 생체에 접합 촉진 약 50 염기쌍의 오버행을 가지고 있었다. 세그먼트의 개수가 조립 선형화 된 벡터로 클로닝에 재조합 사건의 개수가 종속 (즉, .......

토론

이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록.

라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 ⁽¹⁶⁾ 변경되지 않은 단백질의 나머지 영역을 남기면서 작은 단백질 뻗어 무작위 돌연변이를 재결합하는 빠르고 한 냄비 방법입니다. 몇몇 돌연변이 부하 라이브러리는 용이하게 전체 자율적으로 복제하는 벡터를 생성하기 위해 상기 선형화 된 플라스미드와 함께 제조 및 생체 내에서 재결합 할 수있다. 중첩 서열은 추가 PCR 반응과 시험 관내 결찰 단계 회피 전체 유전자의 단편은 생체 내 재조합을 통해 조립 될 수 있도록 각각의 측면 연신하는 것이 중요하다. 이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강한>1. 배양 매체
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-포도	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 MW 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 MW 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
효모 추출물	Difco	212750
효모 질소 염기(아미노산 제외)	Difco	291940
효모 합성 드롭아웃 매체 보충제(우라실 제외	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company<	strong>카탈로그 번호	댓글
2. PCR 반응
dNTP 믹스	애질런트 유전체학	200415-51	25 mM 각각
iProof High-Fidelity DNA 중합효소	Bio-rad	172-5301
망간(II) 염화물 사수화물	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA 중합효소	Sigma-Aldrich	D4545	오류용 엎드려 있는 PCR
Name	Company	카탈로그 번호	>코멘트
3. 플라스미드 선형화
BamHI 제한 효소	New England Biolabs	R0136S
소 혈청 알부민	New England Biolabs	B9001S
XhoI 제한 효소	New England Biolabs	R0146S
Not I 제한 효소	New England Biolabs	R0189S
젤 레드	비오튬	41003	DNA 염색용
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
4. FOX 분석
암모늄 철(II) 황산염 육수화물	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 MW 392.14
Anysil 알코올	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 MW 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 MW 182.17
과산화수소 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX 표준 곡선
Xylenol 오렌지 디소듐 염	시그마-알드리치	52097	CAS Nº 1611-35-4 MW 716.62
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
5. 아가로스 젤 스터프
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
겔 레드	비오튬	41003	DNA 분석 염료
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. 표준
로딩 염료 6x	Thermo Scientific	R0611
저융점 온도 아가로스	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	>카탈로그 번호	Comments
6. 키트 및 세포 < / strong>
S. cerevisiae 균주 BJ5465	LGC Promochem	ATTC	208289 유전자형을 가진 프로테아제 결핍 균주 : MAT α ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4 :: HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue 유능 세포	Agilent genomics	200150	플라스미드 정제 및 증폭 용
NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA 겔 추출
NucleoSpin 플라스미드 키트	Macherey-Nagel	740,588,250	컬럼 miniprep 키트
효모 변환 키트	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	포함 DNA 운반체 (연어 고환)
Zymoprep 효모 플라스미드 miniprep I	Zymo research	D2001	효모에서 플라스미드 추출
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
7. 플레이트
96웰 플레이트	Greiner Bio-One	655101	투명, 비멸균, 폴리스티렌(활성 측정용)
96웰 플레이트	Greiner Bio-One	655161	투명, 멸균, 폴리스티렌(미세발효용)
96웰 플레이트 뚜껑	Greiner Bio-One	656171	투명, 멸균, 폴리스티렌(미세발효용)

당 )