방법 논문

의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성 PilG에서 Xylella의 fastidiosa

DOI:

10.3791/53816

⸱

2016년 4월 8일

 , 
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

이 논문에서

요약

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본 연구에서는 나노 미세 유체 흐름 챔버는 시각화 기능 Xylella fastidiosa, 포도 나무에 피어스의 질병을 일으키는 세균의 꿈틀 운동의 특성을 사용 하였다.

초록

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Xylella fastidiosa의 식물의 경제적으로 중요한 질환들을 유발하는 그람 - 음성 박테리아 이외 flagellated이다. 꿈틀 운동성은 X를 제공합니다 fastidiosa 장거리 내 공장 이동 및 정착을위한 수단이 X에서 병원성으로 기여 X의 fastidiosa. 꿈틀 운동 fastidiosa는 타입 IV의 필리 운영하고 있습니다. Xylella의 fastidiosa의 유형 IV의 필리는 pilG, 신호 전달 경로에 관여하는 필-순찰대 오페론 인코딩 단백질의 화성 조절기에 의해 조절된다. X의 꿈틀 운동에 pilG의 역할을 규명하려면 fastidiosa하는 pilG 결핍 돌연변이 Xf를 ΔpilG 및 기본 pilG을 포함하는 그것의 보완 변형 XfΔpilG- C가 개발되었다. 타임 랩스 영상 녹화 시스템과 통합 마이크로 유체 챔버 XfΔp 경련 운동성을 관찰하는 데 사용ILG, XfΔpilG- C와 야생형 균주. 이 기록 장치를 사용하여, 장기 시공간 응집 관측 각 셀 및 경련 운동성 통해 박테리아 집단의 이동을 허용한다. X. 돌연변이 XfΔpliG는 연축 결핍 표현형을 나타내 fastidiosa 반면 야생형과 상보 XfΔpilG- C 균주 직접 미세 유동 챔버 관찰 전형적인 경련 운동성 특성을 보였다. 이 연구는 pilG는 X의 꿈틀 운동성에 기여하고 있음을 보여줍니다 fastidiosa. 마이크로 유체 유동 챔버 경련 운동성을 관찰하는 수단으로 사용된다.

서론

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Xylella의 fastidiosa가 포도에서 피어스 질환 (비 티스 VINIFERA L.) 1, 2, 3을 포함하여 경제적으로 중요한 작물 질환들을 유발하는 그람 - 음성 비 flagellated 병원성 박테리아이다. 이는 박테리아 물 전도성 목부에 한한다 선박. 소문의 감염은 목부의 선박과 물 부족의 결과와 영양 결핍 (3)의 막힘이 발생합니다. 성공적인 정착 식물 (3)의 나머지 감염의 초기 위치에서 이동하는 박테리아의 능력에 달려있다. X. 특징으로 한 극성 타입 IV의 필리 (4)의 연장, 첨부 한 후퇴 통해 편모 독립적 박테리아 이동 수단이되어 운동성 경련 fastidiosa 5,6,7.

경련 운동성 레이저 핀셋 및 원자 힘 현미경 (AFM) 8,9,10에 의해 관찰되었다. 이러한 기술을 이용하여 t매혹적인의 motilities는 N.의 유형 IV의 pilus에 의해 생성 임질과 P. 녹농균은 플로리다 uorescently 라벨 필리 현미경으로 그들의 움직임을 포착 특징으로했다. 두 방법은 개별 박테리아의 접착력 상술되었지만, 절차는 복잡하고 시간 소모적 9,10이다. 마이크로 FL uidic 챔버 장거리 개별 셀의 이동뿐만 아니라 박테리아 세포 5,6- 작은 응집체를 관찰 하였다. 이 챔버는 시간 경과 영상 녹화 시스템 11,12,13,14 통합 접시에 미세 나노 채널로 설계되었다. 마이크로 uidic 챔버 장치 박테리아의 이동 동작 및 세포 - 세포 상호 작용을 연구 몇 가지 장점을 제공 FL : (ⅰ)는 다중 채널 기능이 통합 된 플랫폼을 제공한다; (ⅱ)는 모션 및 박테리아의 나노 크기 특성의 단셀의 집합체를 검사 할 수있다; (ⅲ)이 직접 m 가능박테리아 세포 및 시간 경과 분석 icroscopic 영상 기록은, (ⅳ)는 마이크로 환경에서 박테리아의 개인 및 / 또는 인구의 장기 공간 및 시간 관찰을 제공한다 (V) 채널에서 배양액의 유량을 정확하게 제어 할 수 있으며, 배양액 (VI)의 매우 작은 양 (1 ml)을 각각의 실험에 대해 요구된다.

최근 마이크로 FL uidic FL 흐름 시스템은 다양한 미세 환경 14,15,16에서 박테리아 세포의 행동을 조사하기 위해 사용되어왔다. 접착 및 E.의 표면에 부착 대장균 (15), X. fastidiosa 16 및 Acidovorax 유리 표면에 14 마이크로 FL uidic 챔버를 이용하여 평가 하였다 citrulli. Acidovorax의 citrulli의 유형 IV의 필리에 의해 매개 집계 및 바이오 Fi를 필름 형성 (14)를 분석 하였다. A.의 또한, 움직임 citrulli는 플로리다 흐름 C 관찰onditions는 타입 IV의 필리가 식민지에서 중요한 역할을 할 수 있음을 입증하고 A.의 확산 수액 FL 흐름 조건에서 목부 선박에 citrulli. 녹농균 및 X의 꿈틀 motilities fastidiosa 세포가 성공적으로 미세 유동 챔버 5,6,17에 유체 전류에 대해 관찰되었다. 타입 IV pilus는 X의 pilB 및 pilQ 돌연변이 결핍 fastidiosa는 깊이 마이크로 FL uidic 장치 5,6,18에서 플로리다 유동 조건에서 운동성을 꿈틀의 속도를 변경하는 것으로 밝혀졌다. 마이크로 FL uidic 장치 세균 부착 및 운동성 실시 연구 마이크로 FL uidic 챔버들은 시험 관내에서 필리 매개 세균의 경련 운동성 및 이동 분석에 특히 적합한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 세포 - 세포 부착, 응집 집락 내를 용이 경련 매개 이동기구를 설명호스트는 결국 전신 감염으로 이어질.

X의 필 - 열병합 오페론 fastidiosa는 인코딩 신호 전달 (20) 경로 pilG, PILI, pilJ, 알약, chpB 및 chpC이 포함되어 있습니다. 횡단 chemoreceptors는 주변 세포질 도메인에 화학적 자극을 결합하여 궁극적으로 세균 꿈틀 운동성을 제어하기 위해 자신의 세포질 부분에 신호 캐스케이드를 활성화합니다. X의 필 - 열병합 오페론에서 fastidiosa하는 포스 포 셔틀 단백질 PilG는 최 회장에 동족체이다. E.에서 대장균 및 P. 녹농균은 최은 편모 단백질 모터 (19), (21)와 상호 작용 화성 시스템에서 응답 레귤레이터이다. X의 독성을 향해 필 - 열병합 오페론의 기여 있지만 fastidiosa는 환경 신호에 응답하고 X의 규제 / 모터 유형 IV의 필리에, 최근에 화성 오페론에 pilG의 역할을 (20)을 조사 하였다 fastidiosa는 UNC입니다리어. X의 꿈틀 운동의 활동에 화성 레귤레이터 pilG의 통찰력을 규명하려면 fastidiosa, 마이크로 FL uidic 챔버는 X의 꿈틀 운동성을 평가하는 데 사용됩니다 fastidiosa. X.의 fastidiosa의 pilG은 삭제 돌연변이 Xf를 ΔpliG, 보완 변형 XfΔpliG -C 및 시험 관내에서의 야생형의 표현형을 비교하는 것을 특징으로한다. 결과는 X의 경련 운동성 pilG의 역할을 강조 fastidiosa.

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프로토콜

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1. 세균 콜로니의 주위 프린지

  1. X를 성장 fastidiosa (Xf를) 테메 큘라 야생형 (22), pilG 삭제 돌연변이 PD2 매체 한천 플레이트 25에서 28 °에 (이전에 염색체 기반 유전자 보완 전략 (24) 기술 사용) (이전에 설명한 삭제 전략 (23)를 사용하여) Xf를 ΔpliG, 그 보완 XfΔpliG -C 5~7일에 대한 C.
  2. 15 분 동안 121 ° C (249 ° F)에서 물에 오토 클레이브 셀로판 (1 × 1cm 2). , 셀로판의 한 조각을 들고 빈 페트리 접시에 셀로판의 한 구석을 터치하여 물기를 조심스럽게 한천 표면과 공기 건조의 15 % 이상 셀로판을 배치합니다.
  3. 개별 X를 데리러 무균 한천 플레이트에 한천 표면의 15 %에 중첩 셀로판의 살균 장에 둥근 이쑤시개와 자리 세포 멸균와 fastidiosa 식민지. 접시를 품어2-3 일 동안은 28 ℃에서의.
  4. 2 배 대물 렌즈와 해부 현미경 10 배 접안 렌즈를 사용하여 식민지의 가장자리의 형태를 검사합니다. 식민지 주변의 주변 프린지 사진.

2. 현미경과 미세 유체 흐름 챔버

  1. 마찬가지의 포토 리소그래피 절차를 사용하여 제조하는 마이크로 유체 장치는 이전에 설명 5,18. 표준 리소그래피 방법을 이용하여 마스터 (26)의 실리콘 웨이퍼 상에 컴퓨터 보조 설계 소프트웨어와 4 개의 병렬 채널을 설계한다.
  2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)과 실리콘 웨이퍼 마스터에서 미세 유체 챔버를 만듭니다. 실리콘 웨이퍼 위에 마스터 비중 합 PDMS를 부어 1 시간 동안 60 ° C에서이를 경화. 웨이퍼 마스터에서 PDMS 복제를 벗겨과 유리 커버 슬립의 같은 크기로 22mm X 40mm로 블레이드와 PDMS 복제 트림.
  3. PDMS의 복제, 유리 커버 슬립 (22 × 40 ㎜ × 2) 및 microsc 폭로2 분 27 30 W의 공기 플라즈마에 OPE 슬라이드 (51 X 76mm 2). 샌드위치 유리 커버 슬립과 마이크로 FL uidic 챔버를 구축 할 수있는 유리 현미경 사이의 PDMS의 몸.
  4. 패터닝 된 채널의 각 단부에서 PDMS 관통 구멍 (5.5 mm 직경)을 뚫는다. 12-20cm 길이로 실리콘 고무 튜브를 잘라. PDMS의 복제본의 각 채널의 개방 단부에 실리콘 고무 튜브의 일단 (외경 5.1 mm, 내경 2.1 mm, 0.8 mm의 벽)를 넣고 1 시간 동안 60 ℃에서 비중 합 PDMS로 밀봉.
  5. 플라스틱 루어 커넥터의 가시 끝에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 알루미늄 박으로 조립 된 미세 유체 챔버를 감싸고 20 분 동안이를 오토 클레이브.
  6. X.의 균체를 모아서 스크래핑을 통해 fastidiosa 야생형, 돌연변이 Xf를 ΔpliG, 보완 XfΔpliG -C는 일회용 접종을 사용하여 PD2 매체 판에서 반복합니다. 세포 밀도를 조정PD2 브로스 600 nm에서 0.05의 광학 농도에 앞서 23 바와 같이. 1 ML의 기밀 주사기에 박테리아 세포 솔루션을 수집합니다.
  7. 거꾸로 현미경의 무대에 미세 유체 장치를 탑재합니다. PD2 국물을 포함하는 5 ML의 기밀 주사기에 주입 관을 연결합니다. 주사기 펌프 5 ml의 기밀 주사기를 장착한다.
  8. 폐기물 저장 용기에 배출 튜브를 연결합니다. 0.2 μL 분의 중간 유량을 유지, 30 분 -1 시스템을 안정화시키기 위해.
  9. 박테리아 세포 솔루션을 포함하는 1 ml의 기밀 주사기에 사이드 입구 튜브를 연결합니다. 채널에 도달 할 때까지 고무 호스를 통해 박테리아 세포 용액을 플래시. 챔버의 사전 이미지 캡처에 언 바운드 세포를 세척하기 위해 0.2 μL 분의 매체 유량 -1 또 다른 30 분 동안을 유지한다.
  10. 빛을 제어 할 현미경 분야 조정 부분 아래 현미경 셔터를 탑재. 셔터 공동으로 셔터를 연결ntrol 시스템 및 컴퓨터 셔터 제어 시스템을 연결한다.
  11. 현미경의 비디오 포트에 디지털 카메라를 장착하고 컴퓨터에 연결합니다. 메뉴에서 "셔터"기능을 선택, 시간 경과 기록 작업 소프트웨어를 실행하고 소프트웨어와 셔터에 연결을 설정하기 위해 소프트웨어에서 자동으로 기본값으로 설치 셔터를 인식하고 있습니다.
  12. 자동 소프트웨어 기본 촬상 장치로서 디지털 카메라를 인식 소프트웨어와 디지털 카메라와의 통신을 설정하는 저속 기록 소프트웨어 메뉴에서 "디지털 카메라"기능을 선택한다.
  13. 20X 위상차 광학을 사용하여 채널들 중 하나에있는 박테리아 세포를 찾은 후, 촬상 전의 40X 대물 렌즈로 전환.
  14. 현미경에서 이미지를 수집하기 위해 메뉴에서 기본 매개 변수를 사용하여 "이미지 수집"기능을 선택, 시간 경과 레코딩 소프트웨어를 실행합니다.다음으로, "저속 획득"기능을 열고 6-24 시간은 X. 연축의 운동성을 관찰하는 실험이 필요에 따라 지속 기간 30 초 5,18,28에 시간 간격을 설정 fastidiosa 5,18,28. 시간 경과 기록 작업을 시작합니다 "OK"를 클릭합니다. 선택 녹음을 마친 후 컴퓨터에서 대상 폴더에 이미지를 쌓아 "다른 이름으로 저장"메뉴에서 "스택 기능"을 클릭합니다.
  15. 여러 채널의 경우, 6 시간 동안 첫 번째 채널에서 매 30 초 시간 경과 이미지를 캡처합니다. 표적 세포를 찾기 위해 다음 채널로 현미경의 대물 렌즈를 이동. 실험은 네 개의 채널을 이용하도록 설정되어있는 경우, 네 개의 채널이 순차적으로 각각의 이미지를 캡쳐하도록 전술 한 바와 같이 저속 기능을 반복한다. 한 세 가지로 일 연속 시간 경과 이미지 캡처를 계속합니다. 모든 실험은 실온 (23 ± 2 °의 C)에서 수행 하였다.
  16. 에 시간 경과 이미지를 컴파일시간 경과 기록 영상 소프트웨어를 사용하여 비디오 파일. 실행 시간 경과 레코딩 소프트웨어, 메뉴에서 "스택 기능"을 클릭하고 컴퓨터에서 누적 된 파일을 열 "오픈 스택 기능"을 선택합니다.
  17. 모든 이미지를 선택하고 "AVI"출력 형식을 선택, 스택 모듈에서 "영화 만들기"기능을 시작합니다. 컴퓨터의 대상 폴더에있는 동영상 파일을 저장하기 위해 "다른 이름으로 저장"을 클릭합니다.
  18. 컴퓨터에 대상 폴더에서 컴파일 된 영화를 선택하고 재생합니다. 그리고, 상기 생성 된 영상 파일에 박테리아 세포의 운동성 경련 활성의 결과 시각화를 통해 단일 ​​세포의 운동성을 관찰한다.

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결과

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IV 형 pilus 매개 경련 운동성을 나타내는 콜로니 주변 무늬의 존재는, X의 콜로니가 관찰되었다 fastidiosa 야생형 및 보완 Xf를 ΔpliG -C 변형 (그림 1). 돌연변이 XfΔpliG 그러나, 콜로니 주변부 프린지를 (도 1)을 나타내지 않았다. 나노 미세 유체 흐름 챔버에 박테리아 세포의 시간 경과 영상은 꿈틀 운동이 모두 야생형 X에서 관찰되었다 것으로 나타났다 fastidiosa 및 보완 XfΔpliG -C (기업 V1, V3)는 XfΔpilG 돌연변이 세포 반면 실험 (기업 V2)를 통해 운동성을 꿈틀 나타내지 않았다. 돌연변이 XfΔpilG의 세포 PD2 국물 (기업 V2)에 상대적으로 작은 느슨한 집합체를 형성했다.

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토론

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본 연구에서는 X의 모션 동작을 특징으로하는 fastidiosa PilG 돌연변이 Xf를 ΔpilG와 새롭게 디자인 된 다수의 병렬 나노 채널 마이크로 FL uidic 챔버에서의 보완 XfΔpilG- C 균주. 새롭게 디자인 된 마이크로 FL uidic 챔버는 하나의 50 μm의 넓은 채널 (18)과 이전 디자인에 비해 폭이 100 μm의 나노 채널과 최대 4 개의 병렬 챔버를 가질 수 있습니다. 개선 된 넓은 나노 채널은 미디어 흐르는 균체의 도입을 용이하게한다. 또한,이 마이크로 유체 챔버 구축하고 조립) 간단한 일이고; 2) 상대적으로 저렴; 3) 실험 요구 사항 변화에 쉽게 적용. 그 결과,이 챔버 설계 품종 하의 박테리아 세포의 움직임의 장기간 관찰 실험 미세 환경을 허용한다.

전류 throu의 흐름 FL 안정화GH 마이크로 FL 채널 uidic 실험 ...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 농무부, 농무부 농업 연구소 (Agricultural Research Service)에 의해 지원되었다. 이 책에서 무역 이름 또는 상용 제품은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 언급하고 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회 제공 및 고용주입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild typeCosta, H. S., et al., 2004 22
>pilG deletion mutant XfΔ pliGShi, X. Y., et al., 2007 26
pilG 상보적 변형주 XfΔ pliG-C Davis, M. J., et al. 1998 23
물리적 재료 및 장비
Disposable inoculating loopsVWR international, Radnor, PA#22-363-607세균 수집과 같은 정량적 절차
폴리디메틸실록산(PDMS)Dow Corning Corporation#0002709226Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트
AmScope MD2000 디지털 카메라AmScope, Irvine, CASE305R-AZ-E이미지, 비디오 녹화 및 측정 
튜브 라인Edgewood, NY주사기 및 미세유체 챔버에 연결
플라스틱 루어 커넥터Edgewood, NY주사기 및 미세유체 챔버에 연결
주사기 펌프Pico Plus, Harvard Apparatus, MA#702209펌프가 작동하는 동안 유량을 조정할 수 있습니다.
SyringesGastight, Hemilton Company, Reno, NV# 1005흐르는 국물 제공
거꾸로 된 올림푸스 IMT-2 현미경올림푸스IMT-2 FLuoro PHase이미지 관찰 및 기록
SPOT-RT 디지털 카메라Diagnostic Instruments, Inc., MIRT230이미지, 비디오 기록 및 측정
현미경 셔터UNIBLITZ, US < / em>#LS2T2제어 카메라' s 노출 시간
현미경 셔터 제어 시스템UNIBLITZ, USVCM-D1VCM-D1 VCM-D1 단일 채널 CE/UL/CSA 승인 셔터 드라이버
MetaMorph 이미지 소프트웨어Universal Imaging Corp., PA실시간 초고해상도 이미지 처리 
#T4300

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Twitching MotilityXylella fastidiosaPilG GeneMicrofluidic Flow ChamberTime Lapse ImagingType IV PiliBacterial MotilityGene DeletionComplementary StrainPathogenicity Analysis

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