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방법 논문

방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

7.8K 조회수

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DOI:

10.3791/53827

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2016년 5월 27일

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이 논문에서

요약

예로서, 뮤린 ABC 수송 Bcrp1 (ABCG2)을에 실리 프로토콜은 마우스 조직에서 발현하는 유전자로 대체 프로모터 사용량을 검출하고, 리포터 분석법을 사용하여 확인 된 다른 프로모터의 기능을 평가하기 위해 제공된다.

초록

일반적으로 번역되지 않은 - - 첫 번째 엑손 다른 조직에서 유전자 발현은 종종 독특한와의 mRNA의 합성 결과 다른 프로모터에 의해 제어된다. E1U, E1A, E1B 및 E1C : Bcrp1 (ABCG2)는 ABC 트랜스 포터 유방암 저항 단백질 (BCRP, ABCG2)의 쥐 orthologue는, 생산 대응하는 네 개의 대안 첫 번째 엑손에 의해 지정된 적어도 네 개의 대안 발기인이 있습니다. 여기에 실리 프로토콜은 Bcrp1에 대한 대체 발기인 사용량을 예측하기 위해 제공됩니다. 또한, 리포터 분석 방법은 다른 프로모터 리포터 작 제물을 제조하고,이 상류 식별 대안 제 엑손의 추정 프로모터의 기능을 결정하기 위해 설명된다.

서론

더 많은 인간 유전자의 절반 이상은 다른 발기인 (1)에 의해 조절된다. 각 대안 프로모터는 다른 대안 발기인에서와 다를 수 있습니다 조절 요소를 포함 할 수 있습니다. 하나의 조직에 사용되는 프로모터 (들) 다른 조직에서 사용되는 것과 다를 수 있습니다. 예를 들면, 소정의 신호 전달 경로의 활성화는 하나의 조직에 이용되는 유전자 대안 적 프로모터를 실행하면서도에 영향을 미치지 또는 다른 조직에서 이용되는 것과 같은 유전자에 대한 별도의 다른 프로모터를 금할 수있다.

Bcrp1 유전자의 발현은 다른 발기인이 적용됩니다. Bcrp1은 인간의 유방암 저항 단백질 (BCRP) 유전자의 쥐 orthologue입니다. BCRP는 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 트랜스 포터, 공식적으로 지정 ABCG2 2, 3입니다. 정점 세포막 단백질로서, BCRP / Bcrp1 기능 천연 및 생체이 다양한 기질을 유출하는 3,4-. (12) - 인간과 쥐에서 BCRP / Bcrp1은 매우 예컨대 태반, 뇌와 고환 2, 5 등 혈액 조직 ....

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프로토콜

마우스 EST 데이터베이스의 BLAST 분석을 사용하여 Bcrp1의 대안 첫 번째 엑손의 실리 예측 1.

참고 :이 프로토콜을 확인하기 위해 게놈 서열에 일치하는 EST 서열을 정렬하는 방법을 다음 마우스 표현 된 시퀀스 태그 (EST) (포함 번역 시작 사이트) Bcrp1의 2 엑손하는 서열의 유사성과 EST를위한 데이터베이스를 검색하는 방법에 대해 설명 자신의 Bcrp1 엑손 (2)의 5 '말단에 마우스 Bcrp1 유전자의 상대적인 위치.

  1. 의 Ensembl 게놈 브라우저 (17)의 검색 창에 mRNA를 참조 시퀀스 ID (NM_011920.3)를 입력하여 마우스 Bcrp1 엑손 2의 순서를 얻기를 클릭 "GO." 다음 화면에서, 전체 길이 시퀀스 (16 개의 엑손을 포함) 선택 :
    1. 다음 화면 ( "대본 기반 디스플레이")에서 "16 엑손 '을 선택합니다. 이 Bcrp1의 모든 엑손의 서열을 포함하는 화면이 표시됩니다. Bcrp1의 엑손 2 5 "읽9; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "기준 18에 도시 된 것과 유사한 것이다 얻어진 결과..
    2. "다운로드 순서"옵션을 클릭합니다. 다음 화면에서, FAS....

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결과

리더 엑손의 분석에 의해 마우스 고환에서 Bcrp 한 다른 프로모터 활용의 식별

NCBI의 EST 데이터베이스 프로토콜 1에서 설명 된 단계 (2015 에이프릴) 프로브되었을 때, EST를 게놈에서의 위치와 함께, 하나의 mRNA를 표 1에 나타낸다 Bcrp의 엑손 (2)의 5 '말단으로 연속적인 것으로 나타났다 엑손 E1U (표 1)에 대응하는 mRNA를 엑손 2 ~ 70킬로바이트 상류 게놈 DNA의 서열을 갖는다 Bcrp 1 2 엑손에 인접 인 C.......

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토론

제시된 방법과 대표적인 결과의 대부분은 2013 5 년에 출판되었다 ​​"마우스 고환에서 B의 crp1 전사 상류 steroidogenic 요소-1에 의해 규제 소설 첫 번째 엑손 (E1U)의 프로모터에 의해 제어된다"라는 이전 작업에 설명되어 있습니다 . 여기에 도시 된 대표적인 결과에 더하여, 이전의 논문은 5'-RACE PCR 및 RT-PCR 방법을 이용하여 대안적인 제 엑손 활용 추정치를 제공 하였다. 또한, 인 실리코 상류 E1U 중 프로모터의 추정 SF-1 반응 요소의 인식을 수행하고, 염색질 면역 (칩) 분석은 SF-1은 추정 SF-1 반응 요소에 결합 된 것을 증명 하였다. 기능 연구는 쥐의 세르 톨리 (Sertoli) 세포에서, Bcrp 한 전사가 E1U 프로모터의 SF-1 응답 요소를 통해 SF-1에 의해 제어되는 것으로 나타났습니다. 이러한 기능성 연구에 의해 TRA TM4 셀 SF-1의 상향 조절을.......

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공개 사항

더글러스 D. 로스와 메릴랜드 대학, 볼티모어 인간 BCRP에 대한 특허권을 보유.

감사의 글

이 작품은 더글러스 D. 로스와 재향 군인 담당 부서에서 아리프 후세인에 대한 공로 검토 포상에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kitAmbion Inc., Austin, TX, 현재 Life Technologies를 통해 구매 가능AM17005'-RACE PCR 키트
TOPO TA 클로닝 키트Life TechnologiesK450001이 키트에는 TOP10 화학적으로 유능한 E. coli 박테리아가 포함되어 있습니다.
T4 DNA 리가제 빠른 결찰 키트New England BiolabsM2200
Faststart 고화질 Taq- DNA 중합효소Sigma-Aldrich/Roche3553400001/RMB-4738284001 high-fidelity Taq 중합효소 혼합물 함유
XtremeGENE HP DNA 형질주입 시약Roche6366236001
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1910pGL3-basic empty reporter vector(firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase 발현 벡터 및 기타 control 벡터를 포함합니다.
QIAprepQiagen27104For plasmid miniprep - 박테리아 콜로니에서 플라스미드 DNA의 분리 및 정제
pCR2.1 벡터부분 TOPO TA 클로닝 키트
pGL3-basic luciferase 함유벡터 PromegaE1751
pRL-TK Renilla luciferase expressing vectorPromegaE2241
Bacterial artificial chromosomeBACPAC 리소스 센터, 아동' s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CARP23-285A12 및 RP24-314E24http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzolLife Technologies15596026
Wizard® SV 겔 및 PCR 클린업 시스템 PromegaA9281제한 엔도뉴클레아제로 소화 후 PCR 산물을 정제하는 데 유용
CRYOVIALSDenville ScientificV9012
SOFTWARE:
Ensembl softwareEnsembl projecthttp://Ensembl.org Ensembl 프로젝트는 척추동물 및 기타 진핵생물 종에 대한 게놈 데이터베이스를 제작하고 이 정보를 온라인에서 무료로 사용할 수 있도록 합니다.
폭발 소프트웨어NCBIhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
웹& PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 소프트웨어Simgenehttp://simgene.com/Primer35'-RACE PCR
NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
TM4 murine Sertoli cellsATCC, Manassas, VirginiaCRL-1715™
INSTRUMENTS:
LuminometerTurner BiosystemsTD-20/20이것은 상대적으로 저렴하고 수동으로 작동되는 광도계입니다. 96웰 플레이트를 사용하는 동일한 제조업체의 자동화 시스템도 사용할 수 있습니다.
NanoDrop 분광 광도계Thermo Scientific, Inc.NanoDrop 2000분광 광도계는 매우 적은 양의 시료
DU 800 UV/VIS 분광 광도계 및 핵산 분석 II 소프트웨어BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CADU 800
의을 사용할 수 있습니다.

참고문헌

  1. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
  2. Doyle, L. A., et al.

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