qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 &#39;플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

Marco Giallombardo; Jorge Chacártegui Borrás; Marta Castiglia; Nele Van Der Steen; Inge Mertens; Patrick Pauwels; Marc Peeters; Christian Rolfo

doi:10.3791/53900

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방법 논문

qPCR을 통해 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 '플라즈마에 Exosomal의 miRNA 분석 : 실현 가능한 액체 생검 도구

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DOI:

10.3791/53900

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2016년 5월 27일

Marco Giallombardo^*¹^,² , Jorge Chacártegui Borrás^*²^,³ , Marta Castiglia⁴ , Nele Van Der Steen³ , Inge Mertens⁵^,⁶ , Patrick Pauwels⁷^,³ , Marc Peeters⁸^,³ , Christian Rolfo²^,³

¹Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, ²Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), ³Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, ⁴Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, ⁵Flemish Institute for Technological Research (VITO), ⁶CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, ⁷Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), ⁸Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 순환하는 miRNA 오염을 방지하고 NSCLC에서 miRNA의 바이오마커 기능을 평가하기 위해 Proteinase K 및 RNAse 처리와 함께 상용 엑소좀 분리 키트를 통해 NSCLC 환자의 혈장에서 방출되는 엑소좀에서 miRNA 프로파일링을 수행할 수 있는 가능성을 설명합니다.

초록

NSCLC에서 EGFR 및 ALK 유전자의 변형이 발견됨에 따라 선택적 티로신 키나아제 억제제(TKI)를 사용한 표적 약물 요법의 개발이 촉진되었습니다. 이러한 TKI의 사용을 최적화하려면 조기 발견 및 질병 진행을 위한 새로운 바이오마커의 발견이 필수입니다. 이러한 혈장 분리 엑소좀은 이러한 바이오마커의 검출 및 추적 관찰을 위한 비침습적이고 반복 가능한 방법으로 사용할 수 있습니다. 서로 다른 돌연변이와 치료법을 가진 12명의 NSCLC 환자(그리고 대조군으로 6명의 건강한 기증자)의 혈장 1ml를 엑소좀 공급원으로 사용했습니다. RNAse 처리 후, 순환하는 miRNA를 분해하기 위해 엑소좀을 상용 키트로 분리하고 추가 분석을 위해 특정 완충액에 재현탁시켰습니다. 엑소좀은 ALIX 및 TSG101에 대한 웨스턴 블롯팅(western blotting)과 이러한 나노소포의 생화학적 및 차원 데이터를 얻기 위한 표준 기술인 투과전자현미경(TEM) 분석을 통해 특성화되었습니다. 총 RNA 추출은 고수율 상용 키트로 수행되었습니다. 엑소좀의 miRNA 함량이 제한되어 있기 때문에 선택한 각 miRNA에 대해 개별 분석을 사용하여 역전사 PCR을 수행하기로 결정했습니다. NSCLC 질환과 상관관계가 있는 miRNA 패널(30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222)을 Real-Time PCR 분석의 놀라운 민감도와 특이성을 활용하여 분석했습니다. MIR-1228-3P는 내인성 대조군으로 사용하였으며, 데이터는 화학식 ^2-ΔΔct¹³에 따라 처리하였다. 대조값은 기준선으로 사용되었으며 결과는 로그 척도로 표시됩니다.

서론

NSCLC (비 소 세포 폐암) 환자에서 낮은 생존율 고급 질환 불량을 조기에 발견 치료 ^1의 제한된 효능에 주로 기인한다. NSCLC 환자의 개체군에서 발견 된 EGFR 유전자의 활성화 돌연변이, 키나제 억제제 (TKIs)를 티로신 민감성을 부여하는 것으로 알려져있다. 불행히도, EGFR 돌연변이 NSCLC 환자의 대부분은 TKI ^{저항이 개발.} 특히 이러한 상황에서, 정확한 진단이 필수적이다. 때문에 종양의 현지화에, 일반적으로 비소 세포 폐암에서 생검 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않습니다. 따라서, 몇몇 연구는이 생체 데이터를 획득하는 비 침습적 방법을 사용하는 것을 계속한다. 엑소 좀은 비 침습적 방법 ⁽³⁾ 진단 및 예후 값을 얻기 위해 조사 할 수있는 액체 생검 컴포넌트로서 기술되어있다.

전자의 - (100 나노 미터 직경 40) 엑소 좀은 nanovesicles 있습니다생리적, 병리 적 상태로 ⁴ 모두 다른 세포 유형으로 출시 ndocytic 기원. 그들은 단백질, 지질,의 mRNA 및 마이크로 RNA를 수행 할 수 있습니다. 또한, 몇몇 연구는 종양 세포, 혈관, 간질 및 세포 외 기질 리모델링 및 약제 내성 ^(5)의....