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방법 논문

개발

12.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53974

⸱

2016년 6월 10일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

이 논문에서

요약

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

초록

섬유증은 간질성 폐질환과 같은 다양한 만성 진행성 질환의 발병에 관여하는 경우가 많습니다. 병리학적 특징은 섬유아세포 병소(fibroblastic foci)의 형성이며, 이는 질병의 중증도와 관련이 있습니다. 섬유아세포 병소(fibroblastic foci)로 구성된 중간엽 세포(mesenchymal cell)는 원래 상주하는 폐내 섬유아세포(intrapulmonary fibroblast) 및 골수에서 순환하는 섬유세포(circulating fibrocyte)를 포함한 여러 세포 공급원에서 유래하는 것으로 제안되었습니다. 최근에는 상피-중간엽 전이(EMT)를 겪은 중간엽 세포도 섬유증의 발병에 기여하는 것으로 여겨지고 있습니다. 또한 EMT는 성장 인자 β 변형시켜 유도할 수 있으며, EMT는 종양 괴사 인자 α와 같은 전염증성 사이토카인에 의해 강화될 수 있습니다. 겔 수축 분석법은 섬유아세포의 특징적인 기능 중 하나이며 상처 복구 및 섬유화에 기여하는 수축성 평가를 위한 이상적인 체외 모델입니다. 여기에서는 EMT를 받은 중간엽 세포의 수축 능력을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발을 입증합니다.

서론

섬유화 간질 성 폐 질환, 심장 섬유증, 간경변, 단말 신부전, 전신성 경화증,자가 면역 질환 한 각종 만성 진행성 질환의 발병에 관여된다. 간질 성 폐 질환 중 특발성 폐 섬유증 (IPF)은 만성 진행성 질환이며, 불량한 예후를 보여줍니다. IPF의 병리학 적 특징은 예후와 관련된 활성화 된 섬유 아세포 및 근섬유로 이루어진 섬유 아세포 초점의 개발이다. 이러한 폐 섬유 아 세포의 기원은 원래 주민 폐 섬유 아 세포를 포함하고 골수에서 섬유 세포를 순환 여러 중간 엽 세포에서 파생 할 것을 제안한다. 최근 상피 간엽 전이 (EMT)는 간엽 세포 (2)의 형성과 관련이 제안되었으며, 섬유 성 질환의 발병에 기여.

그것은 생각된다 EMT는 종양의 침윤과 전이 3를 포함하여 태아의 발달 과정에서 중요한 역할을, 상처 치유, 암의 진행을한다. EMT의 방법에 따라, 상피 세포는 E-cadherin의 상피 마커의 손실에 의해 중간 엽 세포의 능력을 획득하고, 그러한 멘틴 같은 중배엽 마커, 및 α-평활근 액틴 (SMA) -4,5- 의해 발현. 이전 연구 EMT 처리가 신장 6 및 7에서 폐 섬유증 조직의 발달과 관련되었다는 증거를 나타내었다. 또한, 만성 염증은 섬유 성 질환 (8)을 촉진; 또한, 종양 괴사 인자 상과 부재 (14) (TNFSF14; LIGHT)와 같은 염증성 사이토 카인, 종양 괴사 인자 (TNF) -α 및 인터루킨 1β는 EMT 9-12을 향상시키는 것으로 나타났다.

콜라겐 겔 수축 분석법, 섬유 아세포 타입 I에 포함 된 콜라겐 계 세포 수축 분석법콜라겐 겔 삼차원, 수축의 평가를위한 시험 관내 모델에서 이상적이다. 수축성 섬유 아세포의 특성 함수 중 하나이며 정상 상처 복구 및 섬유증 (13)에 기여한다. 이 분석에서, 섬유 아세포의 부착이 어떤 조건 하에서 기계적 장력을 생성하도록되어 I는 인테그린 의존성 메커니즘을 통해 입력 콜라겐, 결과적으로 조직의 수축을 유도하는 것으로 생각된다.

여기서, 겔 수축 분석법의 개발이 EMT을받은 세포의 수축 기능의 획득을 평가하도록 적응 될 것으로보고있다. 이 보고서는이 변형 분석이 EMT을 시행 한 중간 엽 세포의 수축력을 평가하기에 적합 함을 보여줍니다.

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프로토콜

1. 준비 및 문화 폐 상피 세포의

  1. 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 A549 인간 폐 상피 세포 (접착 세포 라인) 100 μg의가 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % 우 태아 혈청 (FBS), 100 IU / ml의 페니실린, 및.
  2. 분리 한 배양 접시에서 세포 배양 배지를 버리고, 5 회 세척 - 포스페이트 완충 식염수 10 ㎖ (PBS). 세척 후 즉시 PBS를 대기음.
  3. 3 분 동안 CO 2 2ml의 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (0.05 %)를 첨가하고, 37 ℃에서 5 % 부화.
  4. 세포 배양액을 원심 분리를 150 × g에서 4 분 동안 RT에서 튜브를 포함하는 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다.
  5. 세포를 세포 배양 배지 2 ㎖에 재현 탁하고 세포 펠렛을 계산하기위한 샘플을 제거한다. 세포 생존을 확인 트리 판 블루 염색과 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산.
  6. 종자에 A549 세포0.5의 밀도로 10cm 폴리스티렌 플레이트 - 겔 수축 검정 용 배지 10 ㎖, 1.0 × 106 세포 / 접시. 0.5의 밀도로 6 웰 폴리스티렌 플레이트에 세포를 시드 - 1.0 × 105 세포 / 웰으로 EMT 확인 용 배지 2 ㎖. 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 %.

2. EMT 절차

  1. 단계 1.6에서 시드 젤의 수축 분석에 대한 판에 TGF-β1 (5 μg의 / ㎖)의 10 μL와 TNF-α의 10 μL (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 단계 1.6에서 시드 EMT 확인에 대한 판에 TGF-β1 (5 μg의 / ㎖)의 2 μL 및 TNF-α의 2 μL (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 48 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %.

PCR 및 웨스턴 블로 팅에 의한 EMT 절차 3. 확인

  1. 위상차 현미경을 사용하여 처리 된 세포의 (모양을 스핀들에 자갈 돌 등으로부터) 형태의 변화를 확인합니다.
    참고 : 규범을알 A549 세포는 상피 세포의 특징 인 자갈 돌 같은 삼각형 모양의 외관을 가지고 있지만, TGF-β1 및 TNF-α로 자극 한 후, 세포를 길게 나타나 스핀들 즉 중간 엽 세포 14,15과 유사한 형상.
  2. 이러한 E-cadherin의 같은 상피 마커의 발현을 평가하고, PCR 또는 웨스턴 블롯 이용한 N-cadherin의, 멘틴 및 α-평활근 액틴과 같은 중간 엽 마커.
    1. RNA 추출 키트 (16)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 역전사 효소 (17)를 사용하여 cDNA를 합성.
    2. 실시간 PCR 시스템 (18) 및 제조자의 지시에 따라 모노머 시아닌 염료 PCR 키트를 사용하여 mRNA 수준의 발현을 측정한다. GAPDH에 대한 특이 적 프라이머 (글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소), ACTA2 (알파 - 액틴 2) CDH1 (헤린-1, E-cadherin의) 및 VIM (멘틴)는 표 1에 나타내었다 룽.
    3. 를 Lyse 용균 완충액 (표 2) 1 % 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 용액을 사용하여 세포. 단백질 분석 키트 (19, 20)를 사용하여 모든 샘플의 단백질 농도를 측정하고, 폴리 아크릴 아미드 겔에 단백질의 동일한 양이 적용된다.
      1. SDS 겔 전기 영동하고 PVDF 막 (21)에 단백질의 반 건조 전송을 수행합니다. 2 시간 - 1 버퍼를 차단에서 일차 항체와 멤브레인을 품어. 배양 후, 세척 버퍼로 두 번 멤브레인을 씻고 두 번째 항체 막 1 시간을 품어.
        참고 :이 연구에 사용 된 항체 희석을위한 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 버퍼를 차단의 구성 요소에 대한 표 2를 참조하십시오.
      2. 두 번 세척 버퍼 막 씻으십시오. 감기 CCD 카메라 11,23를 사용하여 웨스턴 블로 팅 검출 키트 (22) 멤브레인의 사진을 촬영합니다.

4. 평가 EMT 젤 수축 분석

  1. 세포 배양 용기로부터의 조정 배지를 흡인하고, 5 잘 세척 - 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS 10 ㎖. 세척 후 즉시 PBS를 대기음.
  2. 3 분 동안 CO 2를 0.05 % 트립신 / EDTA 2 ㎖를 추가하고 37 ° C에서 품어 5 %.
  3. DMEM 150 × g에서 4 분 동안 RT에서 트립신 억제제 (1 ㎎ / ㎖), 원심 튜브를 보충 함유하는 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다.
  4. 증류수로 1 형 콜라겐 겔을 혼합 한 DMEM을 농축하여 4 × 1.75 ㎎ / ㎖의 콜라겐 농도를 달성하기 위해 볼륨을 조절하고, 1 × DMEM 농도. 이 단계 동안 얼음에 젤 매체를 유지해야합니다.
    주 : 겔 배지 6 ㎖의하려면, 잘 3.5 mL의 1 형 콜라겐 겔 (3 ㎎ / ㎖) 1.5 × 4 농축 DMEM ml의 증류수 1ml를 혼합.
  5. PBS 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend 세포 계수에 대한 샘플을 제거합니다. 카운트트리 판 블루 염색하여 혈구를 이용하여 세포의 수는 세포 생존을 확인한다.
  6. 부드럽게 세포 3.0 × 105 세포 / 웰의 밀도 (6.0 × 105 세포 / ㎖)을 달성하지만, 신속하게 겔화없이 피펫 팅하여 혼합 볼륨을 조정 겔 배지를 추가한다.
  7. 스트레이트 원통 형상을 신속하고 신중 24- 웰 미처리 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 혼합물을 분배. 기포가 젤 (그림 1A)를 오염 할 수 있도록하지 않도록주의하십시오.
    세포를 포함하는 겔 매체는 점성 쉽게 잘에서 젤 및 양식 초승달 모양 할 수 있습니다.
  8. 37 ℃ 세포 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2, 95 % 습도 완전히 겔.
  9. 한 방향으로 원주를 그리는 방법으로 멸균 주걱을 움직여서 깨지 않고 접시에서 겔을 분리. 주걱을 사용하여 부드럽게 60mm 조직 배양 접시에 겔을 전송할또는 TGF-β1 (5 NG / mL) 및 TNF-α (10 ng의 / ㎖)이없는 DMEM / 1 % FBS 함유하는 5 ㎖.
  10. 부드럽게 젤이 매체에 떠 보장하기 위해 요리를 흔들어. 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도에서 세포 배양기에서 인큐베이션.

젤 크기의 5. 측정

  1. 영상 분석 시스템을 사용하여 0, 24, 48, 72 시간 후, 콜라겐 겔 크기를 측정한다.
    1. 겔 문서 시스템 (그림 2A)를 켜고 빛을 차단 캐비닛에 요리를 시작했습니다. 그런 다음 캐비닛의 요리의 뚜껑을 벗어.
    2. 관련 겔 분석 소프트웨어를 엽니 다. 캐비닛의 젤의 이미지를 표시하려면 메뉴 바에서 "이미지 수집 버튼"을 클릭합니다. 그 후, 젤 (그림 2B)의 사진을 찍을 메뉴 바에서 "획득"을 클릭합니다.
    3. 측정 영역을 메뉴 표시 줄 (그림 2C)에서 "검색 버튼"을 클릭하고 조정 (노란색 원 전마우스를 드래그하여 n 개의 그림 2C). 그런 다음, 메뉴 바의 "자동 검색 버튼"을 클릭합니다 (그림 2D에서 버튼을 참조). 이 소프트웨어는 자동으로 히트 맵 (그림 2D)를 보여주는 젤을 감지합니다.
    4. 화상 처리에 의한 젤의 윤곽을 추출하고 개요 (그림 2E)에 의해 둘러싸인 영역을 계산하기 위해 "OK"를 클릭합니다. 면적을 산출 한 후, 산출 된 영역이 별도의 팝업 창에 표시된다.
      참고 : 젤 이미징 동안 서로 겹치는 경우, 부드럽게 멸균 피펫 팁을 사용하여 젤을 이동합니다.

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결과

EMT 동안, 상피 세포는 E-cadherin의 같은 상피 마커를 잃게 및 멘틴 및 α-평활근은 4,5를하는 걸 같은 중간 엽 마커의 발현을 얻을 수 있습니다. TGF-β1 및 TNF-α와 A549 인간의 폐 상피 세포의 배양은 EMT를 유도한다. 정상 A549 세포의 모양은 상피 세포 (도 3a)의 특성 인 형상 및 삼각형 등 자갈 돌로 있지만, TGF-β1 및 TNF-α로 자극 한 후, 외관 간엽 비슷 긴 스핀들 형상으로 변경 세포 (그림 3B).

상피와 중간 엽 마커의 발현은 세포 EMT을받은 것을 확인 평가 하였다. 상대 mRNA 발현은 ΔΔCt 방법으로 계산 하였다. 개별 데이터가 가사 g 인 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 데히드로게나 (GAPDH)에 대한 규격화 ...

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토론

본 연구에서 개발 된이 프로토콜은 두 단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서는 두 번째 단계는 겔 수축 분석법 동안, EMT를 유도하기 위해 실행된다. 이 세포는 EMT을받은 것을 확인하는 것이 중요하기 때문에, 2 단계는 형태 학적 및 유전자 발현의 변화에​​ 훌륭한 보완을 제공합니다. 이전 연구 A549 세포 EMT는 TGF-β1을 24 만에 의한 것으로 나타났다; 우리는 이전에 10보고 그러나, TNF-α 치료는 EMT 및 중간 엽 세포 마커의 인수 향상시킵니다. TGF-β 매개 EMT의 메커니즘 SMAD 의존 (25)이라고 생각된다. TNFα는 젤의 수축의 증대로 연결 TGF-β1에 의한 EMT을 향상시킵니다. 이는 TGF-β1 유도 EMT의 향상을위한 TNFα의 메커니즘 된 Smad2 링커 영역의 인산화가없는 것으로 알려져있다, 또한 규제 26 시그널링 MAPK. 따라서 본 연구에서 개발 된 프로토콜은 STIMUL 포함TGF-β1 및 TNF-α...

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공개 사항

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

감사의 글

기술적인 도움을 주신 Tadashi Koyama 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172의 일부 지원을 받았습니다. 일본 후생노동성(Ministry of Health, Labour and Welfare)의 호흡 부전 연구 그룹(Respiratory Failure Research Group)에 대한 보조금; 일본 알레르기 질환 및 면역학 연구를 위한 보조금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM시그마 알드리치11965-092A549 매체
FBSGIBCO10437
변형 성장 인자-&베타; 1, 인간, 재조합Wako Laboratory 화학 물질209-16544
재조합 인간 TNF-&알파;R& D 시스템210-TA/CF
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb세포 신호 기술#31951:3,000 희석
Vimentin (D21H3) 토끼 mAb세포 신호 기술#57411:3,000 희석
Anti-α-Tubulin 항체sigma aldrichT90261:10,000 희석
단클론 Anti-Actin, &알파;-평활근 항체& 주의;sigma aldrichA52281:10,000 희석
Anti-N-cadherin 항체BD Transduction Laboratories#6109201:1,000 희석
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)GEHealthcareNA931-100UL1:20,000 dilution
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)GE HealthcareNA934-100UL1:20,000 희석
차단 시약GE HealthcareRPN4182% TBS-T
6 웰 클리어 플랫 바닥 TC 처리 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑corning#353046
100mm 세포 배양 접시TPP#93100
DMEM, 분말생명 기술12100-0464× DMEM
유형 1 콜라겐 젤Nitta 젤라틴Cellmatrix 유형 I-A
24 웰 세포 배양 플레이트AGC TECHNO GLASS1820-024
젤 문서화 시스템 ATTOAE-6911FXN겔 이미저
겔 분석 소프트웨어ATTODensitograph, ver.AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드라이프 기술25300054
24 웰 플레이트, 비처리IWAKI1820-024
트리판 블루 솔루션, 0.4%라이프 테크놀15250-061
RNA 추출 키트Qiagen74106
역전사 효소생명 기술18080044
실시간 PCR 시스템StratageneMx-3000P
SYBR 녹색 PCR 키트Qiagen204145
프로테아제 억제제 칵테일 (100x)생명 과학 기술78429
PVDF 멤브레인ATTO2392390
단백질 분석 키트bio-rad5000006JA 
폴리아크릴아미드 겔ATTO2331810
웨스턴 블로팅 검출 시약GE 헬스케어RPN2232
콜드 CCD 카메라ATTOEz-Capture MG/ST
트립신 억제제시그마 알드리치T9003-100MG
폴리옥시에틸렌 (20)소르비탄 모노라우레이트Wako Laboratory chemicals163-11512
폴 리 옥시 에틸렌 (9) 옥 티 페닐 에테르와코 연구소 화학 물질141-08321
로지스

참고문헌

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