단백질 분해에서의 사이클로 헥시 미드 체이스 분석<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em

요약

단백질 풍부도는 단백질 합성과 단백질 분해 속도를 모두 반영합니다. 이 기사에서는 단세포 진핵생물인 Saccharomyces cerevisiae(발아 효모)의 단백질 분해를 분석하기 위해 cycloheximide chase 후 western blotting을 사용하는 방법을 설명합니다.

초록

단백질 풍부 규제는 거의 모든 세포 과정에 매우 중요합니다. 단백질 풍부 단백질 합성 및 단백질 분해의 속도의 통합을 반영한다. 단백질 풍부한보고 많은 분석은 단백질 수준에서 번역 및 단백질 분해의 상대적인 효과의 차별을 허용하지 않습니다 (예를 들어, 단일 시점 웨스턴 블로 팅, 세포 계측법 형광 현미경, 또는 성장 기반 기자 분석 흐름). 이 문서는 특히 모델 단세포 진핵 생물의 단백질 분해를 분석하는 서양 블롯 다음 사이클로 헥시 미드 체이스의 사용, 사카로 마이 세스 세레 비지에 (신진 효모)에 대해 설명합니다. 이 과정에서, 효모 세포는 번역 억제제 인 사이클로 헥시 미드의 존재 하에서 배양 하였다. 세포의 분액 후 cycloheximide에 첨가 한 다음에 특정 시점에서 즉시 수집된다. 세포를 용해하고, 용 해물은 fo를 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 분리되고각 시점에서 단백질 풍부의 웨스턴 블롯 분석을 r에. 사이클로 헥 체이스 과정은 세포 단백질의 다양한 정상 모집단의 분해 동태 가시화를 허용한다. 절차는 단백질 분해에 대한 유전 적 및 환경 조건의 영향을 조사하기 위하여 사용될 수있다.

서론

단백질은 거의 모든 세포 과정에 중요한 기능을 수행합니다. 많은 생리 학적 과정은 시간 또는 특정 상황에서 정의 된 기간 동안에 특정 단백질 (또는 단백질)의 존재를 필요로한다. 생물 따라서 모니터링 및 세포 요구 ^{한 사항을} 충족하기 위해 단백질 풍부를 조절한다. 예를 들어, 사이클린 (세포 분열 제어 단백질)는 세포주기의 특정 단계에 존재하며, 규제 사이클린 레벨의 손실은 악성 ^종양이 형성과 관련되어있다. 셀룰러 요구를 충족하기 위해 단백질 레벨을 조절하는 것 외에도, 세포는 잘못 폴딩, 조립되지 않은, 또는 기타 비정상적 단백질 분자 ^(3)을 제거 degradative 품질 제어 메커니즘을 사용한다. 단백질 풍부의 제어는 고분자 합성 (전사 및 번역) 및 분해 (RNA의 부패와 단백질 분해) 모두의 규정을 포함한다. 장애 또는 과도한 단백질 분해 여러 병리에 기여암, 낭포 성 섬유증, 신경 변성 상태, 및 심혈관 질환을 포함 ^4-8. 단백질 분해 메커니즘은 따라서 질병 ^9-12의 범위 유망한 치료 목표를 나타냅니다.

하나의 시점에서 단백질의 분석은 합성 또는 분해의 상대적 기여도를 공개하지 않고 정상 상태의 단백질 풍부의 스냅 샷을 제공합....

프로토콜

효모 세포의 1. 성장과 수확

1. 내인성 효모 단백질 분해 동력학을 분석하지 않으면, 관심있는 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 원하는 효모 균주 (들)을 변형. 효모를 형질 전환하기위한 신뢰할 수있는 방법은 이전에 ^37을 설명 하였다.
2. 적절한 배지 5ml에 접종, 효모 (예를 들어, 형질 전환 된 세포를 비 형질 전환 세포에 대한 비 선택적 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 매체의 플라스미드 유지를위한 선택적 합성 정의 (SD) 중). 회전, 30 ° C에서 밤새 품어.
   참고 : 30 ° C 전형적인 야생형 실험실 효모 ^(38)에 대한 최적 성장 온도이다. 몇몇 돌연변이 효모 균주는 30 ℃에서 최적 성장하지 않고, 일부 단백질은 온도에 따라 저하를 겪게 때문에, 효모 세포 성장 및 사이클로 헥시 미드의 추적에 사용되는 온도는 ³⁹ 경험적으로 결정되어야한다.
3. 일을 측정각 하룻밤 문화의 600 nm의 (OD _600)에서 전자 광학 밀도.
   참고 : 세포 대수 또는 고정 성장 단계에있을 수 있지만 최소한 = OD _(600)에 희석 수 있도록 0.2 새로운 배지 ml의 15 것이다 밀도에 도....

결과

사이클로 헥시 미드 체이스 방법을 설명하기 위해, Deg1 -Sec62의 안정성 (그림 1), 모델 효모 소포체 (ER) -associated 저하 (ERAD) 기판, ^42-44을 분석 하였다. ERAD에서 품질 관리 유비퀴틴 리가 아제 효소는 공유 결합 ER 막에 지역화 된 비정상적인 단백질에있는 작은 단백질의 유비퀴틴의 체인을 연결합니다. 이러한 polyubiquitylated 단백질이어서 ER에서 제거되고 테아 큰, 세포질 프로테아제 ^(45)에 의해 분해된다. 그것은 지속적으로하고 비정상적으로 translocon, 응급실 루멘 또는 막 ^(43)에 단백질 전위를 용이하게하는 채널을 결합 후 Deg1 -Sec62 단백질은 분해의 대상이된다. 유사하게, 포유 동물의 아포 B, 저밀도 리포 단백질의 단백질 성분은 지속적 ER의 translocon 결합.......

토론

본 논문에서는 단백질 분해의 동력학을 분석하는 방법이 제시된다. 이러한 기술은 용이하게하는 다양한 메커니즘에 의해 열화 된 단백질의 범위에 적용될 수있다. 또한 사이클로 헥 체이스 실험 주어진 단백질의 정상 풀 분해 동역학보고 것이 중요하다. 다른 기술은 단백질의 특정 집단의 분해 동력학을 분석하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 초기 폴리 펩타이드의 degradative 운명은 펄스 추적 분석 ^(55)에 의해 추적 할 수 있습니다. 이러한 실험에서, 초기 단백질 간단히 펄스 - 표지 (예, 방사성 아미노산)이다. (또는 정상 상태의 단백질 풍부의 변화를 반영하지 않을 수도 있습니다) 표지 된 초기 단백질의 풍부한의 변화는 시간이 지남에 따라 추적 할 수있다.

사이클로 헥 체이스 (즉, 최대 2 시간) 상대적으로 짧은 시간 과정 동안 단백질의 안정성을 분석하기에 적합하다. 긴 시간 C 이상ourses (즉, 이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
원하는 효모 균주, 플라스미드, 표준 배지 및 완충액 구성 요소
일회용 붕규산 유리관	Fisher Scientific	14-961-32	다양한 제조업체에서 제공
온도 조절 인큐베이터(예: Heratherm 인큐베이터 모델 IMH180)	Dot Scientific	51028068	다양한 제조업체에서 사용 가능
18mm 튜브용 New Brunswick 교체 가능 드럼(튜브 롤러)	New Brunswick	M1053-0450	현탁액 효모 세포의 스타터 배양을 밤새 유지하려면 튜브 롤러를 사용하는 것이 좋습니다. 또는 튜브 롤러를 사용할 수 없는 경우 온도 제어 인큐베이터의 플랫폼 쉐이커를 사용하여 야간 스타터 배양을 수행할 수 있습니다. 플랫폼 셰이커 또는 튜브 롤러는 서스펜션에서 더 큰 배양을 유지하는 데 사용할 수 있습니다.
New Brunswick TC-7 롤러 드럼 120 V 50/60 H	New Brunswick	M1053-4004	튜브 롤러
SmartSpec Plus 분광광도계	Bio-Rad	170-2525	다양한 제조사에서 사용 가능
Centrifuge 5430	Eppendorf	5427 000.216	장치와 함께 판매되는 로터에는 1.5 및 2.0ml 마이크로 원심분리기 튜브가 있습니다. 로터는 15 및 50 ml 코니컬 튜브를 수용할 수 있는 로터로 교체
고정각 로터 F-35-6-30 (뚜껑 및 어댑터 포함) 원심분리기 모델 5430/R, 15/50 ml 코니컬 튜브, 6-Place	Eppendorf	F-35-6-30
15-ml 스크린 인쇄 나사 캡 튜브 17 x 20 mm 원추형, 폴리프로필렌	Sarstedt	62.554.205	다양한 제조업체에서 제공
1.5-ml 플렉스 튜브, PCR clean, natural microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364120	다양한 제조사에서 구할 수
Analog Dri-bath 히터	Fisher Scientific	1172011AQ	두 개의 히터를 사용할 수 있는 것이 좋습니다(하나는 cycloheximide 처리 중 세포 배양용이고 다른 하나는 단백질을 변성시키기 위해 용해물을 끓이기 위한 것임). 또는 30 ° C 수조는 시클로헥시미드가 있는 상태에서 세포를 배양하는 데 사용할 수 있습니다. 열판이 있는 끓는 물 목욕은 단백질을 변성시키는 데 번갈아 사용할 수 있습니다.
12 x 15 ml 코니컬 튜브용 가열 블록	Fisher Scientific	11-473-70	시클로헥시미드가 있는 상태에서 세포를 배양하는 동안 Dri-Bath Heater와 함께 사용합니다.
20 x 1.5 ml 코니컬 튜브용 가열 블록	Fisher Scientific	11-718-9Q	단백질 변성을 위해 용해물을 끓이기 위해 Dri-Bath Heater와 함께 사용합니다.
SDS-PAGE 실행 및 전송 장치, 전원 공급 장치 및 이미징 장비 또는 SDS-PAGE 및 멤브레인			실험실 및 애플리케이션에 따라 다름
웨스턴 블롯 이미징 시스템(예: Li-Cor Odyssey CLx 스캐너 및 Image Studio 소프트웨어)	Li-Cor	9140-01	실험실 및 애플리케이션에 따라 다름
EMD Millipore Immobilon PVDF 트랜스퍼 멤브레인	Fisher Scientific	IPFL00010	실험실 및 애플리케이션에 따라 다릅니다
1차 항체 (e. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) 단클론 항체, 마우스 (클론 22C5D8))Life	Technologies	459250	실험실 및 애플리케이션에 따라 다릅니다
2차 항체 (e. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))	Life Technologies	A-21065	실험실 및 애플리케이션에 따라 다릅니다

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