쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

요약

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

초록

격리와 큰 혈관에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)의 문화가 잘 확립하는 동안, 우리는 관상 동맥에서 분리하고 배양 혈관 평활근 세포 노력했다. 완전한 대동맥 아치 하트 제거 소화 용액 콜라겐 타입 II, 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 및 1 M _CaCl2를 300 단위 / ㎖를 함유하는 역행 랑겐 돌프 통해 관류 하였다. 관류 도금 배지에서 재현 탁하고 원심 분리하여 펠렛을 90 분 동안 15 분 간격으로 수집하고, 조직 배양 접시에서 배양 하였다. 혈관 평활근 세포는 SM22α의 존재, α-SMA 및 vimentin에 의해 특징했다. 이 기술을 사용하는 중요한 장점 중 하나는 마우스의 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. 세포가 이용 될 수있는 애플리케이션들을 제한 할 수 얻어지는 세포의 소수 절연 관상 혈관 평활근 세포는 잘 확립 세포 배양 기술과 ASSA 다양한 사용할 수 있지만YS. 유전자 변형 생쥐에서 혈관 평활근 세포를 조사 연구는 구조 - 기능 및 혈관 병변과 관련된 신호 전달 과정에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.

서론

이 방법의 목적은 세포 배양 및 표준 세포 배양 분석에 사용하기 위해 뮤린 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)를 분리한다. 우리는 당뇨병에서 혈관 재 형성의 분자 메커니즘을 평가하기 위해이 기술을 개발했다. 우리는 이전에 당뇨병 ^(1)의 모델 db / db 마우스에서의 관상 동맥에 중격 비대 리모델링 내측보고 하였다. 때문에 쥐의 중격 관상 동맥에있는 조직의 제한된 양, dB / dB 및 제어 마우스에서 단백질의 변화 (예를 들어, 웨스턴 블롯을) 조사 표준 실험 방법은 가장 어렵습니다. 또한, 우리는 이전에 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)의 로사 르탄이 dB / db 마우스 ^2에서 관찰 된 리모델링을 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 관상 동맥에서 주요 혈관 평활근 세포의 분리는 우리가 더 contribu 수있다 당뇨병 쥐의 혈관 평활근 세포 표현형의 변화 또는 신호 활성화 경로를 조사 할 수 있습니다이상 관상 동맥 세동맥 리모델링에 팅.

많은 연구가 아니라 각 특정 혈관 침대에서보다 쥐 대동맥에서 고립 된 혈관 평활근 세포를 사용하여 표준 신호 전달 경로를 밝혀왔다. 그러나, 우리는 다를 수 있습니다 각 혈관 침대에서 혈관 평활근 세포를 제안, 혈관 침대....

프로토콜

윤리 진술 : 본 연구는 건강 지침의 국립 연구소에 따라 실시하고,이를 전국 어린이 병원에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.

1. 준비 / 설정

주 :이 분리 기술은 링 스탠드에 나란히 위치하는 두 랑겐 돌프 가열 코일을 필요로하고, 순환 수조에 병렬로 연결된다.

1. 물 목욕을 순환 켜고 랑겐 돌프 정맥의 끝에서 33 ~ 34 ° C의 최종 온도를 달성하기 위해 온도를 조절 (이에 사용 된 수조 인해 6-7 ° C를 손실 40 ° C로 설정 설정 튜브를 가로 지르는 온도). 관류 펌프의 전원을 켜고 0.5 ml / 분으로 관류 속도를 설정합니다.
   1. 멸균 초순수 100 ml의 다음 70 % 에탄올 50 ㎖, 각 플러싱에 의해 물 자켓 가열 코일의 모두 연결된 배관 및 25 게이지 뉼러를 청소한다.
   2. 가열 코일을 취소합니다주사기로 공기를 밀어 페놀 레드없이 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 10 mL로 씻는다. 가열 코일 튜브에 HBSS를 남겨주세요.
   3. 튜브에 페놀 레드없이 실온 HBSS 가득 멸균 10 ㎖의 루어 락 주사기를 연결합니다. 이 부정적인 혈관 평활근 세포의 분리에 영향을 소화하는 동안 공기 색전을 일으킬 수로 HBSS 채워진 주사기를 부착 할 때 공기 방울이 튜브 가열....

결과

우리 인해 관상 혈관 평활근 세포 분리 방법의 신규 한 양상으로, 우리는 세포 분리의 순도를 결정하기 위해 노력했다. 마우스 관상 혈관 평활근 세포는 먼저 세척 후 배양 세포의 형태에 기초하여 통로 (2)에 그 형태 및 면역 형광 염색해서 기초하여 식별하고, 상기 분리 과정은 효과적으로 심장 근육 세포 및 내피 세포를 제거한다. 혈관 평활근 세포는 통로 (2) (그림 1)까지 그 형태를 유지한다. 그러나, 삽입 및 외막 섬유 아세포에 의한 오염의 우려가있다. 이 잠재적 인 혼동을 배제하기 위해, 우리는 SM22α에 대한 분리 된 세포를 염색, α-평활근 액틴 (α-SMA), 혈관 평활근 세포 모두 구절 1-2 (그림 2)에서, ^{7, 8,} 및 vimentin에, 섬유 아세포 마커 ⁽⁹⁾ 마커. 우리는 우리의 세포 격리가 CD31없는 것을 우리는 또한 보여 통로 (2)를 통.......

토론

이 연구의 목적은 쥐 하트 매끄러운 관상 혈관의 수율을 높이기 위해 기존의 셀 분리 프로토콜을 적용 하였다. 혈관 평활근 생물학에서 선구적인 작업의 대부분은 배양 된 쥐의 대동맥 평활근 세포로 하였다. 이 연구는 혈관 평활근 세포의 성장, 마이그레이션 및 비대 ^{(7)을 제어하는} 분자 메커니즘의 기초 지식을 제공했다. 필드가 진행하지만, 그것은 VSMC 표현형 및 기능 혈관계 특정 요인에 의해 제어되는 것을 명백하게되었다. 예를 들어, 말초 혈관에 비해 관상 동맥는 다른 기능의 응답을 표시 부상에 대한 응답 성장의 고유 한 패턴을 전시 및 채널, 수용체 및 신호 분자 ^{(10, 11)의} 독특한 배열을 표시합니다. 혈관이 수축 심근에 의해 수축기 동안 압축되기 때문에 관상 침대는 고유 한 혈역학 적 힘에 노출된다. 우리의 최근 작업은 코론을 제안합니다제 2 형 당뇨병 dB / db 마우스에서 진 미세 혈관 리모델링은 대동맥 및 장간막 저항 ^{혈관, 12} 달랐다. 낮은 통로 혈.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
태아 소 세럼	Life Technologies	16140-071
HEPES 1 M 용액	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20 ml	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (고포도당, 나트륨 피루베이트, L-글루타민)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100x	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
멸균 세포 여과기 100 µ m 나일론 메시	Fisher	22363549
Nunclon 폴리스렌 접시 뚜껑, 멸균, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus 검정 실크 봉합사 5-0	Fisher	14-516-124
Collagenase Type-2	Worthington Biochemical	LS004176
대두 트립신 억제제 25 mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) (1x), 액체(투명)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) (1x), 액체(페놀 레드)	Life Technologies	14170-161
탈기 버블 트랩이 있는 5.0ml 가열 코일	Radnoti	158830
11 플러스 펌프	Harvard Apparatus	70-2208
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