방법 논문

마우스 렌즈의 압축 강성을 평가하는 유리 Coverslips는 순차적으로 응용 프로그램 : 스트레인과 형태 학적 분석

DOI:

10.3791/53986

⸱

2016년 5월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

노화와 관련된 눈렌즈 뻣뻣함의 증가는 노안과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 렌즈의 강성을 측정하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 쥐 렌즈는 사람 렌즈와 마찬가지로 나이가 들면서 더 뻣뻣해집니다. 이 방법은 정확하며 더 큰 동물의 렌즈에 적용할 수 있습니다.

초록

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눈 렌즈는 굴절 및 망막에 선명한 화상을 형성하는 광을 집중 투명 기관이다. 인간, 모양체 근육 계약은 가까운 물체에 초점 렌즈 '광 파워, 숙박 시설로 알려진 공정의 증가로 이어지는, 렌즈를 변형합니다. 렌즈 강성 연령 관련 변경 사항이 노안에 연결되었습니다 확장하여 수용 할 수있는 렌즈의 능력 감소하고, 안경을 독서의 필요성. 마우스 렌즈 수용 노안을 개발하지 않더라도, 마우스 모델 이해 렌즈 병리위한 귀중한 유전 적 수단을 제공 할 수 있으며, 마우스에서 관찰 된 가속 열화 렌즈의 연령과 관련된 변화에 대한 연구를 가능하게한다. 이 프로토콜은, 마우스 렌즈 강도를 결정 순차적으로 적용되는 렌즈에 압축 하중을 증가시키는 커버 글라스를 사용하는 단순하고 정확하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 대표적인 데이터는 마우스 렌즈처럼 나이가 엄격한되고 있는지 확인인간의 렌즈. 이 방법은 높은 재현성과 잠재적으로 더 큰 동물 시험 렌즈를 기계적으로까지 확장 할 수 있습니다.

서론

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수정체는 안구 전방에 있는 투명하고 무혈관적인 기관으로, 망막에 빛을 미세하게 집중시키는 역할을 합니다. 수정체 캡슐(lens capsule)이라고 하는 투명한 기저막은 상피 세포의 전방 단층으로 덮인 대량의 길쭉한 섬유 세포를 둘러쌉니다1,2. 수정체의 평생 성장은 수정체 적도에서 상피 세포가 동심원 방식으로 이전 세대의 섬유 세포에 추가되는 새로운 섬유 세포로 지속적으로 증식하고 분화하는 데 달려 있습니다2. 시간이 지남에 따라 수정체 섬유 세포는 압축을 거쳐 수정체 중앙에핵 1이라고 하는 단단한 중심이 생깁니다. 눈의 광학적 힘의 시시적 변화로 정의되는 조절은 인간에서 모양체근이 수축하여 수정체를 변형시키고 가까운 물체3-5에 초점을 맞추기 위해 광학적 힘이 실제로 증가할 때 발생합니다. 수용되지 않은 눈에서 수정체는 구역 섬유의 장력으로 인해 상대적으로 평평한 상태로 유지됩니다. 모양모근이 수축하면 수정체의 장력이 풀려 수정체의 적도 직경이 감소하고 축 방향 두께가 증가합니다. 노화와 관련된 수정체의 변화는 수정체 조절의 점진적인 상실인 노안을 유발하여 돋보기의 필요성으로 이어집니다.

여러 연구에서 노안이 노화와 관련된 수정체 내재적 강성 증가와 관련이 있다고 합니다6-11. 강성은 하중이 가해졌을 때 변형되는 탄성 물체의 저항으로 정의됩니다. 인간 렌즈의 강성을 검사하기 위해 스핀 압축12-14, 액추에이터 압축15, 프로브 압흔16, 동적 기계 분석 6,10 및 버블 기반 음향 복사력17 등 다양한 방법이 사용되었습니다. 생쥐 렌즈는 노안을 수용하거나 발병하지 않지만, 생쥐는 대형 동물보다 저렴하고 유전적으로 잘 특성화되어 있으며 급격한 노화로 인해 노화와 관련된 변화가 가속화되기 때문에 렌즈 병리학을 위한 마우스 모델은 유용한 도구입니다. 소수의 연구에서는 압박 방법으로 생쥐의 수정체 강성을 조사한 결과, 노화 또는 표적화된 유전적 장애로 인한 수정체 강성의 변화를 입증했습니다18-21. 따라서 마우스 렌즈는 노화와 관련된 렌즈 강성 변화를 연구하는 데 좋은 모델입니다.

이 프로토콜은 해부 현미경 및 거울을 통해 렌즈를 촬영하는 것과 함께 렌즈에 유리 커버 슬립을 적용하여 마우스 렌즈의 강성을 결정하는 간단하고 저렴하면서도 정확하고 재현 가능한 압축 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 제작 및 조립된 장치를 사용하여 강력한 변형률 및 형태 측정 데이터를 생성합니다. 대표적인 결과는 마우스 렌즈가 나이가 들면서 강성이 증가한다는 것을 확인했습니다.

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프로토콜

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모든 동물의 절차는 스크립스 연구소의 기관 동물 케어 및 사용위원회의 보건 및 승인 된 프로토콜에 따라 국립 연구소에 의해 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행 하였다.

1. 렌즈 해부

  1. 건강 "실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"의 국립 연구소 및 승인 기관 동물 사용 프로토콜의 권장 사항에 따라 쥐를 안락사.
  2. 곡선 집게를 사용하여 마우스의 눈을 명백히하다. 소켓에서 눈을 가지고, 다음 집게로 소켓에서 눈을 뽑은 포셉과 눈 주위의 조직을 우울. 해부 접시에 신선한 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)에 눈을 전송합니다.
  3. 가능한 안구에 가까운 시신경을 잘라. 조심스럽게 조심스럽게 구멍 wher을 통해 안구에 잘 직선 핀셋을 삽입전자 시신경은 후방을 종료합니다.
  4. 조심스럽게 각막의 가장자리에 후방에서 안구에 가위로 절개를합니다. 설치류 렌즈는 눈의 ~ 30 %를 차지한다. 주의 깊게 절개를 확인하고 렌즈 손상을 방지하기 위해 너무 깊은 눈에 핀셋이나 가위를 삽입하지 않습니다.
  5. 안구 주위에 적어도 절반 방법의 각막과 공막 사이의 접합을 따라 잘라.
  6. 부드럽게 단계 1.4 및 1.5에서 만든 개구를 통해 안구로부터 렌즈를 제거하기 위해 각막에 누른다.
  7. 주의 깊게 여전히 렌즈에 부착되어있는 큰 이물질을 제거하기 위해 좋은 팁 직선의 집게를 사용합니다. 시각적으로 강성 측정을 진행하기 전에 손상은 렌즈를 검사합니다.

2. 강성 측정

  1. 분석 용 저울을 사용하여 동일한 박스에서 적어도 10 커버 슬립을 단다. 커버 슬립의 평균 무게를 찾을 수 있습니다. 일관성을 위해 모든 실험 된 커버와 동일한 상자를 사용합니다. 사전 젖은실험을 시작하기 전에 적어도 2 시간 동안 실온에서 1X PBS에서 커버 슬립 및 직각 미러.
  2. 1X PBS 75 mL로 - 측정 챔버를 채우기 (65) (도 1 참조). 측정 챔버는 사내 기계 공장으로 플렉시 유리로 만든 후, 챔버 내의 디 보트는 적절한 드릴 비트와 함께 원하는 깊이로 설정 드릴 프레스에 의해 만들어졌다. 렌즈 기계적 시험 기간 동안 실온에서 1X PBS 투명 남아있다.

figure-protocol-1
그림 1 :. 강성 측정 상공 회의소 다른 깊이와 모양의 디 보트의 다양한 사용자 정의 만든 강성 측정 챔버의 크기를 보여주는 사진입니다. 200 μm의 300 μm의 깊이 (노란색 화살촉) 인 라운드 디 보트는 마우스 렌즈의 측정에 사용된다. 디 보트는 2 직경 mm 및 ~ 13입니다-. 챔버의 가장자리에서 14mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 렌즈를 보유하는 데 사용되는 잔디에서 일정한 거리에있는 실에 직각 거울을 배치합니다. 거울은 실험 기간 동안 이동하지 않습니다 있는지 확인하십시오.
  2. 신중하게 장악 겸자 또는 곡선 집게로 측정 챔버로 전송 해부 렌즈.
  3. 직접 오버 헤드 무부하 렌즈의 상위 뷰 사진을 촬영합니다. 현미경 (아래)와 좌우의 광섬유 광원 해부에서 조명으로 30X 배율로 마우스 렌즈 사진을 찍어. 최대 광 강도의 80 %로 광섬유 전원 공급 장치를 설정한다. 필요에 따라 주변 조명, 사용자 선호도 및 화질에 기초하여 상기 전원 공급 장치의 출력을 조정한다.
  4. 로타리를 통해 알 수있는 무부하 렌즈의 측면도 픽쳐를 취할GHT 각도 거울. 카메라가 보정되지 않은 경우 초점 미러 에지의 사진을 촬영. 거울 가장자리 5 mm 길이, 그리고이 측정 이후의 화소 / mm를 결정하고 이미지의 스케일 바의 역할을하기 위해 사용될 수있다.
  5. 장소 상기 잔디에 렌즈와 렌즈가 잔디에 안전하고 바로 장착되어 있는지 확인합니다. 로드하기 전에 렌즈의 사진을 촬영합니다. 렌즈는 전방 또는 후방 극의 잔디에서 휴식해야한다.
  6. 렌즈에 부드럽게 한 커버 슬립을 놓습니다. 크리프를 허용하는 2 분을 기다린로드 렌즈의 또 다른 사이드 뷰 사진을 촬영합니다.
  7. 단계 2.8로 된 커버를 추가하고 10 커버 슬립의 총이 적용될 때까지 단계 2.8에서와 같이 각 커버 슬립을 첨가 한 후 사이드 뷰 사진 촬영을 계속.
  8. 모든 커버 슬립을 제거합니다. 2 분을 기다린 모든 된 커버를 제거한 후 렌즈 (내부와 외부 잔디의)의 사이드 뷰 사진을 촬영합니다.

3. 렌즈 핵 측정

  1. determ하려면렌즈 핵의 크기 이네, 1X PBS로 가득 깨끗한 페트리 접시에 렌즈를 이동합니다.
  2. 부드럽게 잘 직선 집게를 사용하여 렌즈를 디 캡슐.
  3. 슬라 오프 장갑을 낀 손가락으로 렌즈를 압연에 의한 대뇌 피질의 섬유 세포. 나머지 렌즈 핵 하드 대리석처럼 느낄 것이다. 세 1 개월부터 성인 렌즈의 핵을 분리하려면이 절차를 사용하십시오. 고립 핵 강체이기 때문에, 렌즈 핵의 상기 기계적 시험이 설명 된 방법을 사용하여 수행 될 수 없다.
  4. 조심스럽게 페트리 접시에 1X PBS의 렌즈 핵을 씻어.
  5. 다시 측정 챔버 (안 잔디에서)에 렌즈 핵을 배치하고 오른쪽 각도 거울을 통해 렌즈 핵의 이미지를 촬영.

figure-protocol-2
그림 2 :. 전의 Coverslips는에 의해 압축 된 마우스 렌즈 (A) 도식과 (B) 사진1X PBS로 가득 측정 챔버에서 200 μm의 깊은 잔디에 2 개월 된 마우스 렌즈를 보여주는 perimental 설정. 직각 미러 및 해부 현미경에 장착 된 디지털 카메라에 의해 압축 된 커버하는 동안 렌즈의 이미지를 수집 하였다. (C)를 순차 커버 슬립의 수를 증가시킴으로써 압축 2 개월 야생형 렌즈 시상 뷰 사진 축 적도 직경을 측정하고, 커버 슬립 기반 압축 테스트 중에 축 적도 변형 계산을위한 미가공 데이터를 제공했다. 렌즈의 반사는 때로 커버 슬립 (가장 눈에 잘 한 커버 슬립 이미지)에서 볼 수있다. 측정을 할 때의 반사를 무시하고, 렌즈의 정점까지 측정한다. (D) 상기 2 개월 야생형 렌즈 압축 후의 상기 절연 렌즈 핵의 시상 뷰 사진. 포스트 압축 렌즈와 격리 된 핵은 잔디 외부에 앉아있다. 스케일 바, 1mm. 이 수치는 Gokh에서 수정, 등. PLoS의 하나 2012 년 19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 이미지 분석

  1. 로딩 전에 ImageJ에 또는 유사한 소프트웨어를 이용하여 각각의 적재 단계 후 렌즈 적도 및 축 지름을 측정한다. 각 렌즈 핵의 직경을 측정한다. 어떤 방향에서 측정 19, 21을 충분하므로 렌즈 핵은 거의 구형이다.
  2. 사용 된 잔디의 깊이를 첨가하여 직경 축 렌즈를 수정한다. 측정 챔버에서 디봇은 렌즈의 축 방향 두께가 200㎛ 인 (2 개월 된 마우스 렌즈) 또는 300 ㎛의 (4 개월, 8 개월 된 마우스 렌즈)을 가려.
  3. , ε = (D - D 0) 식을 이용하여 렌즈 직경 측정으로부터 축 적도 균주 계산 ε 스트레인 인 / D 0, D는 수직 또는 E이고quatorial 주어진 부하에서 직경 및 D 0 제로 부하에 대응하는 수직 또는 수평 직경입니다.
  4. (밀리그램)에 부과 된 하중의 함수와 축과 적도 균주를 플롯.
  5. 축, 적도 핵 직경을 플롯. 계산하고 적도 지름 축 직경 나누어 렌즈 종횡비 플롯.
  6. 계산 방정식을 사용하여 렌즈 볼륨 플롯 부피 = R의 E는 적도 반경 R A는 단계 2.6에서 찍은 사진으로부터 측정 축 반경이다 4/3 × π × R E × 2 (R) A,. 이 방정식은 렌즈가 편원의 회전 타원체 (타원체) 1,22 가정합니다.
  7. 계산 단계 3.5에서 찍은 사진에서 측정 된 R N 렌즈 핵의 반경 (R)의 N 3 × 식 체적 = 4/3 × π의 핵을 사용하여 부피를 플롯. 이 방정식은, 렌즈 핵 제가 가정SA 구 19, 21.
  8. 계산 렌즈 볼륨 핵 부피의 비로 핵 분획을 플롯.

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결과

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강성 및 2-, 4-, 8 개월 된 마우스 렌즈의 크기를 측정 하였다. 마우스는 TSRI 동물 사육 시설에서 얻은 순수한 C57BL6 변형 배경 모두 야생형 동물이었고, 각각의 렌즈는 1~10 커버 슬립 적재 하였다. 축 적도 균주 각 커버 슬립을 첨가 한 후, 렌즈의 축 적도 직경을 측정 한 다음 해당 언로드 직경 직경 각 변화를 정규화하여 하중의 함수로서 계산 하였다. 각 세부터 여덟 렌즈를 테스트 한 결과는 평균 ± 표준 오차로서 표현된다. 이전 19에 도시 된 바와 같이, 축 방향 변형 하중 (도 3a)의 대수 함수이다. 최대 하중 (그림 3)에서 축 방향 및 적도 균주에서 통계적으로 유의 한 연령에 따라 감소는 마우스 렌즈 나이 경직을 나타냅니다 있었다. 성작은 표준 오차에 의해 입증 된 바와 같이 비 측정은 같은 나이의 렌즈를 통해 높은 재현성했다.

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토론

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렌즈의 강도를 측정하는이 방법을 사용할 때 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다. 챔버 (θ)의 저부에 대하여 - (8.5 ° 8) 우선, 커버 슬립 약간 비스듬한 각도로 렌즈에 적용된다. 이 적도에 축보다는 오히려 부하의 매우 작은 구성 요소를 적용한다. 그러나이 적도 부하가 죄 θ ≈ 0.1 (19) 때문에 무시할 간주됩니다. 이 방법은 큰 렌즈에 적합한 경우, 상기 챔버의 하부에 커버 슬립 각도 적도 부하 응력의 계산에 고려되어야하는지 결정하기 위해 측정 될 필요가있다. 둘째, 렌즈 커버 슬립 각 첨가 후 평형을 허용하는 것이 중요하다. 이분의 대기 기간은 시간에 따라 변형이 가능 (예., 크리프)는 렌즈 평형 형상 (19)에있을 때 화상만을 촬영되도록 일어나기. 셋째,이 프로토콜은 m에 압축 변형을 측정하기에 최적화되어 있습니다부하의 넓은 동적 범위에 걸쳐 렌즈를 여러개. 파일럿 연구에서, 1293 mg의 (즉 10 18 X 18mm의 커버 슬립)의...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 National Eye Institute Grant R01 EY017724(VMF)과 National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant K99 AR066534(DSG)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파인 팁 스트레이트 파이언티픽스 파인 사이언티픽 툴11252-40
미세해부 가위, 스트레이트 엣지파인 사이언티픽 툴15000-00
곡선 펜치파인 사이언티픽 툴11272-40
압수 펜치HammacherHSC 702-93선택적
해부 접시Fisher Scientific12565154
60mm 페트리 접시Fisher Scientific0875713A
1x 인산염 완충 식염수(PBS)Life Technologies14190
18 x 18mm 유리 커버슬립Fisher Scientific12-542A
렌즈맞춤형(<강한>그림 1 참조)
직각 거울Edmund Optics45-591
광원Schott/Fostec8375
조명 해부 현미경OlympusSZX-ILLD100SZ-PT 포토튜브
디지털 카메라NikonCoolpix 990
를 고정하기 위한 디봇이 있는 측정 챔버

참고문헌

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