공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

아교 모세포종의 홍반 진단 ^{1, 2의} 시간에서 약 12 개월 평균 생존과 적극적인 인간의 뇌 암이다. 교 모세포종은 표준 화학 요법과 수술 적 절제에 난치성 인으로 가장 치명적인 임상 도전 암 중 하나입니다. 아교 모세포종의 확산 특성은 수술로 완전히 절제에 고급 종양이 사실상 불가능하게 정상 뇌 전체에 확산 종양 세포 수 있습니다. 이 매우 침습적 인 측면은 교 모세포종 및 기타 고급 성상 세포종의 특징 특징이다. 따라서, 많은 연구의 초점은 아교 모세포종 세포 침윤의 분자 메커니즘왔다. 아교 모세포종 종양 미세 환경은 악성 종양 ^3-6 확립에 중요한 역할을한다. 종양 관련된 대 식세포는 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종 침공 ^{7,8 홍보에} 대한 책임 것으로 나타났다. 이러한 연구의 대부분은 사용하지만 식세포 / 미세 아교 세포의 효과를 측정물리적으로 아교 모세포종 세포에서 구분 분석. 우리의 실험은 우리가 아교 모세포종 침공이 공 배양에서 대 식세포 / 미세 아교 세포에 의존하는 방법을 연구하고 침략하는 동안 이미지에 그들 사이의 물리적 상호 작용을 우리를 활성화 할 수 있도록 개선 된 분석을 생성하기 위해 밖으로 설정하고있다.

클래식 분석은 세포 침공은 "표준"보이든 챔버 화성과 chemoinvasion 형식을 포함 측정합니다. 공부하는 여기에 세포를 지정된 크기 (직경 일반적으로 사이 0.4 및 8 μM)의 구멍이 하단에 폴리 카보네이트 필터가 포함 된 플라스틱 챔버에서 도금. 세포 침윤의 방법은 일반적으로 세포 외 매트릭스 단백질로 이루어진 물리적 배리어를 포함한다. chemoinvasion 분석에서 사용 된 바람직한 행렬은 마트 리겔 (이하, "매트릭스"라 함), Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS)에 의해 분비 된 세포 외 매트릭스 단백질의 혼합물을 마우스 육종 세포이며 크게 COL 이루어져lagen 유형 IV 및 라미닌. 챔버 후 또는 침윤을 촉진하는 것으로 의심되는 성장 인자없이 세포 배양액을 포함하는 조직 배양 웰에 배치된다. 더 높은 주파수에서 세포 외 기질 코팅 된 필터를 통해 침투하고, 필터의 하측에 부착하는 높은 침윤성 용량 셀. 우리는 아교 모세포종 세포 침윤에 미세 아교 세포 및 종양 연관된 대 식세포의 역할을 평가하기 위해이 시험을 수정했다.

10 배 ^9,10 - 우리는 미세 아교 세포는 5 개의 아교 모세포종 세포 라인의 침공을 자극 할 수있는이 문서에서 설명 공 배양 분석을 사용하여 확인 할 수 있었다. 이 아교 모세포종의 동물 모델에서 관찰되는 것을 반영한다. 더욱이, 우리는 아교 모세포종 세포와 대 식세포 간의 상호 작용 / 미세 아교 세포가보다 직접적으로 검토 할 수있는 입체 침윤 분석을 개발 하였다. macropha에 의해 자극 아교 모세포종 세포 침윤의 정도3 차원 분석에서 GES / 미세 아교 매트릭스 코팅 챔버 방식을 사용하여 본 것과 대등하다. 비슷한 분석은 이전에 침공 ^{11 ~ 13시} 대 식세포와 유방암의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 문서에 설명 된 두 가지 방법은 아교 모세포종 세포의 식세포 / 미세 아교 세포 자극 침공의 분자 메커니즘 (들)을 해부 할 수있는 능력에 도움이됩니다.

세포의 1. 형광 표식

참고 : 형광 염료 ⁹ 레이블 아교 모세포종 세포주 및 미세 아교 세포. 대안 적으로, ^14에서 설명한 바와 같이 이러한 구조적 GFP / RFP 형광 단백질을 발현 세포주를 생성한다.

1. 염색의 날에 80 % 합류 - 6 웰 플레이트에 플레이트 세포는 70이 될 것이다하도록. 뮤린 아교 모세포종 세포주 GL261 인간 아교 모세포종 세포주 U87, 플레이트 1 × ¹⁰⁶ 1.5 × ¹⁰⁶ 세포에 각각 염색 전에 6cm 접시에 24 시간.
2. , DMSO에 형광 세포 염색 염료 솔루션을 준비하고 미디어에 5 μm의 염료를 추가하거나 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 또는 대 식세포 무 혈청 배지 (MSFM), 잘 소용돌이.
3. 37 ° C에서 30 분, 5 % CO _2의 염료로 세포를 인큐베이션.
4. 염료 포함 된 용지를 제거하고 세포에 신선한 미디어 (RPMI 또는 MSFM)를 추가합니다.
5. 30 분 동안 세포를 품어. 참고 : 세포는 지금염색 준비가 실험에 사용된다.

2. 사전 코팅 매트릭스 상공 회의소 공동 배양 침략 분석

1. 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) ^(15)를 사용하여 THP-1 세포 분화.
   1. 접시 2 - 6 웰 배양 접시에 RPMI / 10 % FBS, 1.5 ml의 3 × ¹⁰⁵ THP-1 세포. 즉시 도금 후 100 나노 PMA를 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화.
      참고 : 48 시간 후, 성공적으로 차별화를받은 THP-1 세포가 부착되며 잘 둥근 형태에 복용의 바닥에 퍼졌다.
   2. 1X PBS로 한번 세척하여 PMA를 제거하고 신선한 RPMI / 10 % FBS로 교체합니다. 세포 분석에 사용할 준비가 될 때까지 또 다른 48 시간을 기다립니다.
2. 잘 형 미디어 500 μl를 포함하는 (아무 혈청)에 배치하고 상단 형 미디어의 500 μl를 추가하여 매트릭스 사전 코팅 챔버 평형. 37 ° C에서 2 시간 5 % CO ₂ 챔버를 품어.
   재료 / 장비의 표를 참조하십시오.
3. 부드럽게 세포 (형광 표지 된 아교 모세포종 세포 라인과 미세 아교 세포 / 대 식세포)를 분리하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 세포 배양기에서 10 분 5 % CO _2.
4. 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포.
5. 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
6. MSFM / 0.3 % BSA 배지에서 기음 뜨는 재현 탁 펠렛 또는 (U87 및 THP-1 세포) RPMI / 0.3 % BSA (GL261 세포 및 미세 아교 세포의 경우) 세포의 농도가 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml로 동일 같은 것을 . 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다.
7. 24 웰 플레이트의 웰 당 500 ㎕의 미디어 / 0.3 % BSA를 추가합니다.
8. 적어도 2 시간 (단계 2.2)에 대한 평형 된 챔버에서 용지를 제거합니다. 장소 chambe잘 500 μL 미디어 / 0.3 % BSA (단계 2.7)를 포함에서 RS.
9. 억제제는 마크로파지에 미치는 효과를 연구하기 위해 사용되는 경우 / 미세 아교 세포는 하부 챔버의 상부 부분 모두에 적절한 농도를 추가 교종 침윤 자극.
   주 : CSF-1R의 농도 GL261 아교 모세포종의 침윤이 기준 ^9에서 발견 될 수 자극 완전히 미세 아교 세포를 억제하는 데 억제제.
10. 마우스 아교 모세포종 (2.10.1) 인간 아교 모세포종 (2.10.2)에 사용되는 세포주에 따라 다음의 두 단계로 설명 된 바와 같이 상부 챔버에 셀을 추가한다.
    1. 1.5 × 10 ⁵ GL261 (아교 모세포종) 세포 (150 μL), 5 × 10 ⁴ 마우스 미세 아교 세포 (50 μl를) (미디어 자세한 내용은 단계 2.6 참조) 섞는다. 300 μL MSFM / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화.
       참고 : 나는 설명 된대로 쥐 미세 아교 세포는 신생아 쥐에서 분리되어n은 ^{1 6.}

7.5 × 10 ⁴ U87 (아교 모세포종) 세포 (75 μL) 2.5 × 10 ⁴ THP1 (대 식세포) 세포 (25 μL)을 섞는다. 400 μl의 RPMI / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가합니다. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO _2에서 세포를 품어.

1. 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. 이미지 분석을위한 섹션 4로 넘어갑니다.
   참고 : 실험이 순간에 일시 정지와 1X PBS에서 영상 저장할 수 있습니다. 형광 염료의 신호가 고정 후까지 2 주간 검출 할 수있다.

매트릭스에서 신경 교종 및 대 식세포 / 미세 아교 세포를 -embedding 3. 침략 분석 "3D"

1. 밤새 4 ° C에서 해동 매트릭스 믹스. 후드에서 얼음에 매트릭스를 사용하여 모든 추가 조작을 수행합니다.
2. 얼음에 0.3 % BSA와 미디어 매트릭스의 10 ㎎ / ㎖ 농도 (MSFM 또는 RPMI)를 준비합니다.
   참고 : 행렬의 재고 농도는 일반적으로 약 15 ㎎ / ㎖이다.
3. 매트릭스 서스펜션 (1 단계에서 표시) 세포를 준비하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 셀에 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 인큐베이터에서 10 분 5 % CO _2.
4. 0.3 % BSA를 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포.
5. 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
6. 펠렛에서 대기음 뜨는. 세포의 농도가 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml로 동일하도록 미디어 / 0.3 % BSA에 재현 탁 펠릿. 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다.
7. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 + 5 × 10 ⁴ 미세 아교 세포 (50 μL에서) (150 μL)에 1.5 × 10 ⁵ GL261 세포를 추가합니다.별도의 1.5 ML의의 microfuge 튜브에 2 × 10 ⁵ GL261 세포 (200 μL)를 추가합니다.
   참고 형 미세 아교없이 GL261 세포는 대조군으로 작용한다.
8. 120 X g에서 5 분의 microfuge에 스핀 세포.
9. 얼음에 200 μl의 차가운 매트릭스를 Resuspend 세포.
10. 8 μM 공경 챔버 인서트의 상부 구획의 중앙 판 (50) 상 μL (50,000 세포).
11. 중합이 발생하여 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
12. 하부 웰에 상부 챔버 700 ㎕의 혈청을 포함하는 세포 증식 배지에 200 μL의 혈청 배지를 추가한다.
13. 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO _2에서 품어.
14. 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. (4) FO로 진행R 영상 분석.

4. 영상 분석 실험

1. 3.7 %의 포름 알데히드에서 챔버를 제거하고 PBS 1 배 신선한 500 μl를 포함하는 잘 씻는다.
   참고 : 챔버 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
2. 목화 팁 어플리케이터를 사용하여 부드럽게 필터 표면을 긁어 필터의 상단부 (측 챔버의 내부를 향하는)에서 비파괴 세포를 세척. 부드럽게 시작하고 점차적으로 압력을 증가. 챔버 당이 적어도 3 회를 수행합니다.
3. 중 유리 바닥 접시에 실을 놓거나 24 웰 플레이트에 둡니다.
4. 카메라와 이미지 캡처 소프트웨어 ^{(9, 10)가} 장착 된 epifluorescent 또는 레이저 공 초점 형광 현미경의 무대에서 샘플을 놓습니다.
5. 대표적인 필드의 몇 배 또는 20 배의 이미지를 가져 가라.
6. 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 하부 ^9,10-에 필터를 넘었다 아교 모세포종 세포의 수를 계산.
7. 은 "3D 이미징 경우. 4.6 전술 - "침략 분석 (3 절에 기재된), 형광 레이저 공 초점 현미경 ^5-6를 사용하여 Z 스택 시리즈를 생성하는 이미지에 필터의 하부에 침입 세포 집단을, 프로토콜을 따라 4.2 단계를 반복합니다.

여기에 설명 된 방법을 사용하여, 우리는 미세 아교 세포와 대 식세포가 실질적으로 아교 모세포종 세포 침공을 자극 할 수 있음을 보여 주었다. 두 개의 다른 침윤 분석이 이용되고도 1에 도시된다.도 2에서, 구조적 형광 단백질을 발현 mCherry GL261 세포와 48 시간 동안 미세 아교없이 프리 코팅 챔버에서 배양 하였다. 미세 아교 세포로 침입 용량이 약 10 배 증가하지만 때 배양 GL261 세포는 자신에 대한 최소 침습했다.

우리는 인간 세포주를 사용하여 유사한 효과를 관찰한다. 차별화 된 THP-1 세포와 공 배양 할 때 그림 3에서 (5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 녹색으로 염색) U87 세포는 5 ~ 6 배 높은 침략을 보여줍니다. THP-1 (급성 단핵구 백혈병 환자에서 파생 된) 인간 단핵구 세포주 될 수 있습니다 디입니다포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (15)을 사용하여 대 식세포와 같은 상태로 fferentiated. 분화 된 THP-1 세포는 시토 킨 분비 및 포식 작용을 수행하는 등, 인간 대 식세포의 많은 특성을 표시.

대안 적으로, 세포 침윤 매트릭스들을 포함하고, 챔버 인서트 필터 상에 직접 도금에 의해 측정 될 수있다. 공 초점 레이저 현미경 삼차원 표현 (Z 스택)를 생성 일련의 이미지를 생성 할 수있다. 매트릭스 코팅 챔버 분석에서 관찰되는 것과 유사한 (도면에 도시는 2-3)을 교차 한 세포의 수에 의해 측정 (CMPTX 적색 염색) 미세 아교 세포의 공 배양을 침범 GL261 세포 (CMFDA 녹색)을 자극 필터의 밑면 (도 4). 이 형식은 glio 사이의 잠재적 인 세포 - 세포 상호 작용을 시각화 할 수있는 장점이있다침략 동안 모세포종 세포와 미세 아교 세포. 사실, 미세 아교 세포는 밀접하게 3D 매트릭스 (그림 5)에 현탁 신경 교종 세포와 연결하는 것 같다. 만 포인트 분석이 필요하고, 공 초점 레이저를 사용할 수없는 경우, 매트릭스 코팅 챔버에서 기술 한 바와 같이, 셀 챔버를 세정 할 수있다. 다음 나머지 (침입) 셀의 개수가 기준 epifluorescent 현미경로부터 획득하여 이미지를 카운트함으로써 결정될 수있다. 영화 1은 이러한 분석의 삼차원 조립체를 도시한다.

그림 1 :. 미세 아교 세포 / 대 식세포 자극 아교 모세포종 세포를 시금에 대한 두 개의 다른 프로토콜의 도식은 침략 톱 패널은 사전 코팅 매트릭스 챔버 침공 분석 (제 2 장)를 보여줍니다. 하단 패널은 3D 매트릭스 침공 분석 (제 3 장)를 보여줍니다. 그림에서 적응9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 미세 아교 세포 (MG) GL261 아교 모세포종 세포 침공을 향상시킬 수 있습니다. (A) 부재시 GL261 셀 (mCherry 표현) 침입 대표 화상 (왼쪽 패널 단독 GL261) 또는 미세 아교 세포의 존재 (오른쪽 패널; GL261 + MG)는 48 배양 후, 결합 된 매트릭스 코팅 챔버에 도말 시간 필터 교차 한 세포의 수를 평가 한 다음. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 촬영. 스케일 바 = 400 μM. (B) 분석은 침략 GL261 세포 (적색) 계산의 정량. 표시된 데이터는 3 개의 독립적 인 실험에서 평균 ± SEM이다. presenc에서 미세 아교 세포 자극 GL261의 침공 (C) 정량약리 억제제의 피티 니브 (5 μM), JNJ-28312141 (10 μM), PLX3397 (1 μM), PLX5562 (1 μM)의 전자. 표시된 데이터는 여섯 독립적 인 실험에서 ± SEM 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. THP1 대 식세포는 U87 아교 모세포종 세포 침공을 향상시킬 수 있습니다. 또는 차별화 된 THP1의 대 식세포와 (오른쪽 패널, U87 + THP1), 후 24 시간 및 평가를 위해 배양 한 다음, (A)는 CMFDA 녹색으로 염색 U87 세포를 침입의 대표 이미지는 혼자 매트릭스 코팅 챔버에 (U87 왼쪽 패널)을 도금 필터를 교차 한 세포의 수. 이미지 10 배 목표를 사용하여 촬영. 스케일 바 = 400 μM. (B) 분석은 계산의 정량침습성 U87 세포 (녹색). 표시된 데이터 10 독립적 인 실험에서 ± SEM 평균입니다.

. 또는 쥐의 미세 아교 세포로 (; 표시 GL261와 소교 공동 배양의 그림 4. 3D 침략 분석 (A) 이미지 혼자 매트릭스에 포함 된 GL261 세포의 이미지 (CMFDA 녹색으로 염색)의 Z 시리즈에서 전망이다 (GL261 패널 왼쪽) CMPTX 빨간색으로 표시, 오른쪽 패널, GL261 + MG). Z 축 돌기 필터 챔버의 바닥을 포함한다 화상 스택의 바닥 4 조각으로 하였다, 따라서 세포 침입을 나타낸다. 스케일 바 = 200 μM. GL261 세포 (녹색)의 (B) 정량 전술 한 바와 같이, 필터의 하측에 것으로 판정. 침입 GL261 셀의 총 개수는 결정되고, 단종에 GL261 세포의 정상화 하였다. 표시된 데이터는 평균 ± S를 나타냅니다중복 (10에서 적응도)에서 수행 3 독립적 인 실험의 EM은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

GL261 (녹색)와 매트릭스. GL261와 미세 아교 세포의 상호 작용에 포함 된 미세 아교 세포 (적색) 공동 배양의 3D 스택 내에서 조각에서 그림 5. 이미지 흰색 화살표로 강조 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μM.

영화 1 :. GL261 (녹색) 및 미세 아교 세포 (적색) 공 배양에서 촬영 한 이미지의 전체 Z 시리즈의 3D 프로젝션의 X 축을 중심으로 3D 회전에 아교 모세포종 및 미세 아교 세포의 상호 작용은 엄마에 포함트릭스. 조각은 5 μM 단위에 있습니다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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