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방법 논문

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

13.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53990

⸱

2016년 10월 20일

 ,  ,  , 
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

이 논문에서

요약

암의 악성 행동을 이해하려면 종양 세포가 대식세포와 같은 종양 미세환경의 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정확한 모델을 만들어야 합니다. 여기에서는 교모세포종 세포와 종양 관련 대식세포 및 교모세포종 침입에 대한 영향을 평가하는 미세아교세포와의 상호 작용을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.

초록

아교 모세포종의 홍반 (등급 IV 신경 교종)은 1 년 후 진단의 평균 생존에 매우 적극적인 인간의 암이다. 아교 모세포종을 야기 분자 사건의 증가 이해에도 불구하고,이 암은 여전히 ​​기존의 치료에 매우 내화 남아있다. 고급 뇌 종양의 수술 적 절제로 인해 아교 모세포종 세포의 높은 침윤성 특성으로 거의 완료되었습니다. 아교 모세포종 세포 침공을 약화 치료 방법 따라서 매력적인 선택이 될 것입니다. 우리의 실험실과 다른 사람은 종양 관련된 대 식세포와 미세 아교 세포 (상주 뇌 식세포) 강하게 아교 모세포종의 침략을 자극을 보여 주었다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 체외 배양 분석을 사용하여 아교 모세포종 - 대 식세포 / 미세 아교 세포의 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 접근 방식은 크게이 악성 behav 가능 식세포와의 통신을 방해 약물의 개발 및 / 또는 검색을 용이하게 할 수있다IOR. 10 배 - 우리는 미세 아교 세포 / 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극하는 두 가지 강력한 공 배양 침공 분석을 설립했다. 형광 마커 또는 구조적 형광 단백질을 발현 표지 아교 모세포종 세포 기질 코팅 폴리 실에 삽입하지 않고 식세포 / 미세 아교 도금 또는 입체 매트릭스에 포함된다. 세포 침윤은 필터의 하부에만 침입 세포 이미지를 형광 현미경을 사용하여 카운트에 의해 평가된다. 이러한 분석을 사용하여 여러 가지 약리 억제제 (JNJ-28312141는 PLX3397, 피티 니브 및 Semapimod) 대 식세포를 차단, 확인 된이 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종의 침략을 자극.

서론

아교 모세포종의 홍반 진단 1, 2의 시간에서 약 12 개월 평균 생존과 적극적인 인간의 뇌 암이다. 교 모세포종은 표준 화학 요법과 수술 적 절제에 난치성 인으로 가장 치명적인 임상 도전 암 중 하나입니다. 아교 모세포종의 확산 특성은 수술로 완전히 절제에 고급 종양이 사실상 불가능하게 정상 뇌 전체에 확산 종양 세포 수 있습니다. 이 매우 침습적 인 측면은 교 모세포종 및 기타 고급 성상 세포종의 특징 특징이다. 따라서, 많은 연구의 초점은 아교 모세포종 세포 침윤의 분자 메커니즘왔다. 아교 모세포종 종양 미세 환경은 악성 종양 3-6 확립에 중요한 역할을한다. 종양 관련된 대 식세포는 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종 침공 7,8 홍보에 대한 책임 것으로 나타났다. 이러한 연구의 대부분은 사용하지만 식세포 / 미세 아교 세포의 효과를 측정물리적으로 아교 모세포종 세포에서 구분 분석. 우리의 실험은 우리가 아교 모세포종 침공이 공 배양에서 대 식세포 / 미세 아교 세포에 의존하는 방법을 연구하고 침략하는 동안 이미지에 그들 사이의 물리적 상호 작용을 우리를 활성화 할 수 있도록 개선 된 분석을 생성하기 위해 밖으로 설정하고있다.

클래식 분석은 세포 침공은 "표준"보이든 챔버 화성과 chemoinvasion 형식을 포함 측정합니다. 공부하는 여기에 세포를 지정된 크기 (직경 일반적으로 사이 0.4 및 8 μM)의 구멍이 하단에 폴리 카보네이트 필터가 포함 된 플라스틱 챔버에서 도금. 세포 침윤의 방법은 일반적으로 세포 외 매트릭스 단백질로 이루어진 물리적 배리어를 포함한다. chemoinvasion 분석에서 사용 된 바람직한 행렬은 마트 리겔 (이하, "매트릭스"라 함), Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS)에 의해 분비 된 세포 외 매트릭스 단백질의 혼합물을 마우스 육종 세포이며 크게 COL 이루어져lagen 유형 IV 및 라미닌. 챔버 후 또는 침윤을 촉진하는 것으로 의심되는 성장 인자없이 세포 배양액을 포함하는 조직 배양 웰에 배치된다. 더 높은 주파수에서 세포 외 기질 코팅 된 필터를 통해 침투하고, 필터의 하측에 부착하는 높은 침윤성 용량 셀. 우리는 아교 모세포종 세포 침윤에 미세 아교 세포 및 종양 연관된 대 식세포의 역할을 평가하기 위해이 시험을 수정했다.

10 배 9,10 - 우리는 미세 아교 세포는 5 개의 아교 모세포종 세포 라인의 침공을 자극 할 수있는이 문서에서 설명 공 배양 분석을 사용하여 확인 할 수 있었다. 이 아교 모세포종의 동물 모델에서 관찰되는 것을 반영한다. 더욱이, 우리는 아교 모세포종 세포와 대 식세포 간의 상호 작용 / 미세 아교 세포가보다 직접적으로 검토 할 수있는 입체 침윤 분석을 개발 하였다. macropha에 의해 자극 아교 모세포종 세포 침윤의 정도3 차원 분석에서 GES / 미세 아교 매트릭스 코팅 챔버 방식을 사용하여 본 것과 대등하다. 비슷한 분석은 이전에 침공 11 ~ 13시 대 식세포와 유방암의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 문서에 설명 된 두 가지 방법은 아교 모세포종 세포의 식세포 / 미세 아교 세포 자극 침공의 분자 메커니즘 (들)을 해부 할 수있는 능력에 도움이됩니다.

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프로토콜

세포의 1. 형광 표식

참고 : 형광 염료 9 레이블 아교 모세포종 세포주 및 미세 아교 세포. 대안 적으로, 14에서 설명한 바와 같이 이러한 구조적 GFP / RFP 형광 단백질을 발현 세포주를 생성한다.

  1. 염색의 날에 80 % 합류 - 6 웰 플레이트에 플레이트 세포는 70이 될 것이다하도록. 뮤린 아교 모세포종 세포주 GL261 인간 아교 모세포종 세포주 U87, 플레이트 1 × 106 1.5 × 106 세포에 각각 염색 전에 6cm 접시에 24 시간.
  2. , DMSO에 형광 세포 염색 염료 솔루션을 준비하고 미디어에 5 μm의 염료를 추가하거나 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 또는 대 식세포 무 혈청 배지 (MSFM), 잘 소용돌이.
  3. 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 염료로 세포를 인큐베이션.
  4. 염료 포함 된 용지를 제거하고 세포에 신선한 미디어 (RPMI 또는 MSFM)를 추가합니다.
  5. 30 분 동안 세포를 품어. 참고 : 세포는 지금염색 준비가 실험에 사용된다.

2. 사전 코팅 매트릭스 상공 회의소 공동 배양 침략 분석

  1. 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) (15)를 사용하여 THP-1 세포 분화.
    1. 접시 2 - 6 웰 배양 접시에 RPMI / 10 % FBS, 1.5 ml의 3 × 105 THP-1 세포. 즉시 도금 후 100 나노 PMA를 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 부화.
      참고 : 48 시간 후, 성공적으로 차별화를받은 THP-1 세포가 부착되며 잘 둥근 형태에 복용의 바닥에 퍼졌다.
    2. 1X PBS로 한번 세척하여 PMA를 제거하고 신선한 RPMI / 10 % FBS로 교체합니다. 세포 분석에 사용할 준비가 될 때까지 또 다른 48 시간을 기다립니다.
  2. 잘 형 미디어 500 μl를 포함하는 (아무 혈청)에 배치하고 상단 형 미디어의 500 μl를 추가하여 매트릭스 사전 코팅 챔버 평형. 37 ° C에서 2 시간 5 % CO 2 챔버를 품어.
    참고 : 사전 코팅 챔버 제조 업체에서 구입 한; 재료 / 장비의 표를 참조하십시오.
  3. 부드럽게 세포 (형광 표지 된 아교 모세포종 세포 라인과 미세 아교 세포 / 대 식세포)를 분리하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 세포 배양기에서 10 분 5 % CO 2.
  4. 0.3 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포.
  5. 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
  6. MSFM / 0.3 % BSA 배지에서 기음 뜨는 재현 탁 펠렛 또는 (U87 및 THP-1 세포) RPMI / 0.3 % BSA (GL261 세포 및 미세 아교 세포의 경우) 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml로 동일 같은 것을 . 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다.
  7. 24 웰 플레이트의 웰 당 500 ㎕의 미디어 / 0.3 % BSA를 추가합니다.
  8. 적어도 2 시간 (단계 2.2)에 대한 평형 된 챔버에서 용지를 제거합니다. 장소 chambe잘 500 μL 미디어 / 0.3 % BSA (단계 2.7)를 포함에서 RS.
  9. 억제제는 마크로파지에 미치는 효과를 연구하기 위해 사용되는 경우 / 미세 아교 세포는 하부 챔버의 상부 부분 모두에 적절한 농도를 추가 교종 침윤 자극.
    주 : CSF-1R의 농도 GL261 아교 모세포종의 침윤이 기준 9에서 발견 될 수 자극 완전히 미세 아교 세포를 억제하는 데 억제제.
  10. 마우스 아교 모세포종 (2.10.1) 인간 아교 모세포종 (2.10.2)에 사용되는 세포주에 따라 다음의 두 단계로 설명 된 바와 같이 상부 챔버에 셀을 추가한다.
    1. 1.5 × 10 5 GL261 (아교 모세포종) 세포 (150 μL), 5 × 10 4 마우스 미세 아교 세포 (50 μl를) (미디어 자세한 내용은 단계 2.6 참조) 섞는다. 300 μL MSFM / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가하고 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 부화.
      참고 : 나는 설명 된대로 쥐 미세 아교 세포는 신생아 쥐에서 분리되어n은 1 6.

7.5 × 10 4 U87 (아교 모세포종) 세포 (75 μL) 2.5 × 10 4 THP1 (대 식세포) 세포 (25 μL)을 섞는다. 400 μl의 RPMI / 0.3 % BSA를 추가하여 500 μL에 볼륨을 가져와. 상단 챔버에 세포 혼합물을 추가합니다. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 품어.

  1. 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. 이미지 분석을위한 섹션 4로 넘어갑니다.
    참고 : 실험이 순간에 일시 정지와 1X PBS에서 영상 저장할 수 있습니다. 형광 염료의 신호가 고정 후까지 2 주간 검출 할 수있다.

매트릭스에서 신경 교종 및 대 식세포 / 미세 아교 세포를 -embedding 3. 침략 분석 "3D"

  1. 밤새 4 ° C에서 해동 매트릭스 믹스. 후드에서 얼음에 매트릭스를 사용하여 모든 추가 조작을 수행합니다.
  2. 얼음에 0.3 % BSA와 미디어 매트릭스의 10 ㎎ / ㎖ 농도 (MSFM 또는 RPMI)를 준비합니다.
    참고 : 행렬의 재고 농도는 일반적으로 약 15 ㎎ / ㎖이다.
  3. 매트릭스 서스펜션 (1 단계에서 표시) 세포를 준비하려면, 흡인 세포에서 용지를 제거합니다. 2 mM의 EDTA / PBS와 함께 접시에 세포를 씻으십시오. 셀에 2 mM의 EDTA / PBS 500 μl를 추가하고 5 품어 - 37 ° C에서 인큐베이터에서 10 분 5 % CO 2.
  4. 0.3 % BSA를 함유 배지 5ml에 재현 탁 된 세포.
  5. 120 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
  6. 펠렛에서 대기음 뜨는. 세포의 농도가 1 × 106 세포 / ml로 동일하도록 미디어 / 0.3 % BSA에 재현 탁 펠릿. 세포를 계산하는 혈구를 사용합니다.
  7. 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 + 5 × 10 4 미세 아교 세포 (50 μL에서) (150 μL)에 1.5 × 10 5 GL261 세포를 추가합니다.별도의 1.5 ML의의 microfuge 튜브에 2 × 10 5 GL261 세포 (200 μL)를 추가합니다.
    참고 형 미세 아교없이 GL261 세포는 대조군으로 작용한다.
  8. 120 X g에서 5 분의 microfuge에 스핀 세포.
  9. 얼음에 200 μl의 차가운 매트릭스를 Resuspend 세포.
  10. 8 μM 공경 챔버 인서트의 상부 구획의 중앙 판 (50) 상 μL (50,000 세포).
  11. 중합이 발생하여 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
  12. 하부 웰에 상부 챔버 700 ㎕의 혈청을 포함하는 세포 증식 배지에 200 μL의 혈청 배지를 추가한다.
  13. 48 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 품어.
  14. 배양 후, 부드러운 흡인 챔버의 상단에서 세포를 제거하고 PBS에서 3.7 %의 포름 알데히드에 배치하여 실을 수정합니다. 챔버는 실온에서 15 분 (또는 밤새 4 ° C)에 대한 정착에 남아있을 수 있습니다. 부드러운 흡인 정착액을 제거하고 PBS 1 배 500 μL로 교체합니다. (4) FO로 진행R 영상 분석.

4. 영상 분석 실험

  1. 3.7 %의 포름 알데히드에서 챔버를 제거하고 PBS 1 배 신선한 500 μl를 포함하는 잘 씻는다.
    참고 : 챔버 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
  2. 목화 팁 어플리케이터를 사용하여 부드럽게 필터 표면을 긁어 필터의 상단부 (측 챔버의 내부를 향하는)에서 비파괴 세포를 세척. 부드럽게 시작하고 점차적으로 압력을 증가. 챔버 당이 적어도 3 회를 수행합니다.
  3. 중 유리 바닥 접시에 실을 놓거나 24 웰 플레이트에 둡니다.
  4. 카메라와 이미지 캡처 소프트웨어 (9, 10)가 장착 된 epifluorescent 또는 레이저 공 초점 형광 현미경의 무대에서 샘플을 놓습니다.
  5. 대표적인 필드의 몇 배 또는 20 배의 이미지를 가져 가라.
  6. 이러한 ImageJ에 같은 영상 분석 소프트웨어를 사용하여, 하부 9,10-에 필터를 넘었다 아교 모세포종 세포의 수를 계산.
  7. 은 "3D 이미징 경우. 4.6 전술 - "침략 분석 (3 절에 기재된), 형광 레이저 공 초점 현미경 5-6를 사용하여 Z 스택 시리즈를 생성하는 이미지에 필터의 하부에 침입 세포 집단을, 프로토콜을 따라 4.2 단계를 반복합니다.

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결과

여기에 설명 된 방법을 사용하여, 우리는 미세 아교 세포와 대 식세포가 실질적으로 아교 모세포종 세포 침공을 자극 할 수 있음을 보여 주었다. 두 개의 다른 침윤 분석이 이용되고도 1에 도시된다.도 2에서, 구조적 형광 단백질을 발현 mCherry GL261 세포와 48 시간 동안 미세 아교없이 프리 코팅 챔버에서 배양 하였다. 미세 아교 세포로 침입 용량이 약 10 배 증가하지만 때 배양 GL261 세포는 자신에 대한 최소 침습했다.

우리는 인간 세포주를 사용하여 유사한 효과를 관찰한다. 차별화 된 THP-1 세포와 공 배양 할 때 그림 3에서 (5 chloromethylfluorescein 디 아세테이트 (CMFDA) 녹색으로 염색) U87 세포는 5 ~ 6 배 높은...

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토론

높은 등급의 성상 세포종과 교 모세포종의 매우 침습적 인 특성은 이러한 뇌 암은 매우 치명적인합니다. 그것은 아교 모세포종 침공의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것이 가장 중요하다. 많은 아교 모세포종 침공 이미 17의 과정에 대해 알게되었습니다. 10 배 -이 문서에 설명 된 분석 형식을 사용하여, 우리 연구실은 종양 관련된 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극 할 수있는 모두 마우스와 인간의 모델에 보여 주었다. 이 공 배양 모델에 충실 잠재적 간의 쌍방향 통신에 참여 (예 : 노치 델타 Ephrin-Ephs로서 리간드 - 수용체 시스템을 통해) 분비 및 juxtacrine 상호 작용 허용 물리적 식세포 / 미세 아교 세포와 상호 작용하는 아교 모세포종 세포의 기능을 복제 종양 세포와 대 식세포. 신경 교종 세포 침윤에 대한 대 식세포의 효과를 발견하고자 다른 분석 포맷은 일반적으로 셀을대 식세포는 웰의 바닥면에 도금 및 아교 모세포종 세포 챔버 3,4에있는 바와 같이 물리...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구를 위해 쥐 미세아교세포를 제공해 주신 Konstantin Dobrenis 박사님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: BD Matrigel Matrix 포함Corning/Fisher ScientificCat: 354481
대식세포 무혈청 배지(MSFM) (500 ml)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Molecular ProbesC34552
CellTracker Green CMFDA DyeLife Technologies/Molecular ProbesC2925
GL261 세포주National Cancer Institute (NCI)
U87 세포주American Tissue Type Culture CollectionHTB-14
THP-1 세포주American Tissue Type Culture CollectionATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)Life Technologies/Gibco11875-093
포름알데히드 용액Sigma AldrichF1635
Corning Transwell 폴리카보네이트 막 세포 배양 삽입물(8 µ M 기공) 팩당 48개.CorningCLS3422
Cultrex 3-D 배양 매트릭스 감소 성장 인자 기저막 추출물, PathClearTrevigen3445-005-01
태아 송아지 혈청(FBS)Life TechnologiesCat: 10500064
소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 처리FisherscientificBP1600-100
0.5M EDTAThermoFisher Scientific15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)시그마 AldrichP8139-1MG

참고문헌

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