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방법 논문

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

8.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

2016년 11월 27일

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

이 논문에서

요약

카스파 제 활성의 낮은 농도를 포함하는 전체 동물의 건강한 세포를 검출하기 위해, CaspaseTracker 지정된 고감도 바이오 센서 초파리에 대해 생성 하였다. 카스파 따라 바이오 활성 데스 자극의 부재 하에서 최적 조건 하에서 사육 성인 동물의 내부 장기에 걸쳐 긴 수명이 건강한 세포에서 검출된다.

초록

Caspases는 단백질 분해 활성을 통해 apoptotic cell death의 핵심 매개체입니다. 세포에서 카스파제(caspases)가 사용 가능한 기술로 검출할 수 있는 수준까지 활성화되면, 일반적으로 세포사멸(apoptosis)은 그 직후에 발생하는 것으로 가정합니다. 카스파제는 많은 기능적, 구조적 구성 요소를 절단하여 몇 분 내에 빠르고 완전한 세포 파괴를 일으킬 수 있습니다. 그러나 축적된 증거는 정상적인 건강한 세포에서 동일한 카스파제(caspase)가 다른 기능을 가지고 있으며, 아마도 더 낮은 효소 수치를 가지고 있음을 나타냅니다. 비세포사멸 카스파아제 활성에 대한 연구는 낮은 수준의 카스파제 활성을 감지하는 데 어려움이 있고 생체 내에서 궁극적인 세포 운명을 추적하는 데 어려움이 있어 방해를 받았습니다. 여기에서는 전체 동물에서 카스파제 활성을 경험한 세포를 영구적으로 라벨링하는 초고감도 카스파제 리포터인 CaspaseTracker의 사용을 보여줍니다. Drosophila melanogaster용 생체 내 이중 색상 CaspaseTracker 바이오센서는 적색 형광 단백질(RFP)을 일시적으로 발현하여 최근 또는 진행 중인 카스파제 활성을 나타내고, 과거에 카스파아제 활성을 경험했지만 사멸하지 않은 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 영구적으로 발현합니다. 중요한 것은 이 카스파제에 의존하는 생체 내 바이오센서가 성충 파리 전체의 장기 조직 조직에서 비세포사멸 카스파아제 활성의 존재를 쉽게 드러낸다는 것입니다. 이는 뇌, 장, 말피기세뇨관, 심장, 난소 관 및 기타 조직 전체의 건강한 세포에서 바이오센서 활동을 감지하기 위해 개별 파리의 전체 마운트 해부를 사용하여 입증되었습니다. CaspaseTracker는 카스파제 활성화 후 최소 10일 후에 성인 뉴런 및 기타 조직에서 바이오센서 활성이 감지되기 때문에 수명이 긴 세포에서 비세포사멸 카스파제 활성을 감지합니다. 이 바이오센서는 살아있는 동물에서 비세포사멸 카스파아제 활성의 역할과 분자 메커니즘을 밝히는 중요한 도구 역할을 합니다.

서론

카스파는 키 아스 파르 테이트 잔류 후 많은 세포 내 단백질을 절단하여 사멸 세포 사멸을 매개 시스테인 프로테아제이다. 예를 들어, 개시제 카스파는 효과기 카스파, derepress DNA의 뉴 클레아 제, 쪼개짐 세포 골격 성분을 활성화하고 신속하게 세포를 분해하고, 셀 시체 처리 인접 셀하여 인식 말림을 자극하는 세포막의 지질 조성 변화. 1-4 이것은 추정 세포의 수십억 인간의 몸에서 하루에 사망하고, 세포 사멸 화학 요법에 의한 종양 세포 사멸의 중요한 메커니즘이다. 5 카스파의 다른 세트는 선천성 면역을 자극하는 독특한 비 세포 사멸 과정에 의해 세포 사멸의 원인이 될 수 있습니다. (6) 따라서, 카스파 대부분의 연구는 직업 죽음의 기능에 초점을 맞추고있다.

흥미롭게도, 현장에서 초기 증거 홍보 세포 죽음에 책임이있는 같은 카스파도 아닌 죽음의 F를 밝혀unctions. 선구적인 연구는 카스파는 배아 동안 세포 증식 및 이동의 규제를 포함하여 건강한 세포에서 다양한 세포 기능에 관여하고 있음을 증명하고있다. 7-9 카스파가 다른 necroptotic 세포 사멸 경로를 차단, 초파리 10, 11에 spermatid 개별화 필요 마우스 (12, 13), 그리고 마이크로 RNA 프로세싱에 C. 간스. 14, 15 아마도에서 가장 오래 살았다 세포, 신경 세포, 카스파 및 기타 세포 사멸 기계가 시냅스 엔딩을 치기에 의해 신경 세포 활동의 조절에 관여하는, 생각하는 과정은 학습과 기억에 대한 다른 시냅스를 강화하는 것이 중요합니다. 16 18 카스파가 전체 세포 죽음없이 작은 신경 돌기의 미니 고사의 유형에 의해 시냅스 가지 치기를 촉진하는 것이 가능하다. (19) 그러나, 카스파는 세포 사멸과 같은 이벤트에 관련이없는 다른 기능을 가질 수있다. (20, 21) 이중 역할삶과 죽음에들 카스파에 고유하지 않습니다; 증명되지 않았지만 BCL-2 패밀리 단백질, 시토크롬 C는 건강한 세포의 세포 에너지 분야에서 역할을 가질뿐만 아니라, 세포 스트레스의 많은 유형에 의해 활성화되는 코어 사멸 경로의 일부이다. 22-25, 그것은 진화 일 연결된 것으로 논리적 보인다 부적합 또는 바람직하지 않은 세포의 적시 제거를 위해 동일한 분자 내 죽음 작업에 -jobs.

현재, 비 - 아폽토시스 카스파 제 활성의 분자 메커니즘 이해되지 않으며, 배아 발달 동안 성인 조직에서 비 - 아폽토시스 카스파 제 활성의 정도는 알려져 있지 않다. 주요 과제는 카스파의 죽음 작업에서 매일 작업을 구별에 어려움이다. 카스파 제 활성은 단백질 분해 케스케이드 의해 증폭되고 세포 자멸사 및 pyroptosis, 대조적으로, 카스파의 하루 작업은 많은 가능한 TECHN하여 검출 가능성이 아래 효소 활성의 훨씬 낮은 레벨을 발생 예상ologies.

여기에 제시된 작업 이전에, 나머지는 다른 목적을 위해 카스파 다양한 바이오 센서를 개발했다. SCAT 바이오 센서 (예를 들어, ECFP - DEVD - 금성) 빠르게 FRET를 사용하여 배양 세포 및 동물 조직에서 실시간 카스파 활동을 감지합니다. (26, 27)를 카스파 제 절단시, Apoliner (mCD8-RFP-DQVD-의 핵 타겟 GFP 부분 nucGFP)는 자사의 플라즈마 막 밧줄이 카스파에 의해 절단되는 분 이내에 세포 내 relocalization을 겪는다. (28) 마찬가지로, ApoAlert - pCaspase3 - 센서 (NES-DEVD-YFP-NLS)는 카스파 제 절단시 핵 세포질에서 relocalizes. 29, 30을 더 최근 iCasper의 발색단은 세라 초파리 배아 뉴런 실시간 바이오 활성의 검출을 허용, 카스파 제에 의해 분해되지만, 주로 발달 세포 죽음과 연관 될 때 형광을 위해 설계되었다. 후각 뉴런 31 카스파 따라 사망했다 노화 동안에 demonstCPV 바이오 센서 (예를 들어, mCD8-PARP-비너스)의 카스파 제 절단 형태의 면역 검출에 의해 평가. (32, 33) 중요한 것은, 카스파 제 -3의 활성화 된 형태의 척추에 민감한 발현 사이 세포 죽음의 부재에서 발견 된 배양 뉴런 및 소마 핵 CellEvent 리포터 염료의 카스파 종속 형광을 사용하지만, 세포 사멸은 척추 제거 이후까지 지연되었지만 어려움으로 인해 광 독성 발생 하였다 인치 (19)은 따라서 새로운 카스파 바이오 센서가 감지 할 필요 및 생체 내에서 기저 카스파 제 활성을 갖는 세포를 추적.

이러한 어려움을 극복하기 위해, 우리는 CaspaseTracker 지정된 신규 이중 색상 카스파 바이오 센서를 생성. 이 전략은 영구적 라벨 및 생체 내에서 세포를 추적 초파리 G-TRACE FRT 재조합 효소 시스템 (34)과 초파리 카스파 Apoliner 민감한 바이오 센서 (28)의 수정 된 버전을 결합한다. 35 GAL4 활성화 된 G-TRACE 시스템. 카스파의 매우 낮은 수준의 적 카스파 활동을 경험 한 모든 세포의 세포질과 영구적 인 핵 타겟 GFP 발현에 RFP 발현의 결과로, CaspaseTracker 활성화 할 수 있습니다 (35)이 시스템은 레이블을 지정할 수 있습니다 초파리 melanogaster의, 카스파 제 및 세포 사멸 연구에 대한 취급 용이하고 널리 사용되는 모델 시스템을 사용하여 전체 동물의 일생 동안 세포. 36-38

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프로토콜

CaspaseTracker의 파리 1. 준비

  1. 이 크로스를 수행 CaspaseTracker (DQVD)를 제조 실험을 위해 파리하려면 7-10 처녀 여성을 전송 (또는 남자), UBI-CaspaseTracker는 G-TRACE (유비가> 중지> GFP-NLS; UAS-FLP UAS-RFP를) × 카스파 바이오 센서 기판 mCD8-DIAP1-GAL4를 운반하는 남성 (또는 여성)의 동일한 번호로 유비퀴틴 프로모터 (35) 함께하여 G-의 동형 접합 조합의 치사율을 피하기 위해 두 번째 염색체 CYO 분산이 G-TRACE 파리를 중심 날아 TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, 그리고 유비는> 중지> GFP-NLS) 34. 장소는 단백질 소스로 신선한 효모 페이스트와 신선한 식품 유리 병에 날아간 다.
  2. 5 ~ 7 일 (최대 이주)을 위해 18 ° C에서 파일을 품어 후 부모가 새로운 자손과 과밀 방지하기 위해, 새로운 사육 병을 설정 유리 병에서 파리 제거합니다.
  3. 자손이 eclose 파리까지 18 ° C에서 배양을 계속합니다. 비 CYO을 선택 [비 다CaspaseTracker 및 G-TRACE 요소 (35)에 대한 형질 전환됩니다 CaspaseTracker의 정확한 유전자형의 urly 날개] 자손.
  4. 동시에, 특정 CaspaseTracker의 RFP 및 GFP의 형광을 확인하기 위해 컨트롤 부모의 비 형질 전환 w118 파리와 카스파를 구분 (DQVA)를 병렬로 날아 생성합니다.
  5. 프라이머를 사용하여 CaspaseTracker와 파일을 확인하기 위해 PCR의 유전자형을 수행합니다 : 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA을하는 3897 bp의 제품을 생산. G-추적 궤적을 유전형를 들어, GFP (474 ​​BP)에 대해 다음 프라이머를 사용, 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC의 GTC의 CAT GCC GAG AGT GAT C; RFP (258 BP)에 대한, 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; 및 Flpase (655 BP), 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG에 대한 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C를 pUWR 벡터의 유전자형 GAL4 (554 BP), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC의 GCT의 경우 CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT의 AGA.

2. 조직 준비, 염색 및 장착

  1. 플라이 해부를 들어, 물에 용해 1 % 소 혈청 알부민 플라스틱 피펫 팁과 원심 분리기 튜브, 코트 팁 및 튜브 (BSA)에 달라 붙는 해부 조직을 방지 할 수 있습니다.
  2. 해부는 집게를 사용하여 실리콘 쿠션에 날아갑니다.
    1. 조직의 절개를 수행 할 때 딱딱한 표면에 집게의 끝 손상을 방지하기 위해, 실리콘 표면에 절개를 수행합니다. 실리콘 해부 판을 들어, 제조업체 지침 (자료 목록)에 따라 상업 키트에 실리콘을 용융. 실리콘을 용융 한 후, 60mm 직경의 조직 배양 접시에 3 ~ 4 mL를 넣어. 실리콘 요리를 재사용 할 수 있습니다.
    2. CO 2 플라이를 마취하고, 차가운 PBS 1 ml로 실리콘 플레이트에 옮긴다. 블로우 건을 이용하여 플라이를 함유하는 바이알에 이산화탄소를 도입하고 마취 플라이 t 전송할공동 2 공급 장치가 OA 패드.
    3. 머리와 foregut 사이의 연결을 손상시키지 않고 덮고 몸에서 플라이 헤드를 분리 반대 방향으로 가슴을 끌어 플라이 머리를 잡아 포셉 한 쌍의와 집게의 두 번째 쌍을 사용합니다.
    4. 흉부에서 날개와 다리를 제거하기 위해 집게 2 쌍을 사용합니다.
    5. 흉부를 잡아 포셉 한 쌍을 사용하고 포셉의 다른 쌍은 foregut과 중장 사이의 연결을 손상시키지 않고 다시 가슴에서 분리하기 위해 복부를 당겨.
    6. 이전에 입증 된 바와 같이 뇌, 창자, malpighian 세관 및 난소를 포함한 내부 장기를 해부하다. 39 ~ 41을
    7. 이 조직은 강한 형광도를 생산으로 집게로 표피의 모든 조각과 지방의 몸을 제거합니다. 인내와 연습과 같이 전체 기관의 시스템을 준비해야합니다.
  3. 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 해부 조직을 전송하고, 조직의 위스콘신 해결어둠 속에서 20 회전 30 분 동안 실온에서 PBS 중 4 % 파라 포름 알데히드 0.5 ㎖ (인산염 완충 식염수) 번째 조직에서 표백 RFP 및 GFP를 방지한다. 이후의 염색 결과를 손상시킬 수 장시간 고정을하지 마십시오.
  4. 부드러운 피펫 팅하여 파라 포름 알데히드를 제거하고 실온에서 0.5 mL를 PBST (PBS + 0.1 % 트리톤 X-100)로 3 회 세척한다.
  5. 부드러운 흔들림과 함께 밤새 4 ° C에서 0.5 mL의 PBST로 조직을 Permeabilize 하시려면. 짧은 배양이 완료되지 permeabilization과 타협 염색 결과가 발생할 수 있습니다.
    1. 그것은 배경의 얼룩을 감소시킬 필요가있는 경우, 대신 PBS 중 1 % BSA와 0.5 mL를 PBST로 조직 배양 고려한다.
  6. 0.5 mL의 PBST로 조직을 3 회 반복한다.
  7. , 핵 및 사상 굴지 (F-액틴)를 얼룩 / mL의 훽스트의 33342 블루 핵 염료 및 0.3 μm의 알렉사 플 루어 633 Phalloidin의 F - 굴지 얼룩 10 μg의 0.5 mL의 PBST을 적용하고 실온에서 1 시간 w를위한 조직과 동시에 부화하기어둠 속에서 i 번째 부드러운 회전. 이 배경을 증가하므로 장시간 염색을 피하십시오.
    1. 면역 염색의 경우와 조직을 고정 투과성이 품어 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 mL의 PBS에서 밤새 4 ° C, 1 얼룩에 : 안티 - ELAV 항체 또는 1 100 희석 방지 카스파 제 -3의 200 희석 밤새 4 °의 C (300 μL). (100) 및 실온에서 1 ~ 3 시간 동안 배양 : 1 희석 해당하는 이차 항체에 의해 수행합니다. 특정 항체 정보 자료 목록을 참조하십시오.
  8. 부드러운 회전에 0.5 mL의 PBST에서 5 분 동안 조직 3 회, 각각을 씻으십시오.
  9. 피펫으로, 모든 PBST를 제거하고 완전히 하룻밤 실온에서 1-3 시간 또는 4 ° C에 대한 조직을 충당하기 위해 (자료 참조) 200 μL 방지 표백제 장착 에이전트를 추가 할 수 있습니다. 완전히 부착 제를 흡수 한 최적의 조직이 튜브 바닥에 가라 앉을 것이다.
  10. 사전 깨끗한 물 또는 70 % 에탄올로 유리 슬라이드를하고 GLAS에 에이전트를 설치하여 조직을 전송의 슬라이드.
  11. 조심스럽게 조직 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다. 유리 슬라이드와 overcompression하여 조직을 파괴하지 않도록 커버 슬립에 바셀린을 적용합니다. 휴지와 추가 장착 에이전트를 제거합니다.
  12. 조직에서 에이전트를 실장 누설을 방지하기 위해 모든 커버 슬립의 가장자리 매니큐어를 적용하여 커버 슬립을 밀봉.

3. 공 초점 현미경

  1. 반전 된 공 초점 에피 형광 현미경을 사용합니다. 그러나, 최대 현미경 바로 사용할 수도있다. 타일링을 이용하여 화상 조직에 의한 부품의 열팽창 및 수축에 초점 XY 평면의 시프트의 편차를 방지하는 안정 실온을 유지한다. 환경 제어 시스템과 포커스 드리프트 보정 시스템 인해 현미경 시스템의 열 평형이 손실이 문제를 방지하는 것을 돕는다.
  2. 현미경의 무대에 슬라이드를 놓습니다. 낮은 해상도로 여러 시험 화상을 (125 X 125 픽셀)을이자 (ROI)의 전체 영역을 커버하는 데 필요한 타일의 적절한 수를 결정할 거라고.
  3. 스캔 해상도 등의 500 X 500 픽셀의 이미지를 캡처하는 현미경 검사 시스템을 설정한다. 이미지 (타일)의 각각은 모든면에서 20 % 정도 겹치도록, 같은 20X NA 0.8 커버 글라스를 통해 조직을 분석하기위한 63X NA 1.4 계획 - 고차 색지움 목표로 목표를 선택합니다.
  4. 긴 파장의 빛이 낮은 사진 표백 원인으로, 여기 파장을 최단하기 위해 긴에서 이미지 순서를 설정합니다. 여기 파장을 최단하는 최장의 순서는 (ⅰ) Phalloidin의 F 액틴 및 활성 카스파 항체 633 nm의 RFP 대 (II) 561 nm의 GFP에 대한 (Ⅲ) 488 nm의, 그리고 (ⅳ) 405 nm의 대 훽스트 핵 얼룩.
  5. 촬상 동안 조직의 고품질 화상을 얻을 수있는 레이저 강도를 감소시킴으로써 포토 블리 칭을 방지 프로세스를 영상화하는 동안 형광 레이저 여기에 세포의 노출을 최소화한다.
  6. 전 후마법사 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 병합 수집된다.

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결과

CaspaseTracker 정상적인 건강한 세포 (그림 1a)에서 카스파 제의 활동을 감지 할 수 있도록 두 가지 주요 구성 요소가 있습니다. 이들 중 첫 번째는 카스파 바이오 Apoliner (도 1b) 본뜬 146 아미노산 카스파 절단 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 일반적으로 아폽토시스 동안 절단되는 단일 천연 카스파 부위를 포함 DIAP1 (아폽토시스 초파리 억제제)에서 파생 28 카스파에 의해 DrICE. 42, 43 DrICE은 카스파 제 -3 포유 동물 및 절단 가장 알려진 휴대 기판에서와 동일합니다., DIAP1 및 파생 폴리 펩타이드가 특정 아스파르트 산 후 절단되어, Asp20 카스파 인식에 위치한 카스파의 4,32 특성 순서 17 DQVD-20, 그리고 알라 (DQVA)에 의무적 Asp20 잔기의 돌연변이는 폐지...

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토론

여기에서 우리는 건강한 조직에서 광범위한 기초 카스파 활동의 검출을 용이하게 CaspaseTracker의 건설 및 내부 동작을 보여줍니다. 생체 내에서 비 - 아폽토시스 카스파 제 활성을 검출하기위한 중요한 단계는 1) 2) 적절한 컨트롤 카스파 특정 리포터 기능 검증 3) 박리 기술을 실시하는 것은 성인 초파리의 모든 내부 기관계를 관찰하여, 상기 바이오 센서 트랜스와 파리 생성 autofluorescent 유물에서 4) 구별 바이오 센서 활동.

카스파 특정 센서로 사용되는 천연 카스파 분해 가능한 폴리 펩타이드는 바이오 센서에 의한 카스파 제 저해 활성을 방지하기 위해 수정되었습니다. 또한 변형 급속한 GAL4 전사 인자의 열화 및 에피토프 태그의 삽입을 방지하도록 하였다. 우리는 또한 온 몸의 장기 파리의 해부, 면역, 설치 및 비행 조직의 공 초점 현미경을 설명S는 비 - 아폽토시스 카스파 제 활성을 검출한다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는도 초파리 그림에 대한 Polan 산토스와 대런 Obbard 감사합니다. (2A), 마르셀로 제이콥스 - 로레나 JHMRI의 insectary의 사용. 이 작품은 생명 과학 연구 재단의 교제 (HLT)에 의해 지원되었다, 대학 보조금위원회 홍콩 광역 / B-07 / 99 (MCF), 그리고 NIH가 NS096677, NS037402 및 NS083373 (JMH)를 부여합니다. 호 램 당나라는 생명 과학 연구 재단의 Shurl와 케이 쿠 르치 재단 연구원이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강력 > 소모품 및 시약 < / 강력 >
VectashieldVector ProductsH-1000장착 매체
집게Ted Pella#505 (110mm, #5)Dumont 핀셋 생물학 등급, 스테인리스 스틸
행잉 드롭 슬라이드Fisher Scientific12-565B유리 슬라이드
Hoechst 33342분자 프로브H1399DNA 염색
Alexa Fluor 633 Phalloidin분자 프로브A22284Actin 염색
Rat-Elav-7E8A10 항 elav 항체발달 연구 Hybridoma Bank (DSHB)항체 등록 ID:  AB_528218 Drosophla 범신경 세포 ELAV에 대한 염색
Cleaved caspase-3 (Asp175) 항체세포 신호 기술#9661caspase-3의 활성 단편을 위한 염색
ProLong Gold antifade 시약Life TechnologiesP36934는 형광체를 보존하기 위해 
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961을 사용하여 형광단을 보존하십시오 
SylGard 182 실리콘 엘라스토머 키트Dow Corning 제품 코드:해부 플레이트
Equipment
LSM780 컨포칼 현미경Carl ZeissN/AImaging
Carl Zeiss 실체현미경 Stemi 2000Carl ZeissN/ADrosophila 해부
AmScope 광섬유 듀얼 구스넥 현미경 조명기, 150  WAmScopeWBM99316광원
용 0001023934

참고문헌

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초파리(Drosophila melanogaster)CaspaseTracker 바이오센서형광 리포터공초점 현미경법조직 해부유전적 교배RFP GFP 발현카스파제 절단
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