방법 논문

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

DOI:

10.3791/53994

⸱

2016년 5월 14일

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

이 논문에서

요약

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여기에서는 항암 치료제에 반응하는 단일 세포를 종단으로 추적하는 장기 타임 랩스 현미경 검사 방법을 설명합니다.

초록

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항암제에 대한 단 전지의 반응은 모집단 응답을 결정하는데 크게 기여하고, 따라서 전체 결과에서 중요한 요인이다. 면역은 유동 세포 계측법 고정 세포 실험은 종종 세포가 항암제에 반응하는 방법을 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 중요하지만, 몇 가지 단점이 있습니다. 암과 정상 세포간에, 다른 암 유래의 세포 및 과도 희귀 응답 사이의 약물 반응의 다양성 인구 평균 어 세이를 이용하여 직접 추적 종을 분석 할 수없이 이해하기 어렵다. 현미경은 특히 이미지 살아있는 세포에 적합합니다. 기술의 발전뿐만 아니라 세포 추적뿐만 아니라, 세포 반응의 다양한 관찰을 가능하게하는 해상도에서 일상적으로 이미지 세포에 우리를 가능하게한다. 우리의 연속적인 시간 경과 이미징을 허용 자세히 접근 방식을 설명기본적으로 한 일반적으로 96 시간까지 원하는대로에 대한 약물 반응 동안 세포. 접근 방법의 변형을 사용하여, 세포 주에 대해 모니터링 될 수있다. 유전자 인코딩 된 형광 바이오 센서 수많은 프로세스, 경로 및 응답의 고용으로 이어 할 수 있습니다. 우리는 추적 및 세포 성장 및 세포주기 진행 염색체 역학, DNA 손상의 정량화 및 세포 사멸 등을 실시 예를 나타낸다. 우리는 또한 기술과 유연성의 변화를 토론하고 몇 가지 일반적인 함정을 강조 표시합니다.

서론

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라이브 세포 현미경 단셀 길이 추적 새로운 기술이 아니다. 최초의 현미경에서 매니아와 과학자들은 하나의 세포와 생물, 자신의 행동, 개발 1-3을 관찰하고 연구 하였다. 1950 년대에 밴더빌트 대학에서 후반 데이비드 로저스에서 유명한 예는 황색 포도상 구균 박테리아와 식균 작용 (4) 결국 프로세스를 쫓는 혈액 도말 검사에서 인간의 호중구를 보여줍니다. 이 라이브 셀 영화는 하나의 실험에서 관찰하고 상관 관계를 할 수있는 방법을 여러 프로세스의 우수한 그림이다 : 화학 그라데이션, 역학 및 세포 운동의 속도를 감지, 세포 역학, 접착 및 병원체의 식균 작용을 형성한다.

완전 자동화 현미경 고감도 디지털 카메라들의 출현은 세포 생물학 F까지의 기본적인 질문을 현미경을 사용하여 연구자의 수가 증가 가져왔다세포가 5,6를 이동하고 역학 및 멤브레인 인신 매매 9-11 소기관에 7,8를 분할하는 방법 롬. 비 형광, 1953 년 프리츠 제르 니커의 노벨상을 얻고 위상차 (PC), 미분 간섭 대비를 포함하여 시야 현미경 (DIC) 미세 소관 번들을 포함한 세포와​​ 핵뿐만 아니라 하위 세포 구조의 관찰을 허용 , 염색체, 핵소체, 세....

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프로토콜

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다음 프로토콜은 그림 4와 6에 대한 인수 설정 및 실험 조건에서 실험에 의해 정의 된 매개 변수를 사용합니다. 이러한 파라미터의 많은 다른 실험에 맞게 수정 될 수있다 (즉, 노출 시간, 비닝 형광 채널, 등.). 모든 절차가 제도적 지침 및 규정을 준수해야하고 제도적 바이오 안전성위원회의 승인을 받아야. 현미경 제조 업체 웹 사이트 라이브 세포 이미징을위한 훌륭한 정보가 포함되어 있습니다.

1. 현미경 및 이미징 소프트웨어

  1. 거꾸로 현미경의 다양한 라이브 세포 이미징을 수행합니다. 가장 일반적인 현미경 표면 형광 및 회전 디스크 공 촛점을 위드 있습니다. 여기서, 200w 메탈 할라이드 광원과 자동화되고 동력 위드의 표면 형광 현미경을 사용한다.
  2. 무대 정상을 얻거나 환경 챔버를 현미경. 여기에서, 무대 t을 사용영업 환경 챔버.
  3. 시간 경과 현미경을 실행하는 유틸리티 현미경을 운영하는 상용 소프트웨어를 사용합니다.
  4. 이미지 분석을위한 상용 소프트웨어 또는 ImageJ에 사용합니다. 많은 분석 도구는 상업적으로 입수 가능하고, (8, 18)....

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결과

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장기 시간 경과 현미경과 직접 종 추적은 약물 반응 중 많은 항암 효과를 연구 할 수 있습니다. 도 1의 일반 개요에 따라, 세포의 여러 실시 예는 추적 항암 약물로 치료하는 것이 유효 형광 리포터 발현 도시 한 다른 방법을 이용하여 분석한다.

혼자 위상차 현미경은 매우 유익하고 견고 유사 분열, 유사 분열의 기간과 체포, 비정상적인 세포 분열 및 세포 사멸 21,23,24 대 간기에보고합니다. 세포 분열을 대상으로 약물 종종 불리는 항 - 유사 분열 약물. 개발이 계속 (500)로 처리 (2) 및 동영상 1 및 p53의 상태 만 다른 유사한 유방암 유래 MCF7 세포주의 쌍의 2 표시 예가도

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토론

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시간 경과 현미경 및 종 추적의 장점

이 연구자들은 각 셀 그들의 운명뿐만 아니라 전체 모집단을 추적 할 수 있도록, 상기 현미경은 약물 반응 종의 연구를위한 이상적인 도구이다. 세포 집단 내에서 약물 반응의 다양성은 항암 치료 설계를위한 중요한 문제입니다. 단일 세포의 종 추적 수사관이 변화를 관찰하고 세포 인구에 관한로서 기본 메커니즘과 결과를 이해하기 시작 할 수 있습니다. 형광 프로브의 다양한 활용하여 관찰하고 일반적인 희귀 응답 표현형 모두를 이해하는 방법의 군중을 제공한다. 인구 응답 타이밍과 다른 세포 운명의 기여는, 치료시 세포주 또는 국가 간의 응답의 특정 표현형과 운명, 그리고 차이 사이의 관계를 배울 수있는 예입니다. 많은 암 관련 프로세스를 연구 할 수있다. 이 문서에서 강조되지 않은 일부는 세포 사멸, 자식 작용과 세포 사멸 및 괴사 기자 39-42, 세포 침공 43, 44, 및 세포.......

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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기술 지원을 해주신 Joshua Marcus님과 기술적 조언을 해 주신 Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility의 이사인 Jolien Tyler 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 University of Colorado Boulder와 University of Colorado Boulder Graduate School의 자금으로 지원되었으며, J.D.O. R.T.B.는 NIH의 박사 전 교육 보조금(T32 GM008759)으로 부분적으로 지원됩니다. 셀리넥소(selinexor)를 투여한 Karyopharm Therapeutics, Inc.와 키네신-5 억제제를 투여한 머크 세로노(Merck Serano)에 감사를 표합니다. FUCCI 플라스미드는 MTA를 통해 Atsushi Miyawaki(RIKEN, 일본)에서 제공합니다. mCherry-BP1-2는 Addgene에서 가져왔습니다. H2b-mCherry 및 β-tubulin-EGFP를 발현하는 HeLa는 Daniel Gerlich(IMBA, 오스트리아 과학원, 오스트리아)에서 발췌한 것입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
탁솔 (파클리탁셀)SigmaT7191미세소관 안정화 약물
에토포시드셀렉켐S1225토포이소머라제 II 억제제
셀리넥서 또는카리오팜 치료제(XPO1/CRM1 억제제),
키네신-5 억제제머크 세로노또는선물, American Custom Chemicals Corporation에서도 구할 수 있습니다. CAS 858668-07-2
세포 성장 매체HyClone (Fisher) 또는 Mediatech많은 회사 사용 가능
5 % CO2 / 균형 공기, 인증된 AirgasZ03NI7222004379
35mm 접시, 20mm 유리 바닥CellvisD35-20-1.5-N많은 회사 사용
가능 35mm 4 웰 접시, 20mm 유리 바닥CellvisD35C4-20-1.5-N많은 회사 사용 가능
35mm 접시, 격자 유리 바닥MatTekP35G-2-14-CGRD많은 회사 사용 가능
멀티 웰, 유리 바닥CellvisP12-1.5H-N많은 회사 사용
가능 Olympus IX81 도립 형광 현미경올림푸스 올림푸
스 IX2-UCB 컨트롤러올림푸스
PRIOR LumenPro200Prior ScientificLumen200PRO
PRIOR Proscan III 전동 스테이지Prio ScientificH117
STEV 챔버InVivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
환경 컨트롤러 유닛Invivo ScientificSTEV. ECU. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD 컨트롤러HamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon Nikon
레이저 발사Nikon
SOLA 라이트 엔진루멘 콘
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
TOKAI HIT 클럽 화 챔버TOKAI HITTIZSH

참고문헌

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  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Obser....

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