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방법 논문

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

9K 조회수

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DOI:

10.3791/54018

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2016년 8월 23일

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1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

초록

중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 상피 세포가 중간 엽에 transdifferentiating의 과정을 설명합니다. EMT는 또한 일반적으로, 아교 모세포종에서 가장 흔한 악성 뇌종양을 발생 배아 개발하는 동안 기본 과정이다. EMT는 유방암, 폐암, 대장 암, 위암을 포함하는 뇌 밖에 여러 암에서 관찰되었다. EMT 중앙 이​​동, 침윤 및 전이 형성을 촉진하여 악성 종양에 연결되어 있습니다. EMT 유도의 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기에서 우리는 대뇌 피질의 신경 줄기 세포 (NSCs을) 이후 EMT 유도의 표준화 분리에 대한 체외 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 하나의 세포 이식편의 배양을 사용하는 유연성을 제공한다. 이 시스템에서, 래트 또는 마우스 배아 NSCs의 전뇌는 한정 배지에서 배양하여 혈청 효소의 결여이다. NSCs의는 oligodendroc에서 관찰 Olig2 및 Sox10, 두 개의 전사 인자를 표현YTE 전구 세포 (개 OPC). 이 시스템을 사용하여, FGF-, BMP- 사이의 상호 작용 Zeb1, Zeb2을 포함하는 TGFβ는-신호 및 Twist2는 TGFβ 활성화가 크게 상승 BMP- / TGFβ 상호 작용을 제안, 세포 이동을 강화 여기서 관찰되었다. 결과 EMT 유도 및 유지에 관여하는 것으로 FGF-, BMP- 및 TGFβ-시그널링 네트워크 가리. 이 모델 시스템은 시험 관내에서 EMT를 조사 관련이있다. 그것은 비용 효율적이고 높은 재현성을 보여줍니다. 또한, 그 이전의 응답에 대한 (정량적 거리 측정)을 억제하거나 EMT (정량적 측정)을 향상시키기 위해 화합물의 높은 처리량 스크리닝과 상이한 화합물의 비교를 허용한다. 이 모델은 따라서 잘 EMT에 영향을 미치는 물질 약물 라이브러리를 테스트하는 데 적합합니다.

서론

배아 발달의 여러 단계 동안, 상피 세포가 서로 (예를 들어, 꽉 접합)에 강한 준수를 잃고 중간 엽 전이 (EMT) 1 과정이라고 상피의 철새 표현형을 획득. EMT는 같은 간엽 세포 신경 능선 부가적인 세포 유형의 형성 상기 (2)로부터 neuroepithelium 편석 인구 요구된다. EMT는 배아 단계 동안 만 중요하지만 병변 4 탈수 초성 이러한 상처 치유 (3) 및 중추 신경계 (CNS)와 재생 성인 유기체의 생리 학적 과정을 유지할 성인기 이후 단계에서 요구되지 않는다.

상피 종양은 궁극적으로 암의 진행 1,3로 이어지는, 이동, 침윤 및 전이에 대한 개시 단계로 EMT를 활성화하는 것으로 알려져있다. EMT는 참으로 중앙에서 강력한 마이그레이션 1,3에 연결되어 있습니다. C의 세포 단계onditioning, 시작 겪고 및 EMT를 유지 완전히 이해하고 추가 조사가 필요하지 않습니다.

여기서, 정의 된 성장 인자와 미디어 (NO 혈청 효소없이 사용)와 NSCs을 기반으로하는 표준 시험 관내 EMT 모델 시스템이 제공된다. 이 모델 시스템은 EMT 작업 과학자 관련이있다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질 가족 모두 개발 및 질병 1 EMT에 중요한 것으로 나타났다. 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 가족도 제공 시스템에 참여하고 있습니다. 이 시스템은 일반적으로는 EMT EMT 유도시 초기 사건의 연구에 특정 이점을 제공받지 않는 전뇌의 특정 영역에 기초한다.

같은 달팽이, Hogan 박사와 트위스트 단백질과 같은 키 EMT의 유도가, 또한 CNS 외부 조직 시스템에서 EMT에서 발견되기 때문에 모델 시스템은 잠재적으로, 중추 신경계 외부 상피 세포의 EMT 연구에 적용 할 수 있습니다. 이 모델의템은 특히 줄기 세포의 일반적 특징과 EMT을 연구 개발 피질에서 NSCs을의 표준화 분리 할 수​​ 있습니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 NSCs의 절연 유도 EMT 및 FGF2 및 BMP4의 영향 하에서 후속 이동을 연구 하였다. 우리는 FGF-따라서 모델 시스템의 유효성을 검사, 세포의 이동을 촉진하는 TGFβ가-신호와 상호 작용을 BMP는-신호 관찰.

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프로토콜

모든 동물의 절차는 '실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드'(NIH 간행물, 제 8 판, 2011) 다음과 바젤의 동물 복지위원회 (동물의 관리 및 사용에 대한 스위스 가이드 라인)에 의해 승인되었다. 이 가이드 라인에 의해 동물의 프로토콜은 "가장 낮은 동물 심각도 등급"으로 간주됩니다.

확장 중간 1. 준비

참고 : 조직 문화에 대한 표준으로 무균 상태에서 작업 할 수 있습니다.

  1. 두 15ml의 관을 가지고, 5 L 글루타민이없는 DMEM / F12 ㎖의 추가 (1 : 1) 500 ml의 배지 병에 15ml의 두 튜브를 각각. 처음 15 ML 튜브에 50 mg의 인간 아포 트랜스페린, 퓨 트레 신 1 M 재고 (0.1 mM의 최종 농도) 50 μl의 나트륨 셀레늄 500 μM 재고 (최종 농도 30 nM의) 30 μl를 추가합니다.
    1. 일본어 DMEM / F12 병에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터.
  2. 제 15 ML 튜브에, 12.5 mg의 인슐린을 추가합니다. 더하다6-1 M의 NaOH 9 삭제합니다. 소용돌이는 완전히 인슐린을 용해한다. 일본어 DMEM / F12 병에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터.
    참고 : 수산화 나트륨은 독성과 부식성이다. 보호 장갑, 코트, 안전 고글을 사용합니다.
  3. DMEM / F12 배지 병에 5 ml의 페니실린 (10,000 단위 / ㎖) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg의 / ㎖) / 암포 테리 신 B (25 μg의 / ㎖)를 추가합니다.
  4. 글루타민을 함유하는 5 갓 해동 200 mM의 L- 글루타민 재고 용액 또는 올리고 추가 (200 mM의 L- 알라 닐 -L- 글루타민 디 펩티드)를 DMEM / F12 배지 병에 관한 것이다.
  5. 잘 흔들어. 50 ㎖ 분취 액을 준비합니다.
    주 : 확장 배지는 4 ℃에서 약 2 주 동안 저장 될 수있다. 분주 튜브는 500ml의 병에 보관 매체에 비해 낮은 pH 변화를 보여줍니다.

과 Passaging 중간 2. 준비

  1. Mg를 2 + - 무료 HBSS 미디어, 990.85 mg의 포도당 (5 mM의 최종 농도) 및 840.10 mg의 추가의 NaHCO3 3 - 2 + 1 L 칼슘에 (10 mM의 최종 농도). 염산 (1 M 주)와 7.3 산도를 조정합니다. 필터 0.2 μm의 필터로 살균 및 50 ml의 분취 량을 확인합니다.
    주 : 계대 배지를 4 ℃에서 최소 4 주 동안 저장 될 수있다.

성장 인자 3. 준비

  1. 1 % BSA (PBS-BSA) 단독 또는 4 mM의 (PBS-BSA 염산)의 염산 (HCL)을 멸균 PBS 1X 준비한다.
    주의 : 염산 부식성 및 독성이 특별한 안전 대책 (코트, 고글, 장갑, 후드)가 필요합니다.
  2. 녹여 10 μg의 / ㎖ 재조합 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 PBS-BSA에서 (rhFGF2) (10 NG / ml의 최종 농도), 10 μg의 / ㎖ 재조합 인간 골 형태 형성 단백질 4 PBS-BSA에서 (rhBMP4) (최종 10 NG / ㎖ PBS-BSA 염산 1 (rhTGFβ1을 β 농도), 20 μg의 / ㎖ 재조합 인간 변형시키는 성장 인자) (40 NG / ml의 최종 농도).
    1. 소독을 필터링하지 마십시오. 분취 량을 준비합니다.
      주 : 성장 인자 분취 량으로 저장 될 수있다-20 ° C에 대한 최소 2 년.

세포 배양 접시의 4 코팅

  1. 250x PLO 주식을 준비하는 1875 mg의 폴리 - L - 오르니 틴 500 ml의의 (PLO) 증류수 H 2 O를 녹여. 필터는 0.2 ㎛의 주사기 필터를 이용하여 멸균, 2 ml의 분취 량을 만든다.
    주 :이 분취 량을 최소 2 년 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
  2. 1000 배 피브로넥틴 주식을 준비하기 위해 1 ml의 멸균 증류수 H 2 O 1 mg의 소 피브로넥틴을 녹인다. 이 끈적 끈적한 단백질을 응고 수 있으므로 와동하지 마십시오. 10 분 동안 손으로 부드럽게 흔들어.
    1. 가끔 진탕 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 완전히 용해를 확인합니다. 피브로넥틴의 완전 용해 미만 37 ° C의 솔루션을 따뜻하게. 하지 마십시오 필터 - 소독.
      주 : 용액 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
  3. 필요로 플라즈마 전처리 플라스틱 세포 배양 접시 (100mm 또는 다른 크기를 사용할실험). 마이그레이션을 평가하기 위해, 500 μm의 그리드와 35mm 요리를 사용합니다. 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 12 시간 동안 2 ml의 1 배 PLO와 하룻밤 요리를 품어. PBS 1X 2 ㎖로 두 번 씻으십시오.
  4. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 12 시간 이상 동안 음식을 2 ㎖의 1X 피브로넥틴 (1 μg의 / ㎖ 최종 농도)를 첨가하고, 배양한다. 그냥 세포를 도금하기 전에 피브로넥틴을 제거합니다.
    주 : 피브로넥틴 피복 된 접시를 37 ℃에서 적어도 2 주 저장 될 수있다.

5. 표준화 해부과 두피 뇌실 영역의 준비 (SVZ)

  1. 쥐 배아 일 14.5 (E14.5, 스프 라그 - 돌리)와 마우스 E13.5 (C57BL / 6) 시간 제한-결합하여 배아를 가져옵니다. 8시 다음날 아침까지 18 : 00 ~ 동물 메이트. 상대의 날 후 정오 E0.5 간주됩니다.
  2. 5 % 아이소 플루 란과 0.8 L / 분 산소 흐름을 임신 동물을 마취. 날카로운 DISS와 발 압축에 의해 응답을 확인ection 집게. 동물의 목을 벨. CO 2 세포 복구 줄기에 영향을 미치는으로 CO 2 질식을 피하십시오.
  3. 제왕 절개에 의한 배아를 검색합니다.
    1. 부정사 위치에 동물을 배치하고 70 % 에탄올 모피를 소독. 자궁 위의 하복부에 약 8cm의 V 모양의 피부 절개를 만들기 위해 수술 집게와 가위를 사용합니다. 그대로 근육 벽을 유지하면서 모피 만 피부를 절개.
    2. 복막를 입력 근육과 복부 근육 벽을 절개하는 신선한 집게와 가위를 사용합니다.
    3. 낮은 후방 복막의 자궁을 확인합니다. 주변 조직에서 날카로운 분리하여 자궁을 제거합니다.
    4. 얼음처럼 차가운 1X PBS의 멸균 1X PBS와 배아와 장소 자궁을 씻으십시오.
    5. (배 확대, 그림 1B) 해부 현미경으로 배아에서 배아를 분리합니다 자궁 벽을 열 뾰족한 가위를 사용합니다. (배아 껍질을 제거하는 포셉 한 쌍을 사용하여 그림 1B). 얼음에 확장 매체에서 배아를 유지합니다.
    6. 개발 쥐 신경계 5 아틀라스하여 올바른 발달 단계를 확인합니다. 올바른 배아 크기는도 1b에 도시된다.
    7. 도 1a에 도시 된 바와 같이 쥐의 앞다리 (FL)에 자리 형성을 시작의 존재에 의해 더 정확한 나이를 확인합니다.
      참고 : 뒷다리 (HL)이 아직 자리 분리 (그림 1B)를 표시하지 않습니다.
  4. 해부를 들어, 얼음처럼 차가운 1X PBS로 가득 코팅 배양 접시에 배아를 전송합니다. 멸균 미세 집게를 사용 (20X 배율 3 배) 스테레오 해부 현미경 해부를 수행합니다.
    참고 : 페트리 접시 플라즈마 코팅 된 세포 배양 접시 일어날 수 있으므로 접시 표면에 조직의 부착을 방지 할 수 있습니다. 날카롭게 텅스텐 와이어 바늘 또는 유사한 또한 해부의 특정 단계에 대한 도움이됩니다.
  5. INTE에서 시작하여 두피와 두개골을 제거현상 신경관 (도 1C)에 액세스하기 위해 전방 및 후방 두 집게 동시에 당겨 현상 telencephalon (TEL)와 간뇌 (DI) (도 1b)의 rsection.
  6. rhombencephalon에서 중뇌 (MES)를 분리, 중뇌 - 후뇌 경계 (MHB, 그림 1B-D에서 검은 색 화살표 머리)를 확인합니다. 다만이나 MHB (그림 1D, 삼각형 화살표) 아래 rhombencephalon을 잘라.
    참고 : MHB에서 추가 피하 공간은 신경관에 손상을주지 않고 피부의 제거를 용이하게한다.
  7. 얼굴 골격 (그림 1E)와 두개골 기지에서 telencephalon / 간뇌 사이의 연결을 단절. 이 telencephalon, 간뇌와 중뇌 (TEL-DI-MES) (그림 1 층-H)를 포함하는 블록을 초래한다.
  8. 얼음에 확장 매체에 TEL-DI-MES 블록을 전송합니다. 이 COMPLET 유지엘리 코팅되지 않은 페트리 접시에서 확장 매체에 덮여. NSCs의와 대뇌 피질의 SVZ 들어있는 telencephalon에 손이 닿지 않도록 포셉 한 쌍의와 중뇌에서 블록을 잡으십시오.
  9. 반복 5.5 모든 배아 (그림 1 층-H)와 5.8 단계를.
  10. 한 이동 전화-DI-MES 신선한 얼음처럼 차가운 1X PBS에 차단합니다. 도 1I에 나타내는 바와 같이, 간뇌에서 중뇌 분리, 중뇌 전방 (도 1F-H)에서의 점선을 따라 절단.
  11. 그림 1 층에있는 점선을 따라 절단하여 TEL에서 DI를 분리합니다. 그림 1J에서 격리 telencephalon를 참조하십시오.
  12. 그림 1J의 점선을 따라 절단, 두 telencephalic 반구를 분할합니다. 도 1K에 도시 된 바와 같이이 두 분리 된 반구 초래한다.
    참고 : 왼쪽 반구는 그림 1L로 확대됩니다.
  13. 중간 갱을 확인lionic 예하 (MGE,도 2a *) 및 측면 신경절 예하 (LG 전자, 그림 2A +) 미래 난원 공의 interventriculare 통해 볼.
    1. 집게 나 바늘을 사용하고 MGE LGE와 전방 피질 (CTX 개미도 2B)과 교차하는 직선을 따라 절개. 피질, 해마 (엉덩이) 및 맥락막 총 (CP)을 통해 직선을 잘라. 이것은 (GE 2B, C 피규어)가 신경절 예하의 후각 망울 (OB)를 포함하여 전방 피질을 분리한다.
  14. 다시 피질, 해마 및 맥락막 신경총을 통해 절단, 꼬리 신경절 예하 (CGE, 그림 2C, D) 및 후방 피질 (그림 2C)의 교차로에 두 번째 직선을 잘라.
  15. telencephalon을 평평하게. 완전히 후방 극과 후각 망울 (그림 2D)를 제거합니다. 확인이전 -6,7- 정의 해마 및 맥락총 (도 2C)를 포함하는 외피 밑단.
    참고 : 해마는 대뇌 피질보다 얇은 neuroepithelium 있습니다. 공산당은 붉은 혈관을 포함하고 있습니다.
    1. 신경절 예하 (그림 2D)의 크기와 동일 피질의 크기를 떠나, 피질에서 대뇌 피질의 밑단을 분리합니다. 이 외피 (표적 조직) 및 신경절 예하 (GE,도 2d)의 블록을 초래한다.
  16. 접시 표면에 심실 (내부)면 피질-GE 블록을 뒤집습니다.
    참고 : 반구의 외부 표면이 실험 (그림 2E)를 직면하게 될 것이다. 외면 혈관 함유 수막 (도 2e)가있다.
    1. 왼쪽 손으로 접시 표면에 GE 핀과 (오른쪽 (지배) 손에 집게 한 쌍의 그림 2 층을 수막을 벗겨 ).
      참고 : 수막이 강하게 피질을 준수하기 때문에 이것은 기술적으로 가장 까다로운 단계이다. 피질에서 수막의 분리 단계 5.13.1 및 5.14에서 완전히 직선 (들쭉날쭉하지 않음) 절단에 의해 촉진된다.
  17. 반복 다른 반구 모든 배아에 대한 5.16로 5.12 단계를 반복합니다. LG 전자 (그림 2G, 2H)의 절반 주요 직경의 거리에서 LG 전자를 따라 피질을 잘라. 해부 피질은 1.2 mm X 2.4 mm (그림 2H)의 영역에 걸쳐 하 NSCs의와 SVZ / 새싹 층을 포함한다.

이식편 문화 6. 준비

  1. 이하 400 μm의 직경 (그림 2I)의 외식으로 피질을 잘라. 참조 (그림 2H 및 2I)에 대한 해부 페트리 접시 아래에 위치 400 μm의 그리드 (보충 그림 1)를 사용합니다. 얼음 공동으로 신선한 페트리 접시에 모든 외식 이동LD 확장 매체.
  2. 조직 배양 접시 (단계 4.4)에서 피브로넥틴를 제거합니다. 이 건조하도록 허용합니다. X 10mm 10mm (그림 3)의 격자 크기와 35mm 요리의 중심에 찬 확장 매체의 1 ML을 추가합니다. 매체가 구형 드롭 (그림 3)을 형성 할 수 있습니다.
  3. 드롭의 중심으로 8 외식까지 삽입합니다. 외식이 이상적으로 마이그레이션 분석을위한 서로 간의 최소 3 mm 거리에 그리드에 위치해야한다 (8 항 참조).
  4. 외식의 부착을위한 세포 배양 인큐베이터에서 약 1 시간 (37 ° C, 21 % O 2, 5 % CO 2)에 접시 부화. 외식 정착 및 피브로넥틴 코팅 표면에 부착 할 수 있습니다. 외식을 분리하고 최적의 그리드 센터의 이사 수 있기 때문에, 요리를 흔들지 마십시오.
  5. 1 시간 배양 후 (37 ° C, 21 % O 2, 5 % CO 2), 2 mL의 팽창 매체의 총 부피 플러스 성장 F에 접시를 채워배우 또는 관심의 물질 테스트하고 부화합니다.
    참고 : 어느 효소 소화 않으며, 혈청 또는 원심은 이식편 준비를위한 필요하다. 이것은 세포의 무결성에 최적입니다.

NSC 단일 세포 배양 7. 준비

  1. 37 ° C의 확장 및 계대 매체를 따뜻하게.
  2. 차가운 확장 매체 (튜브 A)와 15 ML 튜브로 (단계 5.17)에서 해부 피질 조각을 전송합니다. g X 1,200에서 5 분 동안 피질 조각을 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 피질 조각을 재현 탁 200 μL 사전 예열 확장 매체를 추가합니다.
  3. P1,000 팁 (튜브 A)와 15 ML 튜브에 미리 예열 계대 매체의 700 μl를 추가합니다. 조심스럽게 펠렛을 재현 탁. 15 ML 튜브의 하단에있는 팁을 놓습니다. 조심스럽게 천천히 P1,000 팁 3 회 흡입하여 조직편을 해리.
    주 : 배지 계대하는 세포의 분리를 촉진하는 효소의 사용을 피하는 것이 요구된다.
  4. 튜브 하단에 정착 큰 (무거운) 해리되지 않은 부분에 대한 30 ~ 60 초 동안 앉아 할 수 있습니다. 단일 해리 세포 상등액에 남아 있습니다. 신선한 15 ML 튜브 (튜브 B)에 상층 액 700 μl를 전송합니다.
  5. 반복 7.3과 7.4은 더 큰 조각을 해리 단계를 반복합니다.
  6. 반복 7.3과 7.4에게 더 큰 조각을 떼어 놓다하는 두 번째 단계를 반복합니다. 신선한 15 ML 튜브 (튜브 B) 모든 뜨는을 전송합니다.
  7. 5 ML의 총 부피로 팽창 매체를 추가합니다. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 트리 판 블루 염색에 의해 죽은 세포를 평가합니다.
    참고 : 작은 NSCs의 큰 세포보다 7.2 7.6 단계를 용납. 10 배아에서 10 %의 죽은 세포와 약 4 × 10 6 세포를 기대합니다.
  8. NSCs의 확대, 8 mL의 팽창 매체의 부피 10cm의 피브로넥틴 - 코팅 된 조직 배양 접시에 1.5 × 106 세포를 접시. 표준 확장을 위해, 1000 배 rhFGF2 주식의 8 μl를 추가합니다. 매일 rhFGF2 μL 8을 추가하고 나를 변화매일 디아.
    참고 :이 발달 단계에서의 피질은 NSCs의 대부분과 분화 된 세포의 소수를 포함합니다. 차별화 된 소수의 세포는 rhFGF2 처리에 대응하고 확장 문화 동안 죽지 않습니다.
  9. 항로는 60 %의 합류에 NSCs을 확장.
    1. 통로 NSCs을 위해 확장 매체를 제거합니다. 신속하게 세척 세포 5 ML의 계대 매체로 3 회. 4 분 - 2 기다립니다. 칼슘 + 마그네슘과 2 + 세포없이 천천히 반올림, 표면에서 분리합니다. 위상 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. 필요한 경우 표면에서 시각적으로 분리 관찰 될 때까지, 또 다른 몇 분 정도 기다립니다.
      단일 세포가 완전히 분리되지만, 대부분의 세포는 여전히 접시 표면에 부착됩니다합니다. 분리에 필요한 시간은 피브로넥틴 피복의 길이에 의존한다. 짧은 피브로넥틴 코팅 (12 시간 이하) 빠른 세포 분리가 발생합니다. 더 이상 실험 (>; 일주) 이상 24 시간의 피브로넥틴 코팅을 권장합니다.
  10. 부드럽게 표면에서 세포를 분리하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 세포 5 ML의 계대 매체를 수집하고 신선한 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 계대 매체에 추가로 5 ㎖의 반복.
  11. 상기 튜브의 하단에 10 ㎖ 피펫을 배치 최대 피펫 팅하여 3 회 다운 15ml를 튜브에 세포를 해리. 실온에서 1,200 × g으로 15 분 동안 튜브를 스핀. 상등액을 제거하고 2 ml의 확장 배지에서 펠렛을 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 죽은 세포를 평가하기 위해 트리 판 블루를 사용합니다.
    참고 : 60 % 합류로 전개 후, 4 기대 - 10 %에서 죽은 세포 수 5 × 106 세포.
  12. 판 더 구절에 대한 10cm 접시 당 8 × 10 5 세포.

8. 마이그레이션 평가

  1. 마이그레이션 평가를 들어, 외식에서 제 5 절 종자에 따라 외식을 분리35mm 그리드 요리. 한 시간 도금 후, FGF2 (rhFGF2)를 추가합니다. 2 일 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
    참고 : 최적의 이식편 첨부를 들어, 요리를 이동하지 마십시오.
  2. 1000 μL 팁으로 매체를 제거합니다. 1000 μL 팁 내부 원에서 시작한다 (그림 3)에 의해 확장 매체의 2 ML을 추가합니다. 이 외식에 표면 장력을 감소시킨다.
  3. 실험을 위해 필요에 따라 단독으로 또는 조합하여 성장 인자를 추가한다. FGF2 / BMP4 / TG​​Fβ1 긍정적 컨트롤을 사용합니다. 참고 :이 실험에서, 35mm 접시 당 2 μL의 FGF2, 2 μL BMP4, 4 ㎕를 TGFβ1 단독 및 조합 (그림 5)에 추가되었습니다.
    1. 추가 요소 및 / 또는 검증 가능한 물질을 추가합니다. 37 ℃에서 2 일간 다시 손길이 닿지 않은 요리를 유지합니다.
  4. 거꾸로 현미경에 외식의 사진을 가져 가라.
    참고 : 리빙 이식편 고정 세포보다 위상차 이미지를 얻었다. 모두 사용될 수있다.
  5. 마이그레이션평가 화소 측정 할 수있게 해주는 그래픽 소프트웨어 (예, 피지 8)을 사용한다.
  6. 픽셀에서 500 μm의 거리의 요리 그리드를 측정하고 내부 레퍼런스로 사용합니다.
  7. 이동 시작점으로서 이식편의 중심을 정의한다. 이식편의 중심 (10) 셀의 최 군 사이의 거리를 측정한다.
    참고 : 모든 세포는 원심 멀리 이식편에서 이동한다. 그들은 자발적으로 테스트 환경 (그림 5)에서 주변에있는 시트를 형성한다.

9. 침략 평가

  1. 프로토콜 제 4 항에있어서, 피브로넥틴 코팅 조직 배양 24 웰 플레이트를 준비합니다.
  2. 셀 침공 챔버의 상부 우물에 따뜻한 확장 매체의 300 μl를 놓습니다. 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2의 챔버를 부화.
  3. 상단 아니라에서 확장 매체를 제거하고 코팅 된 24 웰 플레이트에 보이든 챔버를 배치합니다.
  4. 50 추가잘 아래로 0.5 rhFGF2 ㎕의 0.5 μL의 rhBMP4 따뜻한 확장 매체의 0 μL.
  5. 통로 NSCs의 1 4 절에서 7 통행 설명 된대로 계산이 적합하다.
  6. 플레이트 rhFGF2 0.3 μL와 보이든 챔버의 상부 잘 rhBMP4 0.3 ㎕의 따뜻한 확장 매체의 300 μL의 볼륨에 5 × 10 5 세포.
  7. 문화 24 시간의 시드 NSCs을.
  8. 또 다른 48 시간 동안 챔버와 문화에 세포를 추가 요소 및 / 또는 검증 가능한 물질을 추가합니다.
    주 : 세포가 침입하는 경우, 이들은 잘 바닥 기저막 층을 잘 상부로부터 전달된다. 침습성 세포 보이든 챔버의 바닥에 달라 붙는 것이다.
  9. 제조업체가 제공하는 프로토콜을 따르십시오. 두 번 청소하여 상단 잘 비 침습적 세포를 제거하기 위해 (침공 분석 키트에 포함) 면봉을 사용합니다.
  10. 우물에서 매체를 제거하고 500 μl를 확장 매체를 추가살아있는 세포와 웰에 핵 염색 DAPI와 세포막 염색.
  11. 37 ° C에서 10 분, 5 % CO 2 부화.
    주 : 염료 최적 시각화 8 각각 막과 침습 세포의 핵에 통합된다. 옵션 : 여러 가지 빛깔의 면역 세포가 계획되면 세포막의 염료를 생략합니다.
  12. 염료와 매체를 제거하고 확장 매체로 두 번 씻는다. 시각화 및 이전 8 입증 된 바와 같이 거꾸로 형광 현미경으로 침입 세포를 계산합니다.
    참고 : 일부 침략 세포가 챔버의 바닥으로부터 분리 수도 그들이 코팅 된 표면에 부착 위치를 아래의 웰 표면에 떨어졌다. 완벽한 분석 웰 표면에서 세포를 포함한다.
  13. 배지를 제거하고 10 분 동안 빙냉 신선한 4 % PFA에 세포를 고정한다. 1X PBS로 세척 배. 이전에 8-10을 설명 된 바와 같이, 침입 세포에 면역 세포를 수행합니다.

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결과

이 EMT 모델 시스템은 단일 셀이나 현상 신경관의 특정 영역에서 이식편으로서 NSCs의 양의 표준화 분리에 기반 중앙 피질 (도 1 및도 2). 정량적 평가를 위해, 절편을 500 μm의 격자 배양 접시 (도 3)의 중앙에 바로 시딩 하였다. 중앙 피질에서 이식편 먼저 성장 인자 (표 1)의 상이한 조합에 추가 이틀 후, 이틀 FGF2 노출시켰다. 우리는 개발 신경 튜브의 다른 지역보다 큰 피질에서 시작되었다. 우리는 BMP4에서 배양 만 외식은 철새 응답 (표 1 및 보충 그림 2)를 보여 관찰.

다음 podoplanin (PDPN) 표현은 정의 된 조건에서 분석 하였다. PD...

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토론

EMT 분석을 활용 NSCs을위한 표준화 된 시스템이 설명이 연구에서 (보충 그림 3에 요약). 표준화 재현성 (표 1 및 2)을 보장한다. NSCs의는 개발 피질에서 일반적으로 EMT를 받아야하지 않는 조직을 파생됩니다. 이 EMT 초기 단계의 분석을 위해 유리하다. EMT의 초기 단계는 적절하게 유전 적 변화를 축적하고 이미 EMT 기능을 채택하고있다 종양 세포에서 공부 할 수 없습니다. 또한, 일차 종양 샘플은 대부분의 악성 종양 이종 침습 및 비파괴 세포를 모두 포함하고 있기 때문에 EMT 이해할 적합하지 않다. 제시된 프로토콜은 EMT 유도의 초기 단계를 연구하는 새로운 모델 EMT 연구자를 제공합니다. (첫 번째 단계 Zeb1 및 Zeb2 동안 제 2 단계 Twist2 동안, 상향 조절된다 Figur을 : 여기에서 우리는 Hogan 박사와 트위스트 가족의 키 EMT의 유도가 순차적으로 활성화되는 것을 보여전자 6). 이전에, ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 MHS와 AG (SNF IZLIZ3_157230)에 부여하여 바젤 과학 재단의 대학과 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원되었다. 우리는 감사 : 박사 타니아 리 날디 Burkat을 아낌없이 인프라를 제공하기 위해; 토론과 의견에 대한 Bettler 그룹의 모든 구성원. 우리는 게르하르트 Dorne (라이카, 스위스) 풀 HD MC170 비디오 카메라의 전문적이고 유능한 설치 (라이카, 스위스) 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BMP4, rhBMP4RnD 시스템 314-BP-01M
소 췌장 인슐린 시그마 I1882
Boyden 챔버, CytoSelect 세포 침입 분석Cell BiolabsCBA-11024 웰 플레이트 시스템
그리드Ibidi 500mm 접시, 35mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045플라즈마 멤브레인 염료, 1:1,000에서 사용.
DAPILifeTechnologiesD1306재고 5 mg/ml. 사용 1:10,000. 암성. 적절한 보호(장갑, 코트, 고글)가 필요합니다.
DMEM/F12 1:1 중간 병Gibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD 시스템233-FB-01M
Fibronectine, 소Sigma F4759
글루타맥스 보충제 Gibco Invitrogen 35050-061
픽셀 측정 기능이 있는 그래픽 소프트웨어Fijifiji.sc/Fiji버전 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS 미디어Sigma H9394
인간 아포-트랜스페린시그마T1147폐 자극성 가능성 흡입을 피하십시오. 적절한 보호 장치를 사용하십시오.
L-글루타민Gibco Invitrogen 25030-024
Nestin, 마우스 안티 Nestin 항체GenetexGTX261421:100에서 사용, 4% PFA 고정, Triton X100에서 0.1%
Olig2, 토끼 안티 Olig2 항체제공 Hirohide Takebayash개인 재고1:2,000에서 사용, 4% PFA 고정, Triton X100에서 0.1%
페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존Gibco Invitrogen 15240-062
Podoplanin, 마우스 안티 Podoplanin 항체AcrisDM3614P1:250에서 사용, 4% PFA 고정, Triton X100
Poly-L-ornithineSigma를 피하십시오 P3655
푸트레신시그마 P5780피부 및 눈에 자극성이 있으나. 적절한 보호가 필요합니다.
아셀렌산나트륨시그마 S5261
Sox10, 토끼 안티 Sox10 항체Millipore ChemiconAB57741:200에서 사용, 4% PFA 고정, 0.1%TGFb1에서 Triton X100
rhTGFb1RnD 시스템240-B-010
코팅되지 않은 페트리 접시팔콘코닝351029
,

참고문헌

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