종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

요약

이 프로토콜은 단일 셀 해상도 생체 내에서 실시간으로 상호 작용 다세포 장시간 경과 이미징을 수행하는 다 광자 현미경의 사용을 설명한다.

초록

종양 미세환경에서 숙주 기질 세포는 종양 세포와 상호 작용하여 종양 진행, 혈관 신생, 종양 세포 파종 및 전이를 촉진합니다. 종양 미세환경에서의 다세포 상호작용은 방향성 종양 세포 운동성 및 혈관 투과성을 포함한 일시적인 사건으로 이어질 수 있습니다. 종양 혈관 투과성의 정량화는 혈관 염료의 유출을 측정하기 위해 종말점 실험을 자주 사용했습니다. 그러나 다세포 상호 작용과 혈관 투과성의 일시적인 특성으로 인해 이러한 동적 이벤트의 동역학을 식별할 수 없습니다. 주사 가능한 염료 또는 형광 단백질로 세포와 혈관 구조를 라벨링함으로써 고해상도 타임 랩스 생체 내 현미경 검사는 종양 미세환경에서 일시적인 이벤트를 직접 실시간으로 시각화할 수 있도록 했습니다. 여기에서는 다광자 현미경을 사용하여 살아있는 마우스에서 확장된 생체 내 이미징을 수행하여 종양 미세환경에서 다세포 역학을 직접 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포 표지 전략, 유방 피부 피판의 수술 준비, 꼬리 정맥 카테터에 의한 주사 가능한 염료 또는 단백질 투여 및 타임 랩스 이미지 획득에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법에서 얻은 타임 랩스 시퀀스는 종양 미세환경에서 운동성 및 혈관 투과성의 세포 이벤트의 동역학의 시각화 및 정량화를 용이하게 합니다.

서론

차 유방 종양에서 종양 세포의 보급은 대 식세포 및 혈관 내피 세포를 포함하는 기질 세포뿐만 아니라 종양 세포를 포함하지만, 호스팅하는 것으로 나타났다. 또한, 종양 혈관 투과성 증대 ¹ 이상이다. 따라서, 종양 세포, 대 식세포 및 내피 세포가 일차 종양 미세 혈관 투과성 및 종양 세포 intravasation을 중재 상호 작용하는 방법을 결정하는 단계 이해 전이에 중요하다. 혈관 투과성, 종양 세포 intravasation 종양 미세 환경에 다세포 상호 작용의 기본 신호 메커니즘의 동역학을 이해하는 항암 치료제의 개발 및 관리에 중요한 정보를 제공 할 수있다.

생체 내에서 종양 혈관 투과성 연구의 주요 수단은 에반스 블루 ^2, 고 분자량의 덱스 트란 (155 kDa의) 혈관 외 염료로 측정했다염료의 주입 후 일정한 시간 점 ^(3)과 형광 또는 (알부민을 포함) 추적자 공역 단백질 ^4. 현미경의 발전은, 동물 모델 및 형광 염료는 생체 내에 현미경 ^(5)를 통해 세포 과정과 살아있는 동물의 혈관 투과성의 시각화를 사용할 수있다.

여러 시점에 걸쳐 정적 인 이미지, 또는 짧은....

프로토콜

설명하는 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행해야합니다.

1. 생성 형광 표지 된 종양 및 종양 관련 대 식세포

1. 강화 된 녹색 형광 마우스 유방 종양 바이러스 긴 터미널 반복, 즉 형광 기자 [와 형질 전환 마우스와 폴리오 중간에 T 항원 (MMTV-PyMT)를 구동하는 자연, 토착, 유전자 조작 마우스 유방암 모델을 교차하여 형광 표지 된 종양 세포를 생성 단백질 (EGFP), 향상된 시안 형광성 단백질 (ECFP)로 이루어지는 군 또는 Dendra2] ^-8,9-.
2. PyMT 동물에서 형광 라벨 식세포와 형광 [즉, MacGr myeloid- 및 macrophage- 특정 형광 기자들과 유 전적으로 조작 된 마우스 모델을 교차하여 종양 세포를 표지EEN ¹⁵ MacBlue 마우스 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. 대안 적으로, 형광 형광 표지 PyMT 종양 세포 (동계) 인간 유방암 세포주 또는 일차 인간 환자 유래의 종양 (이종) ^{(11, 17)의} 동....

결과

연장 시간 경과 생체 내에 현미경 종양 미세 환경에서 다세포 프로세스의 단일 셀 해상도 이미징 할 수 있습니다. 형광 표지 된 종양 세포, 대 식세포, 혈관 공간, 제 2 고조파 발생 신호를 이용하여 콜라겐 섬유 네트워크를 시각화함으로써 종양 미세 환경에서 다수의 구획을 동시에 촬상 동안 추적. Dendra2 (도 1a)로 표지 유방 종양 세포, MMTV-PyMT-Dendra2 쥐에서 수행 된 형광 단백질 표지 된 종양 세포가 형질 전환 마우스에서 생성 될 수있다. ECFP으로 표시 식세포가 Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 마우스 이러한 형질 전환 마우스를 횡단하여 종양 세포와 대 식세포 모두 MMTV-PyMT 마우스에 표시되어 있습니다. 종양 세포 및 대 식세포의 이중 표지 전략 두 세포 유형의 직접적인 상호 작용 (도 1a 실시간으로 시각화 될 수있다). 또한, GFP 형질.......

토론

종양 미세 환경에서 자연적으로 발생하는 세포 상호 작용은 종양 세포 운동성 및 intravasation 변화로 이어질 수있다. 살아있는 종양 조직의 고해상도 생체 내에 촬상 매우 과도 ^10,13,24 될 수 다세포 역학의 시각화를 허용한다. 종양 미세 환경에서 프로세스의 분자 메커니즘에 필수적인 정보를 제공 할 수 있습니다 이산 시점으로 얻은 생체 내 분석 또는 시간 경과 이미지의 최종 점. 생체 내에 영상화 연구 약물 치료 ^{25 내지 30에} 혈관 신생, 종양 세포 이동 및 응답에 대한 새로운 통계를 생성 며칠 동안 발생하는 종양 미세 환경에서 처리를 연구하는 데 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석 인해 프로세스의 시간 스케일로 종양 미세 환경에서 과도 이벤트의 동력학을 캡처 할 수는 ^{7,31 공부된다.} 일정한 과정에서 여러 일시적인 이벤트를 구별하는 것은 의미있는 광고입니다생체 내에 현미경의 유리한.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
155 kDa 덱스트란-테트라메틸로다민 이소티오시아네이	Sigma Aldrich	T1287	1x PBS에서 20 mg/ml
70 kDa 덱스트란-Texas Red	Life Technologies	D-1830	1x PBS에서 10 mg/ml로 재구성
10 kDa 덱스트란-플루오레세인 이소티오시아네이	Sigma Aldrich	FD10S	에서 20 mg/ml로 재구성
			희석Q21561MP 기술 25 μ l 175 μ년; 주입용 1x PBS의 l
MMTV-PyMT 마우스	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP 마우스(Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP 마우스	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia(isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
산소	AirTech
1 ml 주사기, 투베르쿨린 슬립 팁	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25  mm) 바늘	BD	305128
폴리에틸렌 마이크로 의료 튜브	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28mm 내경 x 0.64mm 외경
현미경 커버 유리	Corning	2980-225	두께 1.5, 22 x 50  mm
PhysioSuite MouseSTAT 맥박 산소 농도계, 소프트웨어 및 센서	Kent Scientific
실험실 테이프	Fisher Scientific	159015R
연질 고무 패드	McMaster-Carr	8514K62	초연질 폴리우레탄 필름, 3/16" 두께, 12" x 12", 40 Oo 경도계, 일반 뒷면
하드 고무 패드	McMaster-Carr	8568K615	고강도 네오프렌 고무 시트 1/4" 두께, 12" x 12", 50  경도계
현미경	Olympus		현미경은 20X 1.05NA 대물 렌즈를 사용하는 Olympus IX-71 스탠드를 기반으로 하는 맞춤형 2개의 레이저 다광자 현미경입니다.
7-펀치 세트	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" 홀 직경, 해머 구동 홀 펀치용

트 은 로 재구성 은 트 는 1x PBS Qdot 705 ITK 아미노(PEG) 양자 점 수명