이 프로토콜은 30분 이내에 10μL의 전혈에서 단백질의 펨토 어금니 감지 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. 이는 랩온-어-디스크(lab-on-a-disc)에 통합된 전기방사 나노섬유질 매트를 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 높은 표면적과 향상된 신호 대 잡음비를 위한 효과적인 혼합 및 세척을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 생물학적 샘플에서 소량의 단백질을 검출할 수 있는 유망한 방법입니다. 시료량 및 분석 시간 단축을 위한 플랫폼과 완전 자동화를 제공하는 장치는 현장 진단에 잠재적으로 사용할 수 있도록 필요합니다. 최근에는 TiO2 나노섬유성(NF) 매트로 구성된 랩온-어디스크(lab-on-a-disc)를 활용하여 혈청 단백질, C-반응성 단백질(CRP) 및 심장 트로포닌 I(cTnI)의 초고감도 검출을 입증했습니다. 30분 안에 소량의 전혈에서 펨토 어금니(fM) 감지 감도로 넓은 동적 범위를 보여주었습니다. 이 장치는 혈액 분리, 계량, 혼합 및 세척을 위한 여러 구성 요소로 구성되어 있으며, 적은 시료 부피로 인한 감도 향상을 위해 자동화되어 있습니다. 여기, 비디오 데모에서 우리는 NF 및 디스크 제작, 통합 및 작동에 대한 실험 프로토콜과 노하우를 다음 순서로 보여줍니다 : TiO2 NF mat 준비 프로세스; TiO2 NF 매트를 디스크에 전사 인쇄; 면역 반응, 디스크 조립 및 작동을 위한 표면 개질; On-Disc 검출 및 면역 분석에 대한 대표 결과. 이 장치를 사용하면 샘플과 시약의 소비를 최소화하면서 다중화 분석이 가능합니다. 장점을 감안할 때, 이 장치는 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있어야 하며 부족한 단백질의 분석을 용이하게 하는 데 도움이 되는 것으로 입증되었습니다.
서론
질병 진단을위한 여러 플랫폼 1,2- 예컨대 나노 와이어, 나노 입자 (3), (4) 나노 튜브 (5)와 나노 파이버 (NFS) 6-8과 같은 나노 재료에 기초하여 개발되었다. 이 나노 물질은 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 매우 민감한 생물 검정을위한 새로운 기술의 디자인 적으로도 뛰어난 전망을 제공합니다. 예를 들어, 메조 포러스 산화 아연 나노 유방암 바이오 마커의 펨토 몰 민감한 검출을 위해 사용되었다. 구 최근 화학적 안정성을 고려하여 생체 시료 애플리케이션 10 탐구되었다 티탄 (TiO2), 이산화에 기초하여 나노 물질을 11 무시할 단백질 변성 12 및 또한 생체 적합성.도 13은 이산화 티탄의 표면에 수산기 화학적 변형 및 생체 분자의 공유 결합을 용이하게한다. 14,15 무늬 이산화 티탄 생N 막 16 이산화 티탄 (17) 표면적이 증가하여 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는 데에 이용 된 나노 튜브; 그러나, 제조 공정이....
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프로토콜
주 : 혈액 건강한 사람에서 도출하고, 혈액 수집 튜브에 수집 하였다. 서면 동의서는 모든 자원 봉사자들로부터 얻은 것입니다.
이산화 티탄 NF 매트 1. 제작
- 전구체 용액 (22)의 제조
- 에탄올 (99.9 %, 3 ml) 및 빙초산 (3 mL)을 혼합하여 티타늄 테트라 이소 프로 폭 사이드 (TTIP) 1.5 g을 용해시키고, 자기 교반기에서 30 분 동안 RT에서의 수용액 (25 ° C)을 혼합한다.
- 에탄올 (99.9 %)의 3.64 g의 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)의 11 중량 %를 용해시키고, 핫 플레이트, 자기 교반기를 사용하여 1 시간 동안 65 ° C에서 상기 용액을 교반한다.
- 결합 및 핫 플레이트 자석 교반기 4 시간 동안 65 ° C에서 두 솔루션을 저어.
- 전기 방사
- 200 μm의 내측 diame의 스테인리스 바늘에 연결된 주사기로 제조 된 용액을로드터. 플런저를 제거한 후, 주사기에 직접 용액을 붓는다.
- 높은 DC 전압 (15 kV....
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결과
이 프로토콜, 높은 감도를 제조 하였다으로 전체 혈액에서 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치를 사용. 이산화 티탄 NF 매트는 전기 방사 및 소성 공정에 의해 제조 하였다. 이러한 유량, 전압 및 회전 시간 등의 조건을 전기 방사 원하는 직경, 형태 및 두께는 NFS를 제조하기 위해 최적화되었다. 조건이 최적화되지 않은 경우는 NFS 형성의 질이 저하되었다. 특히 연맹은 낮은 전압 (kV의 5)의 고분자 용액으로부터 방사되지하였고, 전압이 높을 때 (> 20 kV로)을 세분화 하였다. 마찬가지로, 회전 시간은 적절한 밀도, 너무 희소하지 (1 분) 또는 너무 조밀 한 (30 분)와 연맹의 제조에 중요했다. 또한, 높은 유속에 의한 비드의 형성을 방지하기 위해 유속을 조작 하였다. 그래서, 1-15 kV의인가 전압의 10 분 전기 방사 시간 및 0.3 ml의 용 hr의 유량 -1 형태 얻어진 연맹의 두께
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토론
이산화 티탄 NF 통합 된 디스크에 대한 분석은 혈액의 매우 낮은 볼륨에 존재하는 낮은 풍부한 단백질의 고감도 검출을위한 신속하고 저렴하고 편리한 기술이다. 이 기술은 적은 양의 샘플 (10 μL)를 사용하는 장점을 가지며, 동시에 다수의 샘플 분석을위한 의무이다. 이것은 다중 면역 장치로서 큰 잠재력을 제공한다. 상기 장치는 통상적 인 ELISA를에 필요한 혈장 분리, 같은 시료의 전처리 단계를 필요로하지 않는 추가적인 이점을 갖는다. 또한, 상기 장치로 인해 미리 설계된 챔버, 채널, 밸브 전체 면역 절차 (예를 들면, 혼합, 세척, 결합 등)을 자동으로 수행 할 수있다. 접착제를 사용하는 대신 제분 수동 조립 또한 상용화 디스크의 제조 방법을 이용하여 (예를 들어, 사출 성형, UV / 초음파 / 열 접착) 분석 디바이스의 제조의 전체 공정은 수 있습니다자동화.
또한, 여기에 제시된 전사 인쇄 방법은, 얇은 접착제 PD.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 한국 연구 재단 (NRF) 보조금 (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), 한국 정부에 의해 투자 한국의 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (A121994)와 IBS-R020-D1의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Si 웨이퍼 | LG SILTRON | 광택 웨이퍼, 테스트 등급 | 직경 (mm) = 150, 방향 = < 100>, 도펀트 = 붕소, RES(옴-cm) = 1 - 30, 두께(μ m) = 650 - 700 |
| 폴리카보네이트(PC) | 대동 플라스틱 | PCS#6900 | 두께(mm) = 1 및 5 |
| 티타늄 테트라이소프로폭사이드, 98%, | 시그마-알드리치 | 205273 | |
| 폴리비닐피롤리돈, Mw = 1,300,000 | 시그마-알드리치 | 437190 | |
| 아세트산 | 시그마-알드리치 | 320099 | |
| 무수 에탄올 | 시그마-알드리치 | 459836 | |
| 트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)-1-트리클로로실란 | 시그마-알드리치 | 448931 | |
| PDMS 및 경화제 | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| 에탄올 | J T 베이커 | ||
| FE-SEM | FEI | 노바 나노SEM | |
| X선 광전자 분광법 | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D 모델링 기계 | M& I CNC Lab, 한국 | CNC 밀링 머신 | |
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| 양면 접착 테이프 | FLEXcon, 미국 | DFM 200 클리어 150 POLY H-9 V-95 | |
| 커팅 플로터 | Graphtec Corporation, 일본 | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| 스핀 코터 | MIDAS | SPIN-3000D | |
| 용광로 (하소) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| 레오미터 (택 테스트) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM 패키지 | |
| 산소 플라즈마 시스템 | FEMTO | CUTE | |
| 단클론 마우스 antihuman hsCRP | Hytest Ltd., 핀란드 | 4C28 | (클론 # C5) |
| 모노클로날 마우스 anti-cTnI | Hytest Ltd., 핀란드 | 4T21 | (클론 # 19C7) |
| HRP 활용 염소 polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP 복합 마우스 단클론 항-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (클론 # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| 소 알부민 | 시그마-알드리치 | A7906 | |
| PBS | Amresco | Inc E404 | |
| 혈액 수집 튜브 | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus 혈액 수집 튜브 |
| SuperSignal ELISA 펨토 | Invitrogen | 37074 | |
| 모듈식 다중 라벨 플레이트 리더 | Perkin Elmer Envision | 2104 | |
| 디스크 작동 기계 | Hanra Precision Eng. Co., Ltd., 한국 | 맞춤형 | |
| 광전자 증배관(PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | 버전 2012 | 디자인 소프트웨어 |
| SolidWorks 3D CAD 소프트웨어 | 솔리드웍스 | 버전 2013 | 3D 디자인 소프트웨어, |
| Edgecam | Vero 소프트웨어 | 버전 2009.01.06928 | 코드 생성 소프트웨어 |
| DeskCNC | Carken Co. | 버전 2.0.2.18 | CNC 밀링 머신 소프트웨어 |
참고문헌
- Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
- Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
- Yang-....
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