방법 논문

전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

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DOI:

10.3791/54143

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2016년 4월 16일

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1Department of Biomedical Engineering, School of Life Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), UNIST-gil 50, Ulsan, Republic of Korea, 2Agency for Defense Development (ADD), Daejeon, Republic of Korea, 3KOGAS (Korea Gas Corporation) Research Institute, 4Center for Soft and Living Matter, Institute for Basic Science (IBS)

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 30분 이내에 10μL의 전혈에서 단백질의 펨토 어금니 감지 감도를 달성하는 방법을 보여줍니다. 이는 랩온-어-디스크(lab-on-a-disc)에 통합된 전기방사 나노섬유질 매트를 사용하여 달성할 수 있으며, 이는 높은 표면적과 향상된 신호 대 잡음비를 위한 효과적인 혼합 및 세척을 제공합니다.

초록

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 생물학적 샘플에서 소량의 단백질을 검출할 수 있는 유망한 방법입니다. 시료량 및 분석 시간 단축을 위한 플랫폼과 완전 자동화를 제공하는 장치는 현장 진단에 잠재적으로 사용할 수 있도록 필요합니다. 최근에는 TiO2 나노섬유성(NF) 매트로 구성된 랩온-어디스크(lab-on-a-disc)를 활용하여 혈청 단백질, C-반응성 단백질(CRP) 및 심장 트로포닌 I(cTnI)의 초고감도 검출을 입증했습니다. 30분 안에 소량의 전혈에서 펨토 어금니(fM) 감지 감도로 넓은 동적 범위를 보여주었습니다. 이 장치는 혈액 분리, 계량, 혼합 및 세척을 위한 여러 구성 요소로 구성되어 있으며, 적은 시료 부피로 인한 감도 향상을 위해 자동화되어 있습니다. 여기, 비디오 데모에서 우리는 NF 및 디스크 제작, 통합 및 작동에 대한 실험 프로토콜과 노하우를 다음 순서로 보여줍니다 : TiO2 NF mat 준비 프로세스; TiO2 NF 매트를 디스크에 전사 인쇄; 면역 반응, 디스크 조립 및 작동을 위한 표면 개질; On-Disc 검출 및 면역 분석에 대한 대표 결과. 이 장치를 사용하면 샘플과 시약의 소비를 최소화하면서 다중화 분석이 가능합니다. 장점을 감안할 때, 이 장치는 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있어야 하며 부족한 단백질의 분석을 용이하게 하는 데 도움이 되는 것으로 입증되었습니다.

서론

질병 진단을위한 여러 플랫폼 1,2- 예컨대 나노 와이어, 나노 입자 (3), (4) 나노 튜브 (5)와 나노 파이버 (NFS) 6-8과 같은 나노 재료에 기초하여 개발되었다. 이 나노 물질은 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 매우 민감한 생물 검정을위한 새로운 기술의 디자인 적으로도 뛰어난 전망을 제공합니다. 예를 들어, 메조 포러스 산화 아연 나노 유방암 바이오 마커의 펨토 몰 민감한 검출을 위해 사용되었다. 구 최근 화학적 안정성을 고려하여 생체 시료 애플리케이션 10 탐구되었다 티탄 (TiO2), 이산화에 기초하여 나노 물질을 11 무시할 단백질 변성 12 및 또한 생체 적합성.도 13은 이산화 티탄의 표면에 수산기 화학적 변형 및 생체 분자의 공유 결합을 용이하게한다. 14,15 무늬 이산화 티탄 생N 막 16 이산화 티탄 (17) 표면적이 증가하여 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는 데에 이용 된 나노 튜브; 그러나, 제조 공정이 다소 복잡하고 값 비싼 장비를 필요로한다. 한편, 전기 방사 NFS가 간단하고 저렴한 제조 공정뿐만 아니라 그들의 높은 표면적 주목 받고; 18,19 아직 상기 전기 방사 이산화 티탄 NF 매트 취약한 느슨한 특성 다루기가 어렵고 미세 유체 장치와 통합 할 수 있습니다. 6,20을 따라서, 이산화 티탄 NF 매트는 거의, 생체 시료 응용 프로그램에서 거친 세척 조건을 필요로 특히 활용되지 않았다.

본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 접착제 층을 이용하여 임의의 피 처리 기판의 표면에 매트 NF는 전기 방사를 전송하는 새로운 기술을 개발 하였다. 작고에hermore, 우리는 성공적으로 폴리 카보네이트 (PC)로 이루어진 원심 미세 유체 소자로 전기 방사 티오 NF는 매트 (2)의 적분을 보여왔다. 이 장치를 사용하여, C 반응성 단백질의 민감한 높은 완전 자동화 된, 통합 검색 (CRP)뿐만 아니라 심장 트로포 닌 I (cTnI는)는 전체 혈액의 10 μL에서 30 분 이내에 달성 하였다. (21)로 인해 결합에 는 NFS와 원심 플랫폼의 특성의 장점은 분석은 검출 하한 100 ng를 / ㎖ (0.8 ~ PM) 1 pg / ml 인 (~ 8 FM)에서 크기의 여섯 주문의 넓은 동적 범위를 전시 CRP (37) PG / ㎖ (~ 오후 1시 5분)의 검출 한계 100ng의 / ㎖ (~ 4 ㎚) 10 pg / ml 인 (0.4 ~ PM)의 동적 범위의 0.8 pg / ml이다 (~ 6 FM)의 cTnI는합니다. 이러한 검출 한계는 300 ~되고, 20 배, 대응하는 종래의 ELISA 결과와 비교하여 낮은. 이 기술은 적절한 항체 모든 표적 단백질의 검출에 적용될 수있다. 전반적으로,이 장치 공동예를 들면, 전혈을 10 μl를 그것은 생물학적 샘플의 극소량에서조차 좋은 감도로 표적 단백질의 드문 양을 검출 할 수 있기 때문에 ULD은 체외 진단 및 생화학 적 분석에 크게 기여한다. 우리는이 연구에서 ELISA를 사용하여 혈청 단백질 검출을 증명하지만, 미세 유체 소자와 전기 방사의 NFS 전사 통합 기술은 더 광범위하게 높은 검출 감도를위한 큰 표면적을 필요로하는 다른 생화학 적 반응에 적용될 수있다.

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프로토콜

주 : 혈액 건강한 사람에서 도출하고, 혈액 수집 튜브에 수집 하였다. 서면 동의서는 모든 자원 봉사자들로부터 얻은 것입니다.

이산화 티탄 NF 매트 1. 제작

  1. 전구체 용액 (22)의 제조
    1. 에탄올 (99.9 %, 3 ml) 및 빙초산 (3 mL)을 혼합하여 티타늄 테트라 이소 프로 폭 사이드 (TTIP) 1.5 g을 용해시키고, 자기 교반기에서 30 분 동안 RT에서의 수용액 (25 ° C)을 혼합한다.
    2. 에탄올 (99.9 %)의 3.64 g의 폴리 비닐 피 롤리 돈 (PVP)의 11 중량 %를 용해시키고, 핫 플레이트, 자기 교반기를 사용하여 1 시간 동안 65 ° C에서 상기 용액을 교반한다.
    3. 결합 및 핫 플레이트 자석 교반기 4 시간 동안 65 ° C에서 두 솔루션을 저어.
  2. 전기 방사
    1. 200 μm의 내측 diame의 스테인리스 바늘에 연결된 주사기로 제조 된 용액을로드터. 플런저를 제거한 후, 주사기에 직접 용액을 붓는다.
    2. 높은 DC 전압 (15 kV로)에 접지 된 기판 상에 배치 된 실리콘 웨이퍼 상에 10 분 동안 0.3 ml / hr의 유량 (2cm X 2cm)에 항상 용액을 소개한다. 전기 방사 중에 니들 10cm에 접지 기판 사이의 거리를 설정한다.
  3. NF 개의 매트의 하소
    1. 노에서 NF 매트를 놓고 고진공 조건 (5 × 10-5 토르)하에 3 ℃ / 분으로 램핑 속도로 500 ℃까지 온도를 증가시킨다.
    2. 3 시간 동안 500 ° C의 온도를 유지한다. 노의 RT (25 °의 C)로 샘플의 온도를 냉각.

원심 미세 유체 디스크에 티오 2. 통합이 NF 매트

  1. 디스크의 제조
    1. 3 차원 설계 소프트웨어 (예를 들면, 솔을 사용하여idWorks 또는) 유사한 디스크의 각 층의 챔버, 채널 또는 밸브를 묘사한다. 코드 생성 소프트웨어 (예를 들어, Edgecam 또는 유사)를 사용하여 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 코드 설계 파일을 변환합니다. 상기 명령에 따라 소프트웨어를 사용 설명서 23,24 참고.이 장치에 사용되는 일반적인 채널 치수 X 0.3 mm (폭 X 깊이) 1.0 mm이다.
    2. (CNC 밀링 머신의 운영 소프트웨어를 열고 예., DeskCNC 또는 이와 유사한 것) 및 운영 소프트웨어 CNC 코드를로드하고 순서대로 다음을 클릭합니다 : "AUTO"-> "G CODE OPEN을"-> 생성 된 CNC 코드를 선택합니다.
    3. CNC에 밀링 머신의 PC 판을 부착 : 디스크 층에 대한 상위 계층과 5mm의 PC 판을위한 1mm의 PC 판을 사용합니다. "시작"버튼을 클릭하여 디스크의 각 층을 절단하는 CNC 밀링 머신을 실행합니다.
  2. 디스크 상에 이산화 티탄 NF 매트의 전송
    1. 실리콘 기판 40 μL (트리 데카 -1,1,2,2- tetrahydrooctyl)에서 30 분 동안 진공 하에서 진공 챔버 -1- 트리클로로 실란을 함유하는 작은 페트리 접시를 놓는다. 플루오로 실란이 증발하여 기판에 도포 얻는다.
    2. 진공 챔버에서 탈기 한 비율 10 : 경화제로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 예비 중합체를 혼합한다. 스핀 코트를 60 초 동안 650 rpm으로 실리콘 기판 상에 PDMS.
    3. 10 분 점착성 상태를 달성하기 위해 65 ° C의 오븐에서 실리콘 기판 상에 코팅 된 PDMS 큐어.
      주 : 경화 시간은 환경 조건에 따라 변화 될 수 있고, 접착력은 레오 미터를 사용하여 점착성 시험에 의해 시험 될 수있다.
    4. 트위터를 사용하여 PDMS 코팅 된 실리콘에 전기 방사 및 소성에 의해 제조 된 이산화 티탄 NF 매트를 전송합니다. 그런 다음, 수동 (유리 슬라이드, 예.) 평면 객체에 전송 된 이산화 티탄 NF 매트에 균일 한 압력을 적용하고 개체를 제거합니다. 놓다4 시간 동안 65 ℃에서 또는 1 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 샘플이 완전히 PDMS 층을 경화한다.
    5. 20 μL를 PDMS / 경화제 혼합물과 디스크에 코트 결합 반응 챔버 (10 : 1), 접착제 층 역할을하는 디스크에 이산화 티탄 NF 매트를 부착합니다.
    6. PDMS의 층에 이산화 티탄 NF 매트에 에탄올 (99.9 %)의 50 μL를 분배 6 mm 직경의 펀치 구멍과 NF 매트를 절단하고, 20 μL로 코팅 된 결합 반응 챔버 이산화 티탄 NF 매트를 절단 전송 이전 단계에서 PDMS의.
      참고 :이 단계에서, 에탄올 Si 기판에서 절단 이산화 티탄 NF 매트를 분리하는 데 도움이 될 것입니다.
    7. 1 시간 완전 경화 PDMS를 4 시간 동안 80 ° C에서 65 ° C의 오븐에서 이산화 티탄 NF 매트 내장형 디스크 부화.
  3. 디스크상의 이산화 티탄 NF 매트의 표면 개질
    1. 피에탄올 (3- 글리시 독시) methyldiethoxy 실란 (GPDES)의 repare 1 % v / V를 용액 (99.9 %).
    2. 140 W, 180 초 동안 50 sccm의 산소 흐름에 산소 플라즈마와 이산화 티탄 NF 매트 통합 된 디스크를 취급합니다. 각각의 나노 섬유 매트에 GPDES 용액 100 μl를 분배하고 2 시간 동안 RT (25 °에 C)에 품어.
    3. 세척 병을 사용하여 에탄올 (99.9 %)을 분배하여 기판 간단히 세척 한 후 디스크를 반전하고 깨끗한 대해 그것을 닦아 블로 팅에 의해 완전히 에탄올을 제거합니다. 1 시간 동안 80 ℃에서 경화. 상술 한 바와 같이 물리적으로 흡착 바운드 GPDES 분자를 제거하고, 동일한 방식으로 에탄올 (99.9 %)로 두 번 세척 하였다.
    4. 건식 진공 상태에서, 질소 기류로 바람을 불어 건조.
      주 : 디스크를 사용할 때까지 실온 (25 ℃)에서 밀폐 용기에 저장 될 수있다.
  4. 표면에 항체의 고정화
    1. 포획 항체 200 μg의 / ㎖의 용액 (마우스 모노클로 날 항 만들기인간 hsCRP 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) 완충액 (pH 7.4)로 항체를 희석하여 단일 클론 마우스 항 cTnI는). 마이크로 피펫을 사용하여 디스크의 각 NF 매트 상 용액 5 μL를 분배. 항체에 대한 자세한 내용은 자료의 목록을 참조하십시오.
    2. 가습 실에서 디스크를 유지하고 4 시간 동안 37 ° C에서 품어. 0.1 % BSA-PBS 버퍼와 NF 매트 코팅 된 항체를 씻으십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 세척 완충액 100 ㎕와 챔버를 채우기, 흡입 또는 경사에 의해 버퍼를 제거합니다. 마지막으로, 디스크를 반전하고 깨끗한 닦아에 대해 그것을 가릴 다음 디스크를 조립한다.
  5. 디스크 어셈블리
    1. 캐드 프로그램 (예 AutoCAD의 또는 유사한)를 사용하여 양면 접착 테이프, 디스크의 디자인을 그린다. 커팅 플로터에 CAD 설계를 넣습니다.
    2. 커팅 플로터를 사용하여 양면 접착 테이프를 잘라. 이중 접착 테이프의 한 보호 층을 벗겨과 내가 첨부디스크 층의 상단에 t. 다른 보호 층을 벗겨 디스크 상에 상부 층을 연결합니다.
    3. 프레스 기계에 미리 조립 된 디스크를로드하고 정확하게 각 밸브, 채널 및 챔버를 연결하는 각 층에 정렬 마크를 사용하여 상단 / 접착제 / 디스크 층을 맞 춥니 다. 프레스 기계를 사용하여 균일 한 압력을 적용합니다.

3. 면역

  1. 마이크로 피펫을 이용하여 1 % BSA-PBS 완충액 챔버를 채우고, 1 시간 동안 37 ° C에서 디스크를 배양한다. 마이크로 피펫을 사용하여 흡인하여 버퍼를 제거합니다. 미 반응 사이트를 차단하고, 디스크에 단백질의 비특이적 흡착을 감소시키기 위해이 단계를 수행한다.
  2. 충전 및 마이크로 피펫을 사용하여 실을 흡입하여 0.1 % BSA-PBS로 두 번 세척 하였다.
    참고 :이 단계에서 디스크를 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. micropipett을 사용하여 디스크에 CRP 검출을위한 항원 아군 전체 혈액 또는 CRP 무 혈청로드 10 μL이자형. 교정 그래프를 만들기 위해, 100ng의 / ㎖ 1 pg / ml이다에서 CRP 농도를 사용한다; cTnI는 10 pg / ml 인 내지 100 ng / ml이되게 준비 하였다.
    참고 μM의 범위이다 전혈에서 CRP의 높은 수준으로 인해 CRP 무 혈청 장치의 낮은 검출 한계를 보여주기 위해 사용되었다.
  4. 적혈구를 분리하는 60 초 동안 3600 RPM (XG 391)에서 디스크를 스핀.
  5. 개방 밸브 레이저 조사에 의해 1 번, 그리고 전사 3 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 HRP가 결합 된 항체를 검출 8 μL를 포함하는 챔버에 뜨는 플라즈마 4 μL.
    주 :. 밸브 활성화 및 디스크 동작의 시각화를위한 일반적인 프로세스는 이전의 보고서에 상세히 설명 21
  6. 단백질 검출 항체의 결합을 5 초 동안 혼합 모드 (15 Hz에서의 -1, 15 °)를 적용합니다.
  7. 오픈 밸브 # 2, 결합 반응 챔버 6 단계에서 제조 된 혼합물을 트랜스퍼 (2,400 RPM3 초). 이어서, 혼합물을 이산화 티탄 연맹에 결합하는 항체 사이의 면역 반응을 달성하기 위해 20 분 동안 혼합 모드 (60 Hz에서의 -1,2- °)을 적용한다. 상기 반응 개방 밸브 # 3 후 폐 챔버 (2400 RPM, 10 초)에 잔류 혼합물을 옮긴다.
  8. 밸브 # 4를 열고 디스크 (2400 rpm으로 4 초)을 회전시켜 결합 반응 챔버의 세정 완충액 (600 μL)를 옮긴다. 이어서 챔버 내의 이산화 티탄 연맹 씻어 120 초 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 -1, 30 °)를 적용한다.
  9. 단계 3.8의 동일한 조건에 따라 두 번 더 이산화 티탄 연맹을 세척하고, 20 초 동안 2,400 rpm에서 디스크를 회전시켜 완전히 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. 그리고, 밸브 # 5를 닫는다.
  10. 화학 발광 반응을위한 밸브 # 6 및 방사를 개방함으로써 결합 반응 챔버에 화학 발광 기질 용액을 전송 한 후 1 분 동안 혼합 모드 (30 Hz에서의 -1,2- °)를 적용이후 10 초 동안 2,400 rpm에서 디스크.
  11. 밸브를 개방 # 7, 10 초 동안 2400 rpm으로 디스크를 회전시켜 상기 검출 챔버로 반응 기질 용액을 전송.
  12. 광전자 증 배관 (PMT) 모듈을 갖춘 검출 시스템을 사용하여 반응 기질 용액에서 화학 발광 신호를 측정한다.
    주 : 스텝 모터, 현미경 성분 변환 단계, 및 상업적으로 입수 한 PMT : 검출 계는 다음과 같은 부품을 사용하여 맞춤형 기계이다. 현미경 부품, 스텝 모터 장치를 유지하도록 조립되고, 모터는 디스크를 회전시킬 수있다. 검출은 현미경 부에 고정 된 PMT에 의해 수행되고, 이는 상기 장치의 검출 챔버 위에 배치된다. 스텝 모터를 조작함으로써, 검출 챔버 바로 PMT의 검출 영역 아래에 정렬된다.

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결과

이 프로토콜, 높은 감도를 제조 하였다으로 전체 혈액에서 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치를 사용. 이산화 티탄 NF 매트는 전기 방사 및 소성 공정에 의해 제조 하였다. 이러한 유량, 전압 및 회전 시간 등의 조건을 전기 방사 원하는 직경, 형태 및 두께는 NFS를 제조하기 위해 최적화되었다. 조건이 최적화되지 않은 경우는 NFS 형성의 질이 저하되었다. 특히 연맹은 낮은 전압 (kV의 5)의 고분자 용액으로부터 방사되지하였고, 전압이 높을 때 (> 20 kV로)을 세분화 하였다. 마찬가지로, 회전 시간은 적절한 밀도, 너무 희소하지 (1 분) 또는 너무 조밀 한 (30 분)와 연맹의 제조에 중요했다. 또한, 높은 유속에 의한 비드의 형성을 방지하기 위해 유속을 조작 하였다. 그래서, 1-15 kV의인가 전압의 10 분 전기 방사 시간 및 0.3 ml의 용 hr의 유량 -1 형태 얻어진 연맹의 두께

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토론

이산화 티탄 NF 통합 된 디스크에 대한 분석은 혈액의 매우 낮은 볼륨에 존재하는 낮은 풍부한 단백질의 고감도 검출을위한 신속하고 저렴하고 편리한 기술이다. 이 기술은 적은 양의 샘플 (10 μL)를 사용하는 장점을 가지며, 동시에 다수의 샘플 분석을위한 의무이다. 이것은 다중 면역 장치로서 큰 잠재력을 제공한다. 상기 장치는 통상적 인 ELISA를에 필요한 혈장 분리, 같은 시료의 전처리 단계를 필요로하지 않는 추가적인 이점을 갖는다. 또한, 상기 장치로 인해 미리 설계된 챔버, 채널, 밸브 전체 면역 절차 (예를 들면, 혼합, 세척, 결합 등)을 자동으로 수행 할 수있다. 접착제를 사용하는 대신 제분 수동 조립 또한 상용화 디스크의 제조 방법을 이용하여 (예를 들어, 사출 성형, UV / 초음파 / 열 접착) 분석 디바이스의 제조의 전체 공정은 수 있습니다자동화.

또한, 여기에 제시된 전사 인쇄 방법은, 얇은 접착제 PD...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 한국 연구 재단 (NRF) 보조금 (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), 한국 정부에 의해 투자 한국의 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (A121994)와 IBS-R020-D1의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Si 웨이퍼LG SILTRON광택 웨이퍼, 테스트 등급직경 (mm) = 150, 방향 = < 100>, 도펀트 = 붕소, RES(옴-cm) = 1 - 30, 두께(μ m) = 650 - 700
폴리카보네이트(PC) 대동 플라스틱PCS#6900두께(mm) = 1 및 5 
티타늄 테트라이소프로폭사이드, 98%,시그마-알드리치205273
폴리비닐피롤리돈, Mw = 1,300,000시그마-알드리치437190
아세트산시그마-알드리치320099
무수 에탄올시그마-알드리치459836
트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸)-1-트리클로로실란시그마-알드리치448931
PDMS 및 경화제Dow CorningSYLGARD 184
GPDESGelest IncSIG5832.0 
에탄올J T 베이커
FE-SEMFEI노바 나노SEM
X선 광전자 분광법ThermoFisherK-alpha
3D 모델링 기계M& I CNC Lab, 한국CNC 밀링 머신
왁스 디스펜싱 기계한라정밀 엔지니어링 (주), 한국맞춤형
양면 접착 테이프FLEXcon, 미국DFM 200 클리어 150 POLY H-9 V-95
커팅 플로터Graphtec Corporation, 일본Graphtec CE3000-60 MK2
스핀 코터MIDASSPIN-3000D
용광로 (하소)R. D. WEBB COMPANYWEBB 99
레오미터 (택 테스트)Thermo ScientificHaake MARS  III - ORM 패키지
산소 플라즈마 시스템FEMTOCUTE
단클론 마우스 antihuman hsCRPHytest Ltd., 핀란드4C28(클론 # C5)
모노클로날 마우스 anti-cTnIHytest Ltd., 핀란드4T21(클론 # 19C7)
HRP 활용 염소 polyclonal anti-hsCRPAbcam plc., MAab19175
HRP 복합 마우스 단클론 항-cTnIAbcam plc., MAab24460(클론 # 16A11)
hsCRPAbcam plc., MAab111647
cTnIFitzgerald, MA30-AT43
소 알부민시그마-알드리치A7906
PBSAmrescoInc E404
혈액 수집 튜브BD vacutainer367844K2 EDTA 7.2 mg plus 혈액
수집 튜브
SuperSignal ELISA 펨토Invitrogen37074
모듈식 다중 라벨 플레이트 리더Perkin Elmer Envision2104
디스크 작동 기계Hanra Precision Eng. Co., Ltd., 한국맞춤형
광전자 증배관(PMT)Hamamatsu PhotonicsH1189-210
AutoCADAutoDesk버전 2012디자인 소프트웨어
SolidWorks 3D CAD 소프트웨어 솔리드웍스버전 20133D 디자인 소프트웨어,
EdgecamVero 소프트웨어버전 2009.01.06928코드 생성 소프트웨어
DeskCNCCarken Co.버전 2.0.2.18CNC 밀링 머신 소프트웨어

참고문헌

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