박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

요약

바이러스에 감염된 HeLa 세포 단층의 부착을 위한 왕국 간 연관성 및 경쟁(박테리아 및 진균)을 결정하기 위한 방법이 본원에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 원핵생물, 진핵생물 및 바이러스의 여러 조합으로 확장될 수 있습니다.

초록

곰팡이, 박테리아와 바이러스를 포함 분류학 왕국에서 polymicrobial 상호 작용의 연구는 이전에 마이크로 바이 옴의 바이러스 성 회원이 바이러스에 감염된 숙주 세포와 후속 미생물의 상호 작용에 미치는 영향에 대해 조사되지 않았다. 세균 및 진균과 바이러스의 공동 주거 구강 및 생식기의 점막 표면에 주로 존재한다. 점막 세포, 지속적인 만성 또는 지속적인 잠재 바이러스 감염 특히이 표현 수용체의 상당수에서 바이러스 변경을 통해 마이크로 바이 옴의 구성원에 미치는 영향과 유형을 가질 수있다. 숙주 세포의 막 구조의 변형이 바이오 필름의 형성, 즉 부착하는 첫 번째 단계를 개시하기 위해 상주하고 기회 병원균 후속 부재 변형 기능을 초래할 것이다. 이 연구는 biofil의 시작에 HSV의 효과의 정량 및 육안 검사하는 방법을 설명합니다S. m의 형성 (부착) 구균 및 C. 알비 칸스.

서론

인간 마이크로 바이 옴 몸에 지리적 영역을 공유하는 여러 분류 학적 왕국에서 다양한 생물이 포함되어 있습니다. 세포 표면에 준수는 마이크로 바이 옴의 식민지화 과정의 일부입니다 생물막 형성에 필수적인 첫 번째 단계입니다. 마이크로 바이 옴에 포함 된 만성 및 지속적인 감염의 원인 바이러스가 될 수 있습니다. 이 바이러스에 의한 만성 세포 감염이 추정되는 수용체의 가용성에 변화를 일으킬 수 있습니다. 또한 ^{1, 2,} 세포 내 병원균에 의한 세포 항목도 차례로 박테리아와 곰팡이를 포함한 다른 마이크로 바이 옴 회원의 첨부 파일을 변경할 수 있습니다 호스트 막 유동성 / 소수성에 영향을 미칠 수 . 인간 숙주의 동일한 지리적 영역에서 - 지역화 공동이 여러 병원체 사이에서 발생할 수있는 상호 작용을 이해하기 위해, 우리는 점막 표면에 존재하는 분류학 왕국의 스펙트럼을 나타내는 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있어야한다.

t ">는 헤르페스는 마이크로 바이 옴의 상임 이사국으로 인간의 100 %에 존재하는 미생물의 가족은 ^3,4. 또한 그들은 또한 지속적으로 증상의 유무에 모두 흘려 될 수있다. 특히, 단순 포진 바이러스 1 및 단순 헤르페스 바이러스 -2 (HSV-1, HSV-2, 각각)는 oronasopharynx 및 생식기의 마이크로....

프로토콜

1. HSV 균주 및 취급

참고 : 재조합 비 확산 HSV-1 (KOS) gL86과 HSV-2 (KOS) 333gJ을 ^- V. Twiari ^{(36, 37)에} 의해 제공되었다 사용되는 베타 - 갈 락토시다 아제 리포터 활동.

1. 1에서 -80 ° C에서 단일 많이 매장에서 바이러스를 사용하여 둘 베코의 변형 이글의 중간 20 % 소 태아 혈청 (FBS)와 (DMEM)의 1의 비율로 사용 할 때까지 우유를 탈지. 바이러스 많이 저장하기 전에 입출력 -nitrophenyl-β-D-갈 락토 (ONPG) 및 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 β-D-갈 락토 (X-GAL) 분석으로 바이러스의 농도를 결정한다.
2. 이전에 (그림 1) ¹⁴ 설명한 바와 같이, 기자 바이러스 항목 분석을 사용하여 각 실험 분석 실행을 위해 X-걸 염색에 의한 바이러스의 생존과 감염 (MOI)의 다양성을 결정합니다.
3. 원하는 MOI로 바이러스 (수신 거부 MEM)을 희석. 단일 층 (파라 포름 알데히드를 0.5 ㎖ / 웰) 수정 염색 전합니다. 별도의 microti에서 바이러스의 생존 컨트롤을 배치polymicrobial 분석 플레이트와 병렬 터 플....

결과

이 보고서에 설명 된 시스템에서 얻을 수있는 데이터의 안정성의 수준은 그림 2 AF ^(38)에 표시됩니다. 이 시스템의 사용을 통해 바이러스로 감염된 세포와의 상호 접착에 미치는 효과 포도상 진균 작용의 조절을 묘사 할 수있다. polymicrobial 상호 작용은 동일한 세포에서 발생되는지 여부를 결정하기 위해도 3 및도 4에 도시 된 바와 같이 ³⁸ 연구 이러한 유형의 상호 작용에 대한 현미경 검사를 필요로한다. 본 연구에서는 차등 세포 상호 작용은 특정 바이러스 종이다 포도상 진균 순응도 HSV 변조의 결과로서 관찰된다.

황색 포도상 구균 및 C. 동일한 HSV-헬라 비감염 대조군 세포에 부착 .......

토론

현재 어떤 정보는 원핵 생물 진핵 세포 및 바이러스 성 즉, 다수의 분류 학적 영역을, 교차 호스트 마이크로 바이 옴의 준 상임 이사국에 영구적 인 사이의 복잡한 상호 작용에 사용할 수 없습니다. 그러므로 우리는 S.으로 생물막 개시를 연구하기 위해 체외 모델 시스템에서 새로운 개발 구균 및 C. HSV-1 또는 HSV-2에 알비 칸스는 헬라 229 (헬라) 세포 ^(38)을 감염 시켰습니다. 헬라 세포 모델 시스템은 고유 한 장점을 제공한다. 이것은 두 S.위한 수용체로서 작용 표면 피브로넥틴 발현의 부족에 기인 구균 및 C. 알비 칸스 ^39-41. 점막 상피의 정점 ⁽⁴²⁾ 표면은 일반적으로 더 밀접하게 자연 감염과 식민지 ^43-47에서 관찰 모방을 피브로넥틴,이 시스템이 부족하기 때문이다.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C.albicans
BBL Sabouraud 포도당	BD	211584
진균 한천	도트 사이언티픽	7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agary	Troy Biologicals	7143B
양 혈액 한천	Troy Biologicals	221239
Hela cells
1x DMEM (Dubelcco의 변형 된 독수리 배지, 4.5g / L 포도당 및 L- 글루타민, 피루브 나트륨 없음	Corning	10-017-CM
Gentamicin 50 mg / ml	Sigma	1397	50 µ 전체 DMEM
트립신 EDTA(0.05% 트립신, 0.53M EDTA) 용액 1x	Corning	25-052-CI
소 태아 혈청	Atlanta Biologicals	S11150	내 10% 최종 농도 전체 DMEM
strong>기타 배지 및 시약
ONPG	Thermo Scientific	34055
초순수 X gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)	Corning	20-021-CV
1x PBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA Lysis	Life Technologies	89901
Staining
Methanol	Fisher Scientific	A433P-4
HSV 1& 2, gD	ViroStat	196
DAPI	SIGMA	D8417-5MG
그램 크리스탈 바이올렛	트로이 생물학적 제제	212527
Supplies
Petri dish 100 x 15	Dot Scientific	229693
페트리 접시 150 x 15	Kord Valmark	2902
96웰 플레이트	Evergreen Scientific	222-8030-01F
24웰 플레이트	Evergreen Scientific	222-8044-01F
배양 튜브 100 x 13	Thomas Scientific	9187L61
커버 슬립 서클, 12mm	Deckg레이저	CB00120RA1

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