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방법 논문

연속 IV 주입은 뇌졸중 유발 뇌 부종을 연구하는 마우스에 아르기닌 - 바소프레신​​ 수용체 차단 코니 밥탄의 선택 처리 경로입니다

8.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54170

⸱

2016년 9월 1일

 ,  , 
1Neurotrauma Research, Swedish Medical Center, 2Neurosurgery, Colorado Brain and Spine Institute

이 논문에서

요약

본 연구는 코니밥탄의 유익한 효과가 생쥐의 실험적 뇌졸중 후 분만 방법에 따라 달라진다는 것을 밝혔습니다. 우리는 마우스의 뇌졸중 유발 뇌부종 형성에 IV 카테터를 통해 수용체 차단제를 전달하기 위한 연구 프로토콜을 개발했습니다.

초록

스트로크는 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 뇌졸중은 뇌의 부종 및 기타 병태 생리 학적 사건에 의해 복잡하다. 스트로크 유발 뇌부종의 개발 및 전개에있어 가장 중요한 선수 중 호르몬 아르기닌 - 바소프레신​​과 수용체 졸론 및 V2이다. 최근 졸론 및 V2 수용체 차단제 코니 밥탄 뇌졸중 후 뇌 부종을 감소시키는 잠재적 인 약물로서 주목 받고있다. 그러나 행정 연구 코니 밥탄 응용 프로그램을 포함하는 동물 모델은 관리 가능한 노선에 따라 수정 될 필요가있다. 여기에 48 시간 연속 정맥 주사 (IV)의 결과는 쥐 실험 뇌졸중 후 복강 내 (IP) 코니 밥탄 치료와 비교된다. 우리는 중간 대뇌 동맥 폐색이 코니 밥탄 (0.2 mg)의 IV 또는 비히클의 치료 경정맥에 카테터를 설치하여 결합시킨 프로토콜을 개발했다. 동물의 다른 동료는 0.2로 처리 하였다매일 코니 밥탄 또는 차량 IP mg의 덩어리. 실험 스트로크 유발 뇌부종 연속 IV 및 IP 치료 후 마우스에서 평가 하였다. 결과의 비교 코니 밥탄의 연속 IV 정부는 코니 밥탄의 IP 관리는 달리, 마우스의 후 허혈성 뇌 부종을 완화 것으로 나타났습니다. 우리의 모델은 뇌졸중 및 뇌 부종의 컨텍스트에서 애플리케이션 코니 밥탄의 앞으로의 연구에 사용될 수 있다는 결론.

서론

뇌졸중은 환자와 임상의에게 계속해서 엄청난 부담이 되고 있습니다. 동물 뇌졸중 모델은 거의 20년 동안 실험실 환경에서 사용되어 왔습니다. 1 그럼에도 불구하고, 동물에게 효과가 있는 실험적 치료법은 종종 인간에게는 실패한다. 2 이러한 치료 결과의 불일치는 동물 연구에 사용되는 약물의 투여 경로, 약물 대사 및 제거율 및 기타 여러 측면과 같은 다양한 요인에 기인할 수 있습니다. 뇌졸중의 주요 합병증 중 하나인 뇌부종은 현재 신경과학 연구의 초점입니다. 뇌부종 형성 기전은 허혈성 뇌 손상에 대한 아르기닌-바소프레신(AVP) 반응에 의해 유발되는 수분과 전해질 균형의 장애를 포함합니다. 3 그러므로, AVP와 그 수용체(V1a 및 V2)는 허혈 후 뇌부종 형성에 대한 연구의 주요 초점입니다. 3

우리는 생쥐의 허혈후 뇌부종에 대한 혼합 아르기닌-바소프레신(V1a 및 V2) 수용체 차단제 코니밥탄의 효과를 연구하기 위한 방법론을 개발했습니다. 4 코니밥탄5의 분자 표적은 이 약물을 뇌부종 완화에 대한 특성 탐색에 적합한 후보로 만듭니다. 또한, 코니밥탄은 뇌졸중의 병태생리학적 사건의 맥락에서 연구될 필요가 있다. 6 본 연구를 설계할 때, 우리는 코니밥탄에 대한 두 가지 다른 투여 경로, 즉 정맥 주사(IV)4와 복강내(IP)를 사용하여 치료 결과를 비교하는 것을 고려했다. 7 뇌졸중 유발 뇌부종에 대한 치료의 효과를 평가했다. 여기에서는 중대뇌동맥 폐색(MCAO)에 의한 실험적 뇌졸중의 외과적 유도에 대한 자세한 프로토콜과 경정맥 IV 카테터 설치를 사용한 지속적인 코니밥탄 치료에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 뇌졸중 유도 후, 동물을 다음 그룹에 무작위로 할당했습니다: 비히클 또는 코니밥탄(0.2mg/일) 치료된 IV 또는 IP.

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프로토콜

실험 연구의 관심과 동물의 사용을위한 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 지침에 따라 수행되었으며 스웨덴 의료 센터 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 절차는 적절한 무균 기술을 사용하여 수행 하였다. 연구에 활용 실험 동물은 25 ~ 27g에 체중와 야생형 C57 마우스, 3 개월, 남성이었다.

생체 스트로크 유도 1.

  1. 프리 코트 전에 수술에 치과 수지와 필라멘트.
    1. 7-0 나일론 봉합사에서 필라멘트의 12mm 긴 조각을 잘라. 경화제 1 부분과 수지의 2 부를 혼합 한 후 즉시 1/3 전체 길이를 덮도록 혼합물에 필라멘트의 팁을 담근다. 신속하게 제거하고이 치과 수지의 부드러운 표면 코팅으로 덮여 있는지 확인합니다.
    2. 공기는 사용하기 전에 2 시간 동안 필라멘트를 건조.
  2. 에 마우스를 놓고N 마취 유도 챔버 (2 L 부피), 및 2 L / 분으로 챔버에 들어가는 25 %의 산소가 풍부한 실내 공기 중의 1.5 % 이소 플루 란의 흐름을 설정한다.
  3. 꼬리 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 결정 완전히 팔을 마취 할 때까지 마우스가 유도 챔버에 남아있을 수 있습니다.
  4. 가열 패드 수술대 위에 마우스를 놓고 코 콘을 통해 자발적으로 전달 마취의 유지 보수를 위해 1 %의 이소 플루 란 농도를 설정합니다.
  5. 전면과 목 뒤쪽에 머리를 클립하고, 소독 용 알코올로 목 스프레이. 두 눈에 수의학 안과 연고를 적용합니다.
  6. 연속적으로 체온을 모니터링하기 위해 수술 중 디지털 디스플레이에 접속 된 직장 온도 프로브를 사용한다.
  7. , 누운 위치에 마우스를 놓고 소독 용 포비돈 - 요오드 10 % 스크럽 솔루션을 적용, 멸균 드레이프로 커버 한 다음 크기 (10) 수술 메스 블레이드와 목을 따라 중간 선 절개를합니다.
    8. <리> 임시 6.0 실크 봉합사와 왼쪽 경동맥 (CCA)을 결찰.
  8. 왼쪽 외부 경동맥 (ECA)의 다른 넥타이를 놓습니다.
  9. 내부 경동맥 (ICA)의 미세 혈관 클립을 배치합니다.
  10. 미세 혈관 가위로 외부 경동맥에 작은 구멍을 잘라. 클립을 제거하는 동안 저항합니다 (CCA의 분기 지점에서 약 5-7mm)를 느낄 때까지의 ECA의 구멍에 치과 수지로 코팅 7-0 나일론 봉합사로 만든 필라멘트를 삽입하고 cephalically를 진행합니다.
  11. 위치에 필라멘트를 확보하기 위해 내부 경동맥 상에 임시 넥타이를 놓습니다. 그림, 그림 (1A)를 참조하십시오. 실크 봉합사로 피부를 닫고, 단계 260에서와 같이, 0.5 % 부피 바카 0.2 ml의 목의 전면에 상처 침투.
  12. 마우스가 60 분 동안 복구 실에서 의식을 마취에서 각성과 회복 할 수 있습니다. 이 회복 될 때까지 무인 동물을 두지 마십시오충분한 의식은 흉골 드러 누움을 유지합니다.
  13. = 나머지 3에서 반대쪽하지만 정상적인 자세로 선회 0 = 정상 운동 기능, 몸통과 꼬리 리프트에 반대측 앞다리 1 = 굴곡, 2 반대측에 기대어 = 다음과 같이 신경 학적 결손 점수 (NDS)에 마우스를 테스트 나머지 4의 측면 = 더 자연 모터 활동. 4,9
    1. NDS를 테스트를 위해, 관찰 (2-3 분)에 대한 평평한 표면에 꼬리 곳으로 마우스를 올립니다. 대안 적으로, 상기 회수 실의 마우스를 관찰. 때문에 MCA의 부족 폐색에 낮은 실험 2보다 NDS을 전시 마우스를 제외합니다.
      참고 : 레이저 도플러 flowmetry 기술은 MCA 폐색을 확인하는 데 사용할 수 있습니다 9-11.
  14. 다시 마취 전술 한 바와 같이, 유도 챔버 회복 60 분 후 동물을 10 % 포비돈 - 요오드 용액 스크럽 이전 피부 절개 재 소독 및 상처 수술의 재개절단 및 실크 봉합사를 제거하여 목의 앞.
  15. ECA에서 필라멘트를 제거하려면 다음 단계를 수행합니다 :
    1. ICA에의 미세 혈관 클립을 배치합니다. ICA에의 봉합을 풀어 오픈 클립을 누른 상태에서 필라멘트를 잡아 당깁니다.
    2. 클립을 닫고 절단에 근위 ECA 상에 넥타이를 놓습니다.
    3. 클립을 제거하고 뇌 혈류를 복원 할 CCA에서 합자를 제거합니다. 그림, 그림 1B를 참조하십시오.

연속 48 시간의 처리를위한 경정맥에 IV 카테터의 2. 설치

참고 : 바로 마우스의 각성없이 단계 1.16.3 후 카테터의 설치를 진행합니다.

  1. 유연한 튜브의 두 개의 서로 다른 크기를 사용하여 내부 튜브 삽입 (, 내부 튜브의 보호를 위해 외부 직경 3.18 mm)를 외부 배관에 (외경 0.94 mm를 약물을 포함하도록 주입되는).
  2. 피는 경향이 위치에 마우스를 레이스 소독 용 10 % 포비돈 - 요오드 스크럽 솔루션을 적용하고, 크기 (10) 수술 메스 블레이드와 목의 뒷면에 1cm 절개를합니다. , 앙와위로 마우스를 켜고 10 % 포비돈 - 요오드 스크럽 솔루션과 목의 전면을 다시 살균, 목의 전면에 수술 상처를 다시 엽니 다. 터널 목의 전면에 뒷면에 만든 절개의 피부 아래 튜브, 오픈 상처 1cm에서 그것을 외면 화하다.
  3. 정중선 약 1cm 횡 목의 앞쪽의 좌측에서 피하 지방 조직을 제거한다. 좌측 경정맥을 찾습니다 5mm 간격 정맥을 따라이 관계를 배치하고 약간 정맥을 스트레칭. 미세 혈관 가위로 두 관계 사이의 경정맥에 작은 구멍을; (마음으로) 내부 튜브 5mm 깊이 꼬리 쪽의 끝을 삽입합니다.
  4. 경정맥에 모두 관계로 튜브를 고정합니다. 목의 전면에 피부를 닫습니다3-0 실크 봉합사. 그림, 그림 1C를 참조하십시오.
  5. 봉합와 목에의 뒷면에 피부에 튜브를 고정하고 회전을 통해 microinfusion의 IV 펌프에 튜브를 연결합니다. 스위블은 음식과 물에 대한 전체 액세스와 케이지 내부 마우스의 자유로운 이동을 허용한다.
  6. 전면에 피부 절개 수술 후 통증을 방지하기 위해 0.5 % 부피 바카 0.2 mL를 목뒤 침투.
    주 : 특정 기관, 동물 프로토콜에 따라 동물 오피오이드, 소염 진통제, 항생제 전후 동작 적으로 처리 될 수있다. 그러나, 언급 치료는 허혈성 뇌졸중의 결과의 결과를 변경할 수 있습니다 (토론 섹션 참조). 11 ~ 14
  7. 동물 실험의 종점까지 별도의 장에 동물을 회수 챔버에서 각성하고 수용하도록 허용한다. 이 흉골 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오드러 누움.
  8. 1.5 ㎖ / ㎏ / 시간, 4에서 연속 48 시간의 IV의 코니 밥탄의 치료 (5 % 포도당에서 0.14 ㎎ / ㎖) 또는 차량의 주입 속도를 설정하고 주입을 시작합니다.
    참고 : IV 주입 코니 밥탄의 총량​​은 1.44 ML의 총 부피의 약 0.2 밀리그램 / 마우스 / 일해야한다.
    주 : 1.44 ml의 5 % 포도당 0.2 mg의 총 양을 하루에 두 번 코니 밥탄의 복강 (IP) 주입을 수행합니다. IP 주입 앞서 설명한 구현한다. (15)는 몸체와 꼬리의 후방 표면의 피부를 파지하여 마우스 제지. 26 G / / 2 인치의 바늘을 사용하여 복부의 좌하 사분면에 코니 밥탄 또는 비히클을 주입한다. 15
  9. 실험 (48 시간)의 전체 지속 기간 동안 하루에 두 번 동물을 관찰한다. 동물들이 음식과 물에 대한 전체 액세스 권한을 허용합니다. 동물이 고통 또는 호흡 곤란의 증상이 나타나는 경우 수의사에게 문의하십시오. 안락사는 심각한 DIST에서 동물을 위해 필요한 경우RESS 아래의 단계 3.1를 참조하고, 연구에서 동물을 제외 할 수 있습니다.

엔드 포인트에서 뇌졸중 유발 뇌 부종 3. 평가

  1. 5 % 이소 플루 란과 오버 마취하여 마우스를 희생.
  2. 정중선을 따라 두개골 뼈 위에 피부 절개를하게 메스를 사용하여 뇌 위에 전체 두개골을 노출시키기 위해 피부를 철회. 난원 매그넘에서 시작, 측면 양쪽에있는 뇌의 둘레를 따라 두개골 뼈를 절단하고, 그 아래 뇌를 건드리지 않고 조심스럽게 들어 올립니다. 척추의 뇌와 두개골의베이스 상에 장착 된 신경 단절.
  3. 뇌를 제거 후각 망울과 소뇌에서 분리하고, 전술 한 바와 같이, 허혈성 및 비 허혈성 대뇌 반구에 반구 균열을 따라 뇌를 해부하다. (9)
  4. 습윤 건조 비교 비율 (WDR) -4,9- 이미 설명한 바와 같이하여 뇌 부종을 평가. 조직 무게전 오븐에서 100 ℃에서 3 일간 건조시킨 후. %의 H 2 O = 뇌의 수분 함량 (BWC) 계산 (1 건조 중량. / 습식 중량은.) × 100 %.

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결과

동물의 체온은 생리 학적 범위 내이고 스트로크 유도 수술을 통해 안정적. MCAO이 연구에서 제외 된 직후 2보다 낮은 NDS를 나타내 두 쥐.

쥐에서 MCAO은 48 시간에서 동측 반구에서 경색 볼륨을 생성합니다. TTC에 묻은 조각의 평가는 뇌 허혈성 뇌졸중의 발병이 심한 원인이 2009 년 10 Zeynalov, E. 및 도레, S., 공표 한 반구의 약 50 %, MCAO (그림 1D) 후 경색에 의해 영향을받는 것을 알 수 산소와 영양분이 뇌 조직의 박탈. 이 로컬 뇌 조직 저산소증의 결과로서, 뉴런 및 신경교 세포는 뇌의 경색 부분을 형성하는 다이.도 1d는 MCAO 유도 경색에 의해 영향을 대표 마우스 뇌 조각을 나타내고, 상처의 크기의 추정을 제공한다.

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토론

이 연구는 임상 뇌졸중 연구에 중요한 가치가있다. 이 연구는 쥐 실험 뇌졸중 후 코니 밥탄 (0.2 밀리그램 / 일)의 연속 IV 주입을 효율적으로 처리 48 시간 후 뇌부종을 감소 시킨다는 것을 알 수있다. 뇌부종에 코니 밥탄의 동일한 용량의 IP 주입의 효과도 조사 하였다. 모두 IV 및 IP 경로로 코니 밥탄 치료로 나타낸 바와 같이 마우스에 aquaresis을 생성합니다 약간 생리 학적 수준 위의 혈장 삼투압 1) 증가; 2)으로 인해 신장에서 물의 재 흡수의 차단에 소변 삼투압 감소. 따라서, 처리 결과에 기초하여, 우리는 IV 배송 방법은 뇌졸중 유발 부종 형성에 중요한 추가적인 유익한 효과가 있다고보고한다.

우리의 주요 결과는 IV 치료 코니 밥탄의 IP 경로보다 뇌 부종 완화에 더 나은 효과를 생산한다는 것이다. 임상 적으로 사용이 COR하는 코니 밥탄은 가능한 선택지 졸론 및 V2 수용체 길항제 인RECT 저 나트륨 혈증, 혈액 볼륨과 삼투압은. (1...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

우리는 자금 및 시설을 제공 스웨덴어 의료 센터 감사합니다. 우리는 또한 실험실 공간의 관대 한 사용을 위해 크레이그 병원 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
가열 패드K& H Manufacturing Inc1060
온도 모니터와 직장 프로브Physitemp7029
실크 봉합 스풀, 6-0Surgical Specialties CorporationSP114
실크 봉합사 바늘, 3-0Ethicon1684G
나일론 봉합사, 7-0Ethicon1696G
치과 레진 폴리실록산 경화제Heraeus Kulzer65817930
Microinfusion IV 펌프Kent ScietificGT0897
Swivel 22GAInstech375/22PS
실험실용 튜브, 0.94 mm x 0.51 mm다우코닝508-002
실험실용 튜브, 3.18 mm x 1.98 mm다우코닝508-009

참고문헌

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  20. O'Donnell, M. E., et al. Intravenous HOE-642 reduces brain edema and Na uptake in the rat permanent middle cerebral artery occlusion model of stroke: evidence for participation of the blood-brain barrier Na/H exchanger. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 225-234 (2013).
  21. Walcott, B. P., Kahle, K. T., Simard, J. M. Novel treatment targets for cerebral edema. Neurotherapeutics. 9, 65-72 (2012).
  22. Shen, Z., et al. Inhibition of G protein-coupled receptor 81 (GPR81) protects against ischemic brain injury. CNS Neurosci Ther. 21, 271-279 (2015).

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