방법 논문

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

DOI:

10.3791/54177

⸱

2016년 7월 15일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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우리는 DFAT 세포 생성을 위한 조건을 수정했으며 이러한 세포의 생산을 위한 개선된 성장 배지의 사용에 관한 정보를 여기에 제공합니다.

초록

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조직 공학 및 세포 치료는 임상 적으로 큰 약속을 잡으십시오. 이와 관련하여, 이러한 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)와 같은 다 능성 세포가 손상된 장기 기능을 복원하기 위해, 가까운 미래에, 치료 학적으로 이용 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중간 엽 줄기 세포의 증폭과 그 주변의 비 효율성을 분리하는 매우 침습적 등 여러 가지 기술적 인 문제는 현재 이러한 치료 양식의 잠재적 임상 사용을 방해. 여기서, 우리는 탈분화 지방 세포 (DFAT) MSC 유사 세포의 생성을위한 매우 효율적인 방법을 소개한다. 흥미롭게도, DFAT 세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 및 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화 될 수있다. 다른 그룹이 이전 성숙한 지방 조직에서 DFAT 세포를 생성하는 다양한 방법을 제시하였으나, 우리의 방법이보다 효율적으로 DFAT 세포를 생성 할 수있다. 이러한 관점에서, 우리는 보여 DFAT 배지 (DCM)는, 20 % FBS로 보충 된 것을20 % FBS 보충 된 DMEM보다 DFAT 세포를 생성하는데보다 효과적이다. 또한 우리의 세포 배양 방법에 의해 제조 DFAT 세포는 여러 조직 유형으로 재분화 될 수있다. 따라서, 조직의 탈분화의 연구를위한 매우 흥미롭고 유용한 모델이 제시된다.

서론

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세포 치료 및 조직 공학 재생 의학 1-5의 분야에서 뜨거운 주제이다. 이러한 치료 양식은 큰 약속을 보유하지만, 몇 가지 기술적 인 문제는 현재 임상 사용을 방해. 이와 관련하여, IPS 세포의 생성과 모든 조직 공학 요법은 환자의 안전성을 유지하기 위해 외부 유전자 transductions없는 세포를 생산한다. 따라서, 우리는 성공적 DFAT 인간 세포 (6)를 제조하는 첫 번째 그룹이었다. 다른 여러 연구 그룹은 이후 더 우리의 모델의 유용성을 강조, 포유 동물 기원 7-9의 DFAT 세포를 생성하는 우리의 방법을 채택하고있다.

여러 연구의 과정 동안, 우리는 세포 배양 환경의 품질이 셀 매체의 내용을 조정함으로써 수정 될 수 있음을 발견 하였다. 이 발견은 DFAT 셀 생산 성공률의 증가를 이끌고 셀의 품질을 개선하고있다; 모두 중요한 요인효율적으로 향후 임상 시험에 대한 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 이와 관련하여, 그리고 DFAT 셀 생성하는 방법 (유사한 매체 세포 재조합 인간 인슐린, 혈청 알부민, L- 글루탐산, 여러 지방산이 포함 매체 및 콜레스테롤 유래 간엽하는 DCM) 개선 DFAT 배지 및 확산 (DCM의 내용에 대한 자세한 정보는 요청시 사용 가능)을 개발했다. 사용 방법이 고품질 DFAT 세포는 지방 세포, 골 세포, 연골 세포 및 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 분화하는 능력을 생성 하였다. 요컨대,이 검증 세포 배양 프로토콜 DFAT 셀의 품질을 향상시켜 세포 치료 및 조직 공학의 임상 적용을 향상시키기위한 매우 유용 할 수있다.

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프로토콜

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인간의 피하 지방의 샘플은 성형 외과, 비뇨기과, 소아 외과 및 일본 대학 이타바 병원 (도쿄, 일본)의 정형 외과의 부서에서 수술을받은 환자에서 얻었다. 환자는 동의서를 작성 준, 의학의 일본 대학의 윤리위원회는 연구를 승인했다.

1. 조직 준비

  1. 실험실에 수술실에서 조직 샘플을 가져와.
  2. (-) 5 ml의 PBS로 세척 된 지방 조직의 1-2 g이어서 50 ㎖ 튜브에서 한번 실온 (RT)에서, 그리고 10cm의 플라스틱 접시에 시료를 배치했다.

2. 콜라게나 소화

  1. (-)를 PBS에서 샘플을 제거 멸균 0.1 % 10ml를 부가 한 다음 (/ w를 V) 조직 샘플을 함유하는 접시 콜라게나 제 용액 (콜라게나 제 II 형).
  2. 이 구성 퓌레에 도달 할 때까지 약 15 분 동안 수술 용 가위로 조직을 잘게ency.
  3. 이어서, 0.1 %의 다진 조직 진탕 기에서 교반과 함께 50 ㎖ 튜브에서 30 분 (60 RPM)에서 37 ° C에서 (w / v)의 콜라게나 제 용액을 소화.
  4. 50 ㎖의 튜브에 100 μm의 필터를 통해 샘플 분해 필터. 다음에, 필터를 통해 2 % FBS로 보충 된 10 ml의 DCM을 (자재 표 참조)를 통과한다.

3. 세포 분리

  1. 실온에서 1 분 동안 100 XG에서 필터링 된 세포를 원심 분리기.
  2. DCM는 50 ㎖ 튜브에서 2 % FBS로 보충 된이 시점에서, 5 ㎖를 준비한다.
  3. 다음으로, 1,000 μL 피펫을 사용하여 부동 지방 세포를 작성하고 50 ㎖ 튜브 함유 배지에 세포를 추가합니다.
  4. 그 후, 세포와 DCM 매체를 섞어 부드럽게 50 ML 튜브를 흔들.
  5. 그 후, 실온에서 1 분 동안 100 XG에서 튜브를 원심 분리.
  6. 18 G 바늘 및 20 ㎖ 주사기를 사용하여 튜브의 아래쪽 배지를 버리고.
  7. 다음으로, DCM의 10 ㎖를 추가수집 된 세포를 2 % FBS와 upplemented.
  8. 부드럽게 50 ML 튜브를 흔들어 세포와 DCM을 섞는다.
  9. 실온에서 1 분 동안 100 XG에 튜브를 원심 분리기.

4. 도금 세포

  1. 12.5 cm 플라스크에 20 % FBS와 보충 DCM 또는 DMEM의 41 ML을 추가합니다.
  2. 다음으로, 200 μL 피펫은 플라스크에 지방 세포의 40 μl를 추가하여.
  3. 그런 다음, 20 % FBS와 보충 DCM 또는 DMEM으로 술병을 입력합니다. CRITICAL STEP :이 시점에서, 세포는 배지에 걸쳐 확산되도록. 시각적으로 분리 된 세포를 확인하고 나중에 평면을 유지하기 위해 라운드 페트리 접시의 뚜껑에 플라스크를 유지합니다.
  4. 마지막 인큐베이터 안에 플라스크를 배치하고 7 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2 인큐베이터에서 흐트러 떠난다.
  5. 배양 일주일 후, 플라스크를 반전하고 DFAT 세포를 확인합니다. 이 시점 fibrobl에서부터 10 설명 된대로 다음, DFAT 세포 생성 능력을 평가AST와 같은 세포 (DFAT 세포)는 지방 세포에서 특정 영역에 있습니다.
  6. DCM 또는 DMEM 5 ㎖의 추가 이전의 세포 배양 배지를 제거한 다음, 플라스크에 20 % FBS가 보충. DFAT 세포 매체를 변경 한 후 다른 주 동안 성장하도록 허용합니다.
  7. 세포 계수기를 사용하여, 다양한 세포 배양 조건 (DMEM 대 DCM) 하에서 생성 DFAT 세포의 수를 계산.

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결과

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이 연구에서, DFAT 세포 생성을위한 방법 및 키트는 (도 1)을 개선 하였다. 우리의 방법은 우리 DCM 및 20 % FBS (도 2a)를 함유하는 DMEM 배지를 모두 사용 DFAT 세포를 생성 할 수있다. 이에 따라 DFAT 세포를 생성하고 DCM DMEM 효율을 비교 하​​였다. 관계없이 지방 세포의 개수 (도 2A와 B)의 DMEM에 비해 이와 관련하여, DCM 세 배 DFAT 세포의 증식을 강화. 10 % FBS (도시되지 않은 데이터)를 사용하여 프로토콜과 비교했을 때 20 % FBS 사용은 세포 성장을 향상시킨다. 우리는 추가로 DCM을 사용하여 제조 DFAT 셀 (도 3)를 지방 세포로 재분화 및 조골 세포로 분화 할 수있는 능력을 갖고 있음을 확인 하였다. 분석법 방법은 이전 연구 6에서

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토론

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시험관 탈분화에 천장 문화로 알려진 과정을 거쳐 성숙한 지방 세포는 더 원시적 인 표현형으로 되돌아와 증식 능력을 얻을 수 있습니다. 이 세포로 탈분화 지방 (DFAT) 세포라고합니다. DFAT 세포의 multilineage 분화 잠재력을 평가 하였다. 분석 및 유전자 발현 분석 DFAT 세포의 ASC (6)에 비해 매우 균일 한 것으로 확인 유동 세포 계측법. 사실, DFAT 세포의 세포 표면 항원 프로파일의 ASC 6에있는 것과 매우 유사하다. 따라서, DFAT 세포는 중간 엽 줄기 세포와 유사하게 기능 할 수있다.

성공적으로 20 % 송아지 혈청으로 보충 7-8 DMEM F12 세포 배양 배지를 이용 DFAT 세포가 생성되고 다른 그룹. 우리는 10 %의 FBS로 보충 된 세포 배양 용 배지를 사용 DFAT 셀을 제조하려고했지만,이 프로토콜 DFAT 생산 세포의 수는 w보다 상당히 낮았다편 20 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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본 연구는 일본과학진흥회(Japan Society for the Promotion of Science, ST261006IP, TM)의 첨단연구기술창업프로그램(START Program)과 문부과학성의 사립대학 전략연구재단 프로그램(Program for the Strategic Research Foundation at Private Universities) (S1411018, TM)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CSTI303-MSC 배지 CSTI87-671이 매체는
PBS(-)Wako166-23555Mg2+ 및 Ca2+
DMEM 매체Gibco11965-092
Fetal Bovine SerumSigma172012
Collagenase type IISigmaC-6885
ScissorsTakasago Medical Industry Co., LtdTKZ-F2194-1
셰이커TAITECBioshaker V.BR-36
팔콘 셀 스트레이너 100 μ m 옐로우코닝 생명과학 DL 352360
팔콘 12.5 cm² 파란색 통풍 나사 캡이 있는 직사각형 경사 목 세포 배양 플라스크CORNING LIFE SCIENCES 
18 G 바늘NIPRO02-002
20 ml 주사기 NIPRO08-753
Z 시리즈 쿨터 카운터BECKMAN 쿨터383550
텍스트에서 DCM으로 정의됩니다. 를 포함하지 않습니다. 353107

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).
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