체세포 재 프로그래밍의 운동 측정 및 실시간 시각화

요약

본 연구에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 이용하여 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 마커의 운동 측정을 통해 프로그래밍 진행의 실시간 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 또한 IPSC 생성시 형태, 마커 또는 기자의 표현의 영상 기반의 평가를 포함한다.

초록

체세포 재프로그래밍은 성체 세포를 다양한 유전적 배경과 질병 표현형의 유도 만능 줄기세포(iPSC)로 전환할 수 있게 했습니다. 최근의 발전으로 재프로그래밍 요인을 도입하기 위한 보다 효율적이고 안전한 방법이 확인되었습니다. 그러나 재프로그래밍의 진행 상황을 모니터링하고 추적할 수 있는 도구는 거의 없습니다. 리프로그래밍을 모니터링하는 현재의 방법은 형태학의 정성적 검사 또는 줄기세포 특이적 염료 및 항체를 사용한 염색에 의존합니다. iPSC 생성의 진행 과정을 해부하는 도구는 다양한 세포 소스의 다양한 조건에서 프로세스를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 연구는 유세포 분석을 사용하여 재프로그래밍 진행의 kinetic 측정과 이미징을 통한 실시간 모니터링을 위한 주요 접근 방식을 제시합니다. 재프로그래밍의 동역학을 측정하기 위해 양성 및 음성 만능 줄기 세포 마커에 대한 항체를 사용하여 개별 시점에서 흐름 분석을 수행했습니다. 실시간 시각화와 흐름 분석의 결합을 통해 여러 단계에서 재프로그래밍에 대한 정량적 연구를 수행할 수 있으며 다양한 시스템과 방법을 보다 정확하게 비교할 수 있습니다. 실시간 이미지 기반 분석은 섬유아세포가 피더가 없는 배지 시스템에서 재프로그래밍될 때 섬유아세포를 지속적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 콜로니 형성의 동역학은 SSEA4 또는 TRA-1-60에 대한 살아있는 알칼리성 인산가수분해효소 염료 또는 항체로 염색한 후 위상차 또는 형광 채널의 합류를 기반으로 측정되었습니다. 그 결과, 합류점 측정은 재프로그래밍의 진행을 모니터링하기 위한 반정량적 메트릭을 제공한다는 것을 보여주었습니다.

서론

환자 유래 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 세포 치료 및 약물 검사를위한 유망한 도구입니다. 그들은 치료를위한 세포의자가 소스를 제공합니다. 또한, 이들은 현재 배아 줄기 세포 (ESC) 라인이 허용하는 것 이상의 유전 질환의 상세한 시험 관내 분석을 가능 유전 배경의 매우 광범위한 세트를 포함한다. 최근의 진보는 센다이 바이러스, 플라스미드 또는 에피 솜의 mRNA ^1,2- 함께 프로그래밍 포함 iPSCs를 생성하는 여러 가지 방법의 개발을 이끌어왔다. 특히, 다양한 프로그래밍 방법은 효율성 및 안전성의 레벨 변화와 연관된 다양한 애플리케이션에 자신의 적합성에 영향을 미치는 다른 방법과 다를 가능성이있다. 프로그래밍 기술의 다양한 가용성, 상기 프로그래밍 프로세스를 평가하기위한 방법을 개발하는 것이 중요하게되었다. 대부분의 기존 방법은 형태 나 염색의 정성 검사에 의존줄기 세포 특이 염료 및 항체. 하나는 최근에 개발 된 방법은 PSC 별의 miRNAs 또는 분화 된 세포 고유의 mRNA ^3에 민감한 렌티 바이러스 형광 기자를 사용합니다. 이러한 모니터링 방법은 선택과 다른 상황에 대한 재 프로그래밍 기술의 최적화를 용이하게한다. 예를 들어, 재 프로그래밍 CDy1 조절제 ⁴ 스크리닝하기 위해 초기 iPSCs하는 형광 프로브로서 사용되었다. 관찰하고 다른 프로그래밍 실험을 비교하는 기능은 프로세스 자체의 이해를 얻는데 중요하다. 예를 들어, 이제 일부 체세포 유형이 다른 ^5보다 쉽게 재 프로그래밍 것으로 알려져 있으며, 셀 ^{6-8 재} 프로그래밍 동안에 중간 상태를 끝까지. 불행하게도, 재 프로그래밍 절차의 기초가되는 메카니즘은 아직 완전히 이해되지 않으며, 따라서, 리 프로그래밍 방법의 정확한 차이 교리되도록 유지efined. 따라서, 모니터링 방법, 평가 및 재 프로그래밍 이벤트를 비교는 줄기 세포 분야에 대한 중요 할 것을 계속한다.

이 프로토콜에서 설명하는 방법은 모니터링을 허용하고, 프로그래밍 프로세스를 평가하고 이들 기술은 프로그래밍 시약의 상이한 세트를 비교하는 방법을 도시한다. 첫 번째 방법은 유세포 포함 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 (PSC) 마커에 대한 항체의 조합을 사용하여 분석한다. 두 번째 방법 커플 실시간 영상 및 총 합류 (셀 적용 비율 표면적)와 마커 신호 (형광 신호에 의해 덮여 %의 표면적)의 합류 측정.

프로토콜

1.Solution 및 중간 준비

1. 지하실 막 매트릭스 (Engelbreth-홀름 - 떼 종양에서 정제)
   1. 천천히 밤새 4 ° C에서 얼음에 지하실 막 매트릭스 (5 ㎖) 해동.
   2. 멸균, 사전 냉장 15 ML 원뿔 튜브 얼음 감기, 멸균 DMEM / F-12 배지 5 ㎖로 1 : 원액 1을 희석. 사전 냉장, 1.5 ml의 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ° C에 저장합니다.
   3. 4 ℃에서 밤새 1 기저막 매트릭스 분취 : 사용하기 전에, 1 냉동 해동. 분취 한 빙냉 1의 최종 희석 멸균 DMEM / F-12 배지에서 또 다른 50 배 : 100 사용시에, 상기 한 희석.
   4. 적당한 조직 배양 (TC) 100 배 희석 기저막 매트릭스 용액을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다 : 1의 적당량을 추가한다. 일반적으로, 코팅 기술위원회 접시 O로 희석 기저막 매트릭스 용액 3 ㎖을 사용F 20cm ² 표면적 코트 TC 요리 다른 모든 유형 / ^표면적이 cm 당 희석 매트릭스 0.15 ml의 비율로 플레이트. 종래 임의 배지와 세포의 첨가에 남은 용액을 흡인.
2. 섬유 아세포 중간
   1. 4 ° C에서 하룻밤 ES 공인 태아 소 혈청 (ES-FBS)의 100 ㎖ 병을 녹여.
   2. (50) 해동 ES-FBS ㎖의 DMEM 배지 445 ml의에 MEM 비 필수 아미노산 용액 (1 배)의 5 ML을 추가합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 결합 된 구성 요소를 소독하고 최대 4 주 동안 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
3. IMEF 중간
   1. 밤새 4 ° C에서 ES-FBS의 100 ㎖ 병을 녹여.
   2. 해동 FBS 50 ㎖, MEM 비 필수 아미노산 용액 5 ㎖ (1X) 및 DMEM 배지 445 mL로 2 머 캅토 에탄올 500 μL를 추가한다.
   3. 0.22 μm의 필터를 통해 결합 된 구성 요소를 소독하고 저를 저장최대 4 주 동안 4 ° C에서 dium.
4. 염기성 섬유 아세포 성장 인자 용액 (b-FGF)
   1. D-PBS 990 μL에 세럼 교체 10 μl를 추가하고 철저로 pipetting 아래로 섞는다.
   2. 10 μg의 동결 건조 B-FGF의 한 유리 병에 1 % (v / v)의 혈청 대체 솔루션의 1 ML을 추가합니다. 철저하게 부드럽게 피펫 팅 아래로 섞는다.
   3. 최대 4 주 동안 필요할 때까지 -20 ℃에서 마이크로 원심 분리기 튜브 저장소 200 μL 분취 액에 10 μg의 / ㎖의 용액 B-FGF 나누어지는.
5. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC) 중간
   1. 밤새 4 ° C에서 혈청 교체의 100 ㎖ 병을 녹여.
   2. 해동 세럼 교체 100 ㎖, MEM 비 필수 아미노산 용액 5 ㎖ (1 배) 및 DMEM / F-12 배지 395 ml를 2 - 머 캅토 에탄올 500 μl를 추가합니다.
   3. 0.22 ㎛의 필터를 통해 상기 결합 된 성분을 소독에 매체를 저장할최대 4 주 동안 4 ° C를.
   4. 사용시, 37 ° C에 hPSC 매체를 미리 따뜻하게 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충합니다.
6. IMEF 중간 (CM), 금연실
   1. 은 T-175 문화 플라스크에 0.1 % 젤라틴의 18 ML을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어.
   2. 부화 한 시간 후에 0.1 % 젤라틴 용액을 제거합니다. IMEF 매체의 45 ㎖에 9.1 × 10 ⁶ mitotically - 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아세포 (IMEF)를 추가하고 밤새 37 ° C 배양기에서 배양한다.
   3. 밤새 배양 한 후, 이전 IMEF 배지를 제거하고 실온에서 5 분 동안 D-PBS 25 mL로 한번 세척 하였다.
   4. 는 D-PBS 오프 대기음은 씻어 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충 사전 예열 hPSC 매체의 90 ml에 추가합니다. 정확히 24 시간 동안 37 °의 C 배양기에서 품어.
   5. 배양 24 시간 후, 무균 IMEF 플라스크에서 hPSC 배지를 제거하고 0.22 ㎛의 필터를 통해 살균. 5로 나누어지는-20 ° C에서 0 ML 원뿔 튜브 및 동결이 필요할 때까지. IMEF CM는 -20 ° C에서 최대 6 개월 동안 저장 될 수있다.
   6. IMEF 플라스크에 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충 사전 예열 hPSC 매체의 또 다른 90 ML을 추가합니다. 정확히 24 시간 동안 37 °의 C 배양기에서 품어. 최대 7 일간 CM의 수확을 반복합니다.
   7. 사용시, 37 ° C에 IMEF-CM을 미리 따뜻하게 bFGF를 4 ng를 / ㎖로 보충합니다.
7. E8 중간
   1. 밤새 4 ° C에서 10 ml의 E8 보충을 녹여.
   2. 나머지 기본 배지에 해동 E8 보충제의 내용을 추가 무균 E8 기초 배지 10 ㎖를 제거하고. 철저하게 믹스와 0.22 μm의 필터를 통해 살균. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 완전 배지를 저장합니다.
   3. 사용시에, 배지의 분취 액을 실온으로 사용되는 사전에 가온. 37 ° C에 E8 중간 따뜻한을 미리하지 않는 것이 좋습니다.
8. 셀 그래서rting 버퍼
   1. 셀 EDTA 용액 (1 mM의 최종 농도), HEPES 완충액 (25 mM의 최종 농도) 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 (100 단위 / ml의 최종 농도) 및 소 혈청 알부민 (1 % 최종 농도)에 추가하여 정렬 직전 신선한 정렬 버퍼를 준비 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (칼슘과 마그네슘 무료).
   2. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 필터를 통해 멸균 버퍼.
9. 셀 정렬 복구 중간
   1. 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ml의 최종 농도)와 록 억제제 Y-27632 (10 μM 최종 농도)를 추가하여 섬유 아세포 보통 50 ㎖를 수정합니다. 사전 따뜻한 37 ° C에이 매체 정렬 세포를 파종하기 전에.

인간 섬유 아세포의 2 센다이 중재 재 프로그래밍

1. 이전에 24 시간은, 센다이 바이러스에 전달 2 × 10 ⁵ (c)의 밀도 섬유 아세포를 배정하는6 웰 TC 플레이트의 원하는 우물에 잘 당 ELL 학생.
2. 다음 날 0의 전달을 수행합니다.
   1. 37 ° C의 물을 욕조에 섬유 아세포 중간의 사전 따뜻한 2ml를. -80 ° C에서 저장 장치로부터 센다이 바이러스 튜브의 한 세트를 제거하고 제 5, 37 ° C의 물을 용기에 튜브의 하단을 침지 시간에 각각의 튜브를 해동 - 10 초 후 물 튜브를 제거 목욕하고 실온에서 해동 할 수 있습니다. 해동 후, 간단히 튜브를 원심 분리 및 얼음에 즉시 배치합니다.
   2. 예열 된 섬유 아세포 중간 1 ㎖로 감염 다음 다중성 (MOI)를 달성하기 위해 튜브의 각 (COA에 따라) 적절한 양을 첨가함으로써 상업적 번째 세대 센다이 바이러스를 사용하여 웰 당 다음과 같이 형질 될 : KOS = 5 × 10 ⁶ CIU, HC-Myc와 = 5 × 10 ⁶ CIU, hKlf4는 = 3 × 10 ⁶ CIU.
   3. 철저하게 부드럽게 위아래로 혼합물을 피펫 팅에 의해 바이러스 솔루션을 섞는다. 공단5 분 이내에 다음 단계는 테.
   4. 재 프로그램 할 수있는 섬유 아세포의 우물에서 섬유 아세포 매체를 대기음, 그리고 각 웰에 바이러스 액 1ml를 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어.
3. 밤새 배양 한 후, 전달 매체를 흡인하고 이전 매체 제대로 (30 분 동안 10 % 표백제 용액) 폐기. 형질 도입 세포를 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖로 교체과 문화를 계속합니다.
4. 문화 매일 신선한 섬유 아세포 중간에 기존 매체를 대체 6 일 이상 세포.
   참고 : 7 일 전달을 게시 할 때까지하지 통로에게 다시 프로그램 세포를 수행합니다.
5. 6 일 : IPSC 세대를위한 준비 요리
   1. 피더 의존 IPSC 생성을 위해, 6- 웰 조직 배양 (TC) 접시의 각 웰에 1.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 첨가하고, 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
   2. 그래서 0.1 % 젤라틴을 제거lution 배양 1 시간 후. 물론 당 IMEF 매체 2 ㎖에 3 × 10 ⁵ mitotically - 불 활성화 된 마우스 배아 섬유 아세포 (IMEF)를 추가하고 밤새 37 ° C 배양기에서 배양한다.
   3. 6 잘 조직 문화 (TC) 접시의 각 웰에 : (100 희석 1)과 1 시간 동안 37 ° C에서 부화 장치에 독립적 인 IPSC 생성을 위해, 희석 기저막 행렬의 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
6. 이레 형질 도입 후 형질 섬유 아 세포를 수확하고 IPSC 식민지 생성을 위해 미리 만들어진 문화 요리에 그들을 다시는-판.
   1. 섬유 아세포로부터 정상 배지 대기음하고, D-PBS 2 ㎖ 회 세포를 세척 하였다.
   2. 는 D-PBS 오프 대기음은 씻어 미리 예열 0.05 % 트립신 / EDTA 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 5 분 - 3 세포를 인큐베이션.
   3. 세포가 반올림 한 경우, 트립신을 중지 아니라 각에 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 t을 피펫 팅하여 잘에서 세포를 이동시키다그는 중간 접시의 표면을 가로 질러. 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
   4. 2 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음, 신선한, 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ml의 세포를 재 - 일시 중지합니다.
   5. 원하는 방법 (혈구 또는 자동 세포 계수기)를 사용하여 세포를 세어 6 웰당 피더 의존 조건에 5 × ¹⁰⁴ 세포와 피더에 독립적 인 조건에서 1 × ¹⁰⁵ 세포로 미리 제조 된 배양 접시를 시드 요리 - 그럼 ₂ 배양기 하룻밤 37 ° C, 5 % CO 부화.
   6. 밤새 배양 한 후, 용도에 따라, hPSC 매체 E8 매체 또는 IMEF 에어컨 미디어 매체를 변경. 매일 그 후 신선한 매체와 기존 매체를 교체합니다.

BGO1v hOct4-GFP 리포터 인간 배아 줄기 세포의 3 센다이 재 프로그래밍 (hESC의) 파생 보조 섬유 아세포

1. 데르절차에 따라, BG01v hOct4-GFP 기자 hESC의 줄에서 보조 인간의 섬유 아세포를 필자는 이전에 ^9를 설명했다.
2. 이틀 전달하기 전에, BGO1v / 돼지가 섬유 아세포 매체를 사용하여, 잘 당 2 × 10 ⁵ 세포에서 6 웰 플레이트의 두 우물에 섬유 아세포를 유도 판.
   1. 37 ° C에 섬유 아세포 매체의 전달, 사전 따뜻한 2 (M1)의 날.
   2. -80 ° C 저장 영역에서 센다이 튜브 한 세트를 제거합니다. 파우치에서 튜브를 제거하고 제 5, 37 ° C의 물을 용기에 튜브의 하단을 침지 시간에 각각의 튜브를 해동 - 10 초 후, 튜브를 실온에서 해동 할 수있다. 해동 후, 간단히 튜브를 원심 분리 및 얼음에 즉시 배치합니다.
   3. 세 센다이 튜브의 각 표시된 볼륨을 추가 섬유 아세포 중간 2 ㎖에 (해당 볼륨에 대한 CoA를 참조), 37 ° C로 미리은 예열하고 철저로 pipetting 아래로 바이러스 솔루션을 섞는다. 다음 인트를 완료5 분 내 페이지.
      참고 :이 실험의 MOI 5 : 5 : 6이 사용되었다.
   4. 섬유 아세포의 우물에서 섬유 아세포 매체를 대기음하는 형질 도입한다. 두 개의 웰 각각에 바이러스 현탁액 1 ㎖ 형질되도록 추가한다. 37 ° C, 5 % CO ₂ 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어.
   5. 하룻밤 배양 후, 전달 매체를 제거하고 올바르게의 (30 분 10 % 표백제 용액)을 폐기하십시오. 형질 도입 세포를 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖ 잘 각각의 교체와 문화를 계속합니다.
3. 문화 매일 신선한 섬유 아세포 중간에 오래된 매체를 변경 6 일 이상 세포.
   1. 세븐 일 형질 도입 섬유 아 세포를 수확하고 IPSC 식민지 생성을 위해 미리 만들어진 문화 요리에 그들을 다시 접시, 전달을 게시 할 수 있습니다.
   2. 섬유 아세포로부터 정상 배지 대기음하고, D-PBS 2 ㎖ 회 세포를 세척 하였다.
   3. 민주당 오프 대기음BS는 씻어 미리 예열 0.05 % 트립신 / EDTA 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 5 분 - 3 세포를 인큐베이션.
   4. 세포가 반올림 한 경우, 트립신을 중지 아니라 각에 미리 예열 섬유 아세포 중간 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 접시의 표면을 가로 질러 매체 피펫 팅함으로써 웰로부터 세포를시키다. 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
   5. 200 X에서 세포를 원심 분리기 2 분 동안 g. 뜨는을 대기음, 신선한, 미리 예열 섬유 아세포 중간의 적절한 양의 세포를 재 - 일시 중지합니다.
   6. 원하는 방식 (또는 자동 혈구 세포 계수기)를 사용하여 세포를 카운트.
   7. 기저막 매트릭스의 웰 당 1 × ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 형질 도입 된 세포를 시드 6 웰 - 코팅 플레이트를 밤새 37 ° C, 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 배양한다.
4. 밤새 배양 한 후, 10 NG / m 보충, 조정 배지를 IMEF하는 매체를 변경B-FGF의 리터. 그 후 신선한 IMEF CM의 일상과 기존 매체를 교체합니다.
5. 3 주 기계적 해부 및 클론 확장을 원하는 식민지를 전송하거나 분석을 위해 사용, 전달을 게시 할 수 있습니다.

섬유 아세포 재 프로그래밍 4. 라이브 셀 이미징

1. 실시간 모니터링
   1. 7 일 전술 한 바와 같이, 원하는 중간 매트릭스 시스템 6- 웰 접시에 세포를 원하는 양의 종자, 센다이 프로그래밍 키트 전달 게시. 37 ° C로 설정 가습 인큐베이터에있는 이미 저, 내부 시드 요리를 놓고, 5 % CO _2.
   2. 제조사의 프로토콜에 따라 다음 14 일 동안 연속 촬영 이미지 - (8 시간마다 6)에 일정 간격으로 각 웰의 전체 웰 이미지를 캡처하는 이미지 소프트웨어를 설정한다.
      참고 : 위상 대비 이미지 설정이 식민지의 진행을 평가하는 일반적인 프로그래밍 선택됩니다. 경우에BG01v / 돼지가 섬유 아세포 재 프로그래밍을 유도, 그것은 재 프로그래밍 과정 전반에 걸쳐 추적 할 수 있습니다 위상 콘트라스트와 내생 OCT4-GFP 기자의 재 활성화와 녹색 형광 채널 이미지를 캡처하는 것이 가장 좋습니다.
   3. 일일 매체 변경이 hPSC 매체 E8 매체 또는 IMEF-CM 수 있고, 이전에 전달 후 21 일에 8에서 설명한 바와 같이, 실험에 따라. 웰은 또한 간접적 인 면역 형광을 사용하여 콜로니 형성에 대해 분석 할 수있다.
   4. 21 일 19 일 실험의 끝에, 섬유 모세포에 대한 항체로 프로빙 각 웰에서 배지를 제거하고 원하는 세포 마커 줄기.
   5. 미리 예열 DMEM / F-12 배지 2 ㎖로 잘 한 번 각을 씻으십시오.
   6. 다음 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 각각 양 / 음 차 항체 쌍의 분취 량을 준비한다 : 항 - 마우스 SSEA4을 (1 : 200) 및 안티 - 쥐 CD44 (1시 50분), 항 - 마우스 TRA-1- 60 (1 : 200) 및 안티 - 쥐 CD44 (1시 50분) 및 알칼리성 포스파타제 리얼룩 (1시 50분) 및 안티 쥐 CD44 (1:50)했습니다. 각이 잘 대응하는 1 ml의 일차 항체 솔루션을 추가합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
   7. 차 항체 용액 오프 기음과 미리 예열 DMEM / F-12 배지로 두 번 씻는다.
   8. 빨간색 형광 용 : (500 1) 녹색 형광 및 염소 안티 쥐 알렉사 플 루어 594 복합 보조를 위해 : (500 일) 염소 항 - 마우스 알렉사 플 루어 488 복합 보조를 사용하여 (각 웰에 1 ㎖) 이차 항체 솔루션을 준비 DMEM / F-12 배지. 최종 세척 후 각 웰에 추가합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 이차 항체 인큐베이션.
      참고 때문에 알칼리성 포스파타제의 라이브 얼룩 (APLS) 과도 신호, 항 CD44 일차 배양 우선 자신에 의해 수행되어야하고 APLS 2 차 항체로 배양시에 첨가해야
   9. 이차 항체 배양 후, 솔루션을 기음과 DMEM / F-12 배지로 두 번 씻는다. 추가 신선한 미리 예열 DMEM / F-12최종 이미지 캡처에 각 웰 이전에 매체.
   10. 위상 콘트라스트, 녹색 형광과 빨간색 형광 : 잘 세 가지 검색 매개 변수를 사용하여 각각의 전체 웰 이미지를 수집하기 위해 이미 저 소프트웨어를 설정합니다. 다양한 배율의 이미지를 만들고 성장과 마커의 발현을 모니터링하는 소프트웨어와 함께 시간 경과 영화를 만들 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다.
   11. 분석 소프트웨어를 활용, 위상 대비하고 BG01v / 돼지 프로그래밍을위한 녹색 형광 단위로 훨씬 넘는 시간의 합류를 평가한다.
2. 재 프로그래밍 중간체 사용하여 세포 표면 마커 모니터링
   1. 리 프로그래밍 프로세스를 모니터링하기 위하여 다른 줄기 세포의 양 / 음 마커에 대한 항체로 다양한 시점에서 프로그래밍 요리를 프로빙하여 다른 시점에서 프로그래밍 이벤트를 모니터링. 프로브 문화마다 2 ~ 3 일 복제의 가용성에 따라 달라집니다. 재 프로그래밍의 창피 프로브이중 염색 전략을 사용하고 21 일 19시 HES 완전히 재 프로그램 IPSC 식민지와 염색 패턴에 따라 부분적으로 재 프로그램 식민지를 식별합니다.
   2. 목적하는 시점에서 잘 선택 마커에 대한 항체로 프로빙 각각으로부터 정상 성장 배지를 흡인.
   3. 미리 예열 DMEM / F-12 배지 2 ㎖로 잘 한 번 각을 씻으십시오.
   4. 다음과 같이 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 각각 양 / 음 차 항체 쌍의 분취 량을 준비 : 녹색 형광 형광 (1 : 200)에 접합 SSEA4을, TRA-1-60 녹색 형광 형광 (1 접합 : 50), 알카라인 라이브 얼룩 (1 : 500), CD24는 녹색 형광 형광 (1시 50분) 녹색 형광 형광 (1시 50분)는 EpCAM 녹색 형광 형광 접합 접합, B2M (1시 50분)에 접합 마우스 CD73과 프로빙하고, 쥐 CD44 (1:50) : 녹색 형광 형광 (500 1)에 접합 된 항 마우스 이차 항체로 프로브 (1 100)안티 쥐 이차 항체는 적색 형광 형광 (500 1)에 접합. 각이 잘 대응하는 1 ml의 일차 항체 솔루션을 추가합니다. 45 분 동안 37 ° C에서 품어.
   5. 대기음 차 항체 용액을 끄고 미리 예열 DMEM / F12 배지로 두 번 씻는다.
   6. 접합 항체 적절한 차 항체 용액을 제조함으로써 2 단계 방법을 사용하여 진행 및 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 이차 항체가 기본 호스트로하고 교차 반응하지 않는 것이 확인합니다. 전술 한 바와 같이 추가 세척 단계를 수행합니다.
   7. 모든 적절한 세척 한 후, 최종 이미지 캡처에 각 웰 이전에 신선한 미리 예열 DMEM / F-12 배지를 추가합니다.
   8. 형광 현미경을 이용하여 100 배 배율의 적절한 필터 아래의 형광 이미지를 캡처 가능한 분석 소프트웨어를 이용하여 영상을 분석한다.

흐름 C를 사용하여 재 프로그래밍 속도론 5. 측정ytometry

1. 재 프로그래밍의 양적 운동 측정 세포 표면 항체를 사용하여
   1. 프로그래밍 이전에, 각 시점에 대해 프로그래밍 실험의 적절한 수를 설정한다. 프로그래밍의 제 7 일간 프로그래밍의 동역학을 측정하는 개별 transductions 원하는 각 시점에 대해 수행된다. 7 일 후 시점 들어, 재 프로그래밍 이벤트를 계속 측정 할 수있는 충분한 공급 독립적 시점 시드. 6- 웰 플레이트 중 하나의 웰을 유세포 분석을 수행하기 위해 충분한 양의 세포를 수득한다.
   2. 이 종점 분석 한, 개별 웰에서 원하는 모든 프로그래밍 시점을 측정한다. 섬유 아세포 중간 잘 원하는으로부터 대기음. D-PBS로 한번 씻어.
   3. 는 D-PBS 세척 오프 기음. 잘 0.05 % 트립신 EDTA 용액 1 ml의 추가 테스트 할 수 있습니다. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
   4. 배양에 따라, dissoci우물의 표면에 1 ㎖의 세포 현탁액을 세척하여 단일 세포로 세포를 먹고 15 ML 원뿔 관에 정지를 전송합니다. 우물에서 남아있는 세포를 씻어 15 ML 원뿔에 추가 D-PBS 3 ㎖를 사용합니다. 상기 원추형 튜브에 세포 용액을 희석하기 위해 추가적인 D-PBS 10 ㎖를 사용한다.
   5. 2 분 동안 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이하 ¹ × ¹⁰⁶ 이상의 세포 / ml 인 표준 세포 현탁액을 만들기 위해 필요한 세포 수를 수행한다.
   6. SSEA4 녹색 형광 형광 물질 (1 : 200)에 접합 : 다음과 같은 조합을 사용하여 이하 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml에 대해 DMEM / F-12 배지 1 ㎖에 원하는 양 / 음 직접 접합 된 항체의 각각의 분취 량을 준비 CD44는-Cy5에를 PE에 결합, 또는 CD44는 멀리있는 빨간색 형광의 형광 접합 녹색 형광 형광 및 SSEA4에 접합. 품다실온에서 45 분 동안 세포 현탁액으로 항체.
   7. 차 항체 용액을 흡인하고 예열 된 DMEM / F-12 배지로 두 번 세척 하였다.
   8. 최종 세척 대기음 D-PBS 1 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 피펫 개별 FACS 튜브의 각 서스펜션의 내용.
   9. 해당 음성 대조군 (흠과 이소 컨트롤)를 사용하여 세포 계수기에 적절한 전방 및 측면 산란 프로파일 및 전압을 확인합니다. 상기 녹색 형광체는 청색 레이저 및 BL1 채널에서 취득 된 신호에 의해 활성화되도록 초기 단일 염색 파라미터에 따라 대응하는 형광체에 대한 전압을 설정까지 적색 형광을 형광 및 PE-Cy5에의 형광체가 적색 레이저에 의해 활성화되는 동안 및 RL1 채널에서 획득 한 신호. 각 시점에 대한 이중 염색 인구 획득.
   10. 적절한 분석 소프트웨어를 이용하여 각 시점에 대한 FCS 파일을 분석하고 ARRA하는 편집기를 사용하여NGE 데이터는 시간이 지남에 인구의 발현 변화를 관찰한다.
   11. 셀 분류가 서로 다른 시점에서 필요한 경우, 5.1.6에 단계 5.1.1을 따르십시오. 사용하는 셀 소터의 레이저 구조에 따라 적절한 형광 물질의 조합을 사용한다.
   12. 최종 세척 후, 세포 선별 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 흠없는 컨트롤을 사용하여 적절한 전방 및 측면 산란 설정으로 셀 소터를 설정합니다. 각 형광에 대한 적절한 설정을 설정하는 하나의 스테인드 컨트롤을 사용합니다.
   13. 이중 염색 세포 현탁액의 작은 샘플을 사용; 정렬 할 수있는이 인구를 선택하고 정렬 세포의 적절한 수집을 보장하기 위해 각각의 요금을 할당합니다.
   14. 분류 된 세포 현탁액 쿠션 및 정렬시 보호하기 위해 수집 튜브에 세포 회복 배지 200 μl를 추가한다. 세포의 욕망 번호를 수확하고 신선한 포함하는 새로운 IMEF 요리에 전송사라져 복구 매체를 준비했다.
   15. 복구 매체와 하룻밤 배양 한 다음 매체를 변경합니다. 배양 물은 계속해서 공급 일상적 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ml의 최종 농도)를 함유 hPSC 매체를 이용하여 계대 배양해야한다.

6. 엔드 포인트 분석

1. 터미널 알칼리성 포스파타제 (AP) 염색
   1. 최종 프로그래밍 효율성과 관찰 운동과 형태 학적 이벤트 상관 관계를 단말기 발색 AP 염색을 사용합니다.
   2. 프로그래밍 21 일에 이어, 우물에서 문화 매체가 터미널 AP 얼룩 염색 할 수 제거하고 200 mM Tris-HCl (pH8.0)을 한 번 씻는다.
   3. 200 mM 트리스 - 염산에 제조업체의 사용 설명서의 지시에 따라 염색 용액의 적당량을 준비한다.
   4. 세척을 기음과 각 웰에 제조 된 염색 액 2 ㎖를 추가합니다. 실온에서 20 내지 30 분 동안 인큐베이션 멀리 번째 행전자 빛.
   5. 염색 솔루션을 대기음, 200 mM 트리스 HCl로 한 번 씻는다. 세척을 제거하고 사전 시각화에 증류수를 추가합니다.
   6. 통상 화상 카메라를 사용하여 비색 신호를 캡처. 손으로 긍정적으로 염색 콜로니의 수를 계산합니다. 얼룩도 자연 속에서 형광 한, Trit-C 채널 형광 분석을 사용하여 얼룩을 시각화하고 전체 잘 이미징을 수행하고 전체 웰 이미 저를 사용하여 분석 하였다. 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다.

결과

유동 세포 계측법을 사용하여 재 프로그래밍의 속도론을 모니터링

SSEA4는 PSC 마커 ^6,10 동안 CD44는 섬유 아세포 마커입니다. 이 표현식 패턴에서 예상대로, 세포 계측법 BJ 섬유 아세포의 흐름 SSEA4 보여줍니다 ^- 흠 샘플과 함께 사분면 게이트의 생성을 촉진 CD44 ⁺ 인구. SSEA4 천천히 표현하면서 센다이 바이러스와 DF1 섬유 아 세포의 리 프로그래밍 동안, CD44은 점차 소실된다. CD44 ⁺ 세포와 7 일 (그림 1)에서 더 두드러진다 SSEA4 ⁺ CD44 ⁺ 세포의 작은 인구 ^​​- 센다이 바이러스에 전달 후 3 일에서, SSEA4의 많은 인구가...

토론

이 연구는 유세포 분석과 실시간 이미징 기반 분석을 사용하여 재프로그래밍 프로세스를 모니터링하고 추적하기 위한 전략을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 재프로그래밍 시작, 마커 표현을 기반으로 재프로그래밍 진행 상황 측정 및 재프로그래밍의 실시간 모니터링입니다. 선택한 모든 재프로그래밍 방법을 사용할 수 있지만 여기서는 인간 섬유아세포의 센다이 기반 재프로그래밍에 중점을 둡니다. 이 방법의 장점은 사용 편의성과 일관된 고효율 재프로그래밍입니다.

재프로그래밍 진행을 평가하기 위해 세포는 재프로그래밍의 개별 단계에서 수확되고 종점 유세포 분석 대상이 됩니다. 음성 PSC 마커 CD44 및 양성 PSC 마커 SSEA4를 사용하여 재프로그래밍 배양을 이중 염색하면 재프로그래밍 진행을 평가할 수 있습니다⁶. 보다 구체적으로, 재프로그래밍의 개별 단계에서 둘 중 하나, 둘 중 하나 또는 둘 다 마커를 발현하는 세포의 분포는 서로 다른 조건에서 재프로그래밍 동역학의 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM, 고포도당, GlutaMAXSupplement, 피루브산	Thermo Fisher Scientific	10569-010
Fetal Bovine Serum, 배아 줄기세포 인증, 미국 원산지	Thermo Fisher Scientific	16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드	Thermo Fisher Scientific	25300-054
마우스(ICR) 불활성화 배아 섬유아세포	Thermo Fisher Scientific	A24903
부착 인자 단백질(1x)	Thermo Fisher Scientific	S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제	Thermo Fisher Scientific	10565-018
녹아웃 혈청 대체품	Thermo Fisher Scientific
2-메르캅토에탄올 (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
콜라겐분해효소, IV형, 분말	Thermo Fisher Scientific	17104-019
TrypLE Select Enzyme (1x), 페놀 레드 없음	Thermo Fisher Scientific	12563-011
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC 인증, 저성장 인자 기저막 매트릭스	Thermo Fisher Scientific	A1413302
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) 재조합 인간 단백질	Thermo Fisher Scientific	PHG0264
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575-020
소 알부민 분획 V (7.5% 용액)	Thermo Fisher Scientific	15260-037
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
InSolution Y-27632	EMD Millipore	688001
CytoTune-iPS Sendai 리프로그래밍 키트	Thermo Fisher Scientific	A1378001
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DF1 성인 인간 피부 섬유아세포	Thermo Fisher Scientific	N/A
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SSEA-4 항체 (MC813-70)	Thermo Fisher Scientific	41-4000
TRA-1-60 항체 (cl.A)	Thermo Fisher Scientific	41-1000
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CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live	Cell Imaging Thermo Fisher Scientific	A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7)	Thermo Fisher Scientific	RM-5700 (더 이상 사용할 수 없음)
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염소 항-쥐 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 594 접합체	Thermo Fisher Scientific	A-11007
알칼리성 인산가수분해효소 생염색	Thermo Fisher Scientific	A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 생세포 이미징용 접합체 키트	Thermo Fisher Scientific	A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate	Thermo Fisher Scientific	MHCD2401
beta-2 Microglobulin 항체, FITC conjugate (B2M-01)	Thermo Fisher Scientific	A15737
EpCAM / CD326 항체, FITC conjugate (VU-1D9)	Thermo Fisher Scientific	A15755
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