본 연구에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 이용하여 양 및 음의 다 능성 줄기 세포 마커의 운동 측정을 통해 프로그래밍 진행의 실시간 모니터링 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 또한 IPSC 생성시 형태, 마커 또는 기자의 표현의 영상 기반의 평가를 포함한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
체세포 재프로그래밍은 성체 세포를 다양한 유전적 배경과 질병 표현형의 유도 만능 줄기세포(iPSC)로 전환할 수 있게 했습니다. 최근의 발전으로 재프로그래밍 요인을 도입하기 위한 보다 효율적이고 안전한 방법이 확인되었습니다. 그러나 재프로그래밍의 진행 상황을 모니터링하고 추적할 수 있는 도구는 거의 없습니다. 리프로그래밍을 모니터링하는 현재의 방법은 형태학의 정성적 검사 또는 줄기세포 특이적 염료 및 항체를 사용한 염색에 의존합니다. iPSC 생성의 진행 과정을 해부하는 도구는 다양한 세포 소스의 다양한 조건에서 프로세스를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 연구는 유세포 분석을 사용하여 재프로그래밍 진행의 kinetic 측정과 이미징을 통한 실시간 모니터링을 위한 주요 접근 방식을 제시합니다. 재프로그래밍의 동역학을 측정하기 위해 양성 및 음성 만능 줄기 세포 마커에 대한 항체를 사용하여 개별 시점에서 흐름 분석을 수행했습니다. 실시간 시각화와 흐름 분석의 결합을 통해 여러 단계에서 재프로그래밍에 대한 정량적 연구를 수행할 수 있으며 다양한 시스템과 방법을 보다 정확하게 비교할 수 있습니다. 실시간 이미지 기반 분석은 섬유아세포가 피더가 없는 배지 시스템에서 재프로그래밍될 때 섬유아세포를 지속적으로 모니터링하는 데 사용되었습니다. 콜로니 형성의 동역학은 SSEA4 또는 TRA-1-60에 대한 살아있는 알칼리성 인산가수분해효소 염료 또는 항체로 염색한 후 위상차 또는 형광 채널의 합류를 기반으로 측정되었습니다. 그 결과, 합류점 측정은 재프로그래밍의 진행을 모니터링하기 위한 반정량적 메트릭을 제공한다는 것을 보여주었습니다.
서론
환자 유래 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 세포 치료 및 약물 검사를위한 유망한 도구입니다. 그들은 치료를위한 세포의자가 소스를 제공합니다. 또한, 이들은 현재 배아 줄기 세포 (ESC) 라인이 허용하는 것 이상의 유전 질환의 상세한 시험 관내 분석을 가능 유전 배경의 매우 광범위한 세트를 포함한다. 최근의 진보는 센다이 바이러스, 플라스미드 또는 에피 솜의 mRNA 1,2- 함께 프로그래밍 포함 iPSCs를 생성하는 여러 가지 방법의 개발을 이끌어왔다. 특히, 다양한 프로그래밍 방법은 효율성 및 안전성의 레벨 변화와 연관된 다양한 애플리케이션에 자신의 적합성에 영향을 미치는 다른 방법과 다를 가능성이있다. 프로그래밍 기술의 다양한 가용성, 상기 프로그래밍 프로세스를 평가하기위한 방법을 개발하는 것이 중요하게되었다. 대부분의 기존 방법은 형태 나 염색의 정성 검사에 의존줄기 세포 특이 염료 및 항체. 하나는 최근에 개발 된 방법은 PSC 별의 miRNAs 또는 분화 된 세포 고유의 mRNA 3에 민감한 렌티 바이러스 형광 기자를 사용합니다. 이러한 모니터링 방법은 선택과 다른 상황에 대한 재 프로그래밍 기술의 최적화를 용이하게한다. 예를 들어, 재 프로그래밍 CDy1 조절제 4 스크리닝하기 위해 초기 iPSCs....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1.Solution 및 중간 준비
- 지하실 막 매트릭스 (Engelbreth-홀름 - 떼 종양에서 정제)
- 천천히 밤새 4 ° C에서 얼음에 지하실 막 매트릭스 (5 ㎖) 해동.
- 멸균, 사전 냉장 15 ML 원뿔 튜브 얼음 감기, 멸균 DMEM / F-12 배지 5 ㎖로 1 : 원액 1을 희석. 사전 냉장, 1.5 ml의 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브에 분취 량을 분배하고 즉시 -20 ° C에 저장합니다.
- 4 ℃에서 밤새 1 기저막 매트릭스 분취 : 사용하기 전에, 1 냉동 해동. 분취 한 빙냉 1의 최종 희석 멸균 DMEM / F-12 배지에서 또 다른 50 배 : 100 사용시에, 상기 한 희석.
- 적당한 조직 배양 (TC) 100 배 희석 기저막 매트릭스 용액을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다 : 1의 적당량을 추가한다. 일반적으로, 코팅 기술위원회 접시 O로 희석 기저막 매트릭스 용액 3 ㎖을 사용F 20cm 2 표면적 코트 TC 요리 다른 모든 유형 / 표면적이 cm 당 희석 매트릭스 0.15 ml의 비율로 플레이트. 종래 임의 배지와 세포의 첨가에 남은 용액을 흡인.
- 섬유 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
유동 세포 계측법을 사용하여 재 프로그래밍의 속도론을 모니터링
SSEA4는 PSC 마커 6,10 동안 CD44는 섬유 아세포 마커입니다. 이 표현식 패턴에서 예상대로, 세포 계측법 BJ 섬유 아세포의 흐름 SSEA4 보여줍니다 - 흠 샘플과 함께 사분면 게이트의 생성을 촉진 CD44 + 인구. SSEA4 천천히 표현하면서 센다이 바이러스와 DF1 섬유 아 세포의 리 프로그래밍 동안, CD44은 점차 소실된다. CD44 + 세포와 7 일 (그림 1)에서 더 두드러진다 SSEA4 + CD44 + 세포의 작은 인구 - 센다이 바이러스에 전달 후 3 일에서, SSEA4의 많은 인구가.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 연구는 유세포 분석과 실시간 이미징 기반 분석을 사용하여 재프로그래밍 프로세스를 모니터링하고 추적하기 위한 전략을 제공합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 재프로그래밍 시작, 마커 표현을 기반으로 재프로그래밍 진행 상황 측정 및 재프로그래밍의 실시간 모니터링입니다. 선택한 모든 재프로그래밍 방법을 사용할 수 있지만 여기서는 인간 섬유아세포의 센다이 기반 재프로그래밍에 중점을 둡니다. 이 방법의 장점은 사용 편의성과 일관된 고효율 재프로그래밍입니다.
재프로그래밍 진행을 평가하기 위해 세포는 재프로그래밍의 개별 단계에서 수확되고 종점 유세포 분석 대상이 됩니다. 음성 PSC 마커 CD44 및 양성 PSC 마커 SSEA4를 사용하여 재프로그래밍 배양을 이중 염색하면 재프로그래밍 진행을 평가할 수 있습니다6. 보다 구체적으로, 재프로그래밍의 개별 단계에서 둘 중 하나, 둘 중 하나 또는 둘 다 마커를 발현하는 세포의 분포는 서로 다른 조건에서 재프로그래밍 동역학의 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 [RHQ, JSTA, KS 및 UL] 모두는이 문서에서 사용되는 시약 및 악기의 일부를 생산 써모 피셔 사이언 티픽의 직원입니다.
감사의 글
저자는 도움이 토론 차드 맥아더 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM, 고포도당, GlutaMAXSupplement, 피루브산 | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, 배아 줄기세포 인증, 미국 원산지 | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드 | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| 마우스(ICR) 불활성화 배아 섬유아세포 | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| 부착 인자 단백질(1x) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| 녹아웃 혈청 대체품 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 2-메르캅토에탄올 (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 콜라겐분해효소, IV형, 분말 | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x), 페놀 레드 없음 | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC 인증, 저성장 인자 기저막 매트릭스 | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) 재조합 인간 단백질 | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 소 알부민 분획 V (7.5% 용액) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai 리프로그래밍 키트 | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai 리프로그래밍 키트 | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II 자동 세포 계수기 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess 세포 계수 챔버 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC 인간 포피 섬유아세포, 신생아 | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 성인 인간 피부 섬유아세포 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG 세포 변이체 hESC hOct4-GFP 리포터 세포 | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 항체, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 항체, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 항체 (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 항체 (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (클론 IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live | Cell Imaging Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (더 이상 사용할 수 없음) | |
| 염소 항-마우스 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 488 접합체 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| 염소 항-쥐 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor 594 접합체 | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| 알칼리성 인산가수분해효소 생염색 | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 생세포 이미징용 접합체 키트 | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin 항체, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 항체, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E 항체 (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo 데이터 분석 소프트웨어 | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune 음향 포커싱 사이토미터, 블루/레드 레이저 | Thermo Fisher Scientific | 사용 Attune NXT | |
| S3e \ 세포 분류기 (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm 튜브 (셀 스트레이너 캡 포함 | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 ml, 고선명도, 돔 씰 나사 캡 | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 플라스크 | 코닝 | 353136 | |
| Falcon T-175 플라스크 | 코닝 | 353112 | |
| Falcon 6웰 디쉬 | Corning | 353046 | |
| Heraeus Heracell CO2 롤링 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free 마이크로분리 튜브, 1.5 ml | AM12450 | ||
| HulaMixer 시료 주입 | 15920D |
참고문헌
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
