인간 종양 이종 이식은 생체 혈관의 성장 단계 중 마우스 유래의 세포에 의해 함침된다. 하류 분석시 이러한 세포의 오염에 의한 바이어스를 회피하기 위해, 자기 세포 선별에 의해 모든 마우스 세포의 광범위한 공핍을 허용하는 방법을 개발 하였다.
이 논문에서
요약
초록
암 연구를위한 시험 관내 세포주 모델의 사용은 유용한 도구가되어왔다. 그러나, 이러한 모델은 확실히 다른 분석 한 환자에서 종양을 모방하지 못하는 것으로 나타났다. 인간 종양 이종 이식 종양 생물학, 약물 발견 및 전이 연구 2-4에 대한 황금 표준을 나타냅니다. 종양 이종 이식 종양 세포주, 일차 종양 환자 4 직렬 이식 종양에서 종양 조직 같은 재료의 종류로부터 유도 될 수있다. 생체 내에서 전파되는 경우, 이종 이식 조직 침윤 및 마우스 유래의 세포에서 혈관된다. 이러한 종양 엔티티 여러 요인 이종 이식 이식 물질, 성장 속도 영역의 원점은 조성물 종양 이종 이식 마우스에 존재하는 세포의 양에 영향을 미친다. 그러나, 이러한 요소가 일정하게 유지되는 경우에도, 마우스 세포 오염의 정도가 매우 다양하다.
공동ntaminating 마우스 세포는 상당히 인간 종양 이종 이식의 하류의 분석을 방해. 마우스 섬유 아세포는 높은 도금 효능 증식 속도 표시, 그들은 특히 천천히 개체군 증식 인간 종양 세포의 배양 자라다하는 경향이있다. 마우스 세포 DNA, mRNA를 산출하고 단백질 성분을 바이어스 할 수 하류 유전자 발현 분석, 차세대 시퀀싱뿐만 아니라, 프로테옴 분석 (5). 이러한 한계를 극복하기 위해, 이종 이식 종양 조직에서 본래 인간 종양 세포를 분리하는 빠르고 쉬운 방법을 개발 하였다. 이 절차는 벤치 탑 조직 dissociator 자기 세포 선별에 자동화 된 조직의 분리를 조합하여 마우스 유래의 세포의 광범위한 공 핍층에 기초한다. 여기서는 인간 표적 세포가 종양 유형에 독립적 미만에서 20 분 이내에 순도 96 % 이상을 얻을 수있을 수 있다는 것을 보여준다.
서론
고체 인간의 종양은 여러 생리 학적뿐만 아니라 종양 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 그들은 복잡한 생물학적 구조와 이종 조직을 형성한다. 생물 종양 형성, 진행 등의 프로세스 및 치료를 향한 반응은 아직 완전히 이해되지 않습니다. 체외 세포 배양 모델을 연구하고 종양 생물학을 이해하는 유용한 도구를 나타냅니다. 그러나, 이들은 부분적으로 종양 조직에서 발견되는 구조와 과정을 반영 할 수있다. 신뢰성 있고 안정적인 전임상 인간 종양 모델은 항암 약물 요법과 4,6의 개발뿐만 아니라 종양 생물학 및 종양 세포와 주변 환경의 상호 작용을 이해하기위한 전제 조건이다.
주 환자의 종양에서 파생 된 인간 종양 이종 이식 모델은 약 7 마이크로 환경 구조, 전이 가능성 및 응답 높은 조직 학적 구조에 대한 기원의 조직 관계, 상호 작용을 보여 . 종양 이종 이식에 따라서 시험 관내 세포 배양 모델에 비해 가장 높은 유효성 분석을 도시 배양 된 세포 또는 세포주들은 더 가깝게 모방 환자 종양으로부터 유도되는 경우에도. 이러한 기능은 그들 전임상 모델 4의 황금 표준합니다. 암 연구에서의 응용 이외에 마우스에 인간 세포의 이종 이식은 종종 타겟 인구 8 stemness 분화 잠재력을 결정하는 줄기 세포 연구에 사용된다.
그것은 인간의 미세 혈관을 보였다과 인간의 면역 세포는 인간의 종양 2,9의 생체 내 전달에 대체됩니다. 이러한 이식 종양 아형, 성장 속도, 및 지역과 같은 요인 주요 침입 세계적 수준에 대한 영향뿐만 아니라 발견 마우스 세포 유형의 조성물을 갖는다. 그러나, 이러한 요인이 일정하게 유지되는 경우에도, 양, 마우스 세포의 조성물은 매우 가변적.
이종 이식 조직의 다운 스트림 분석은 종종 쥐 기원의 세포에 의해 도전을하고 있습니다. 이종 이식에서 인간 종양 세포의 차 문화는 자주 섬유 아 세포에 의해 자란있다. 시험관 내에서 종양 세포주의 생성을 방해 외에, 이러한 약물 독성 시험 또는 약동학 등 하류 분석 마우스 세포를 오염시키는 것은 대부분의 경우에 불가능 유래 효과 실리 정정 이후에 바이어스된다. 그건 그렇고, 마우스 섬유 아세포와 인간 종양 세포 사이의 유일한 부분적으로 밝혀 크로스 토크는 연구 (10)의 실험 결과에 직접적인 영향을 미친다. 또한, 마우스 세포 침윤 가장 널리 예측할 변동 정확한 분자 하류 분석을 악화시킨다. NGS 또는 프로테옴에서 직접 시퀀싱 감도를 감소 인간 종양 신호 대신에 측정 된 각각의 마우스에서 파생 된 신호를 분석한다. 또한 마이크로 어레이 기반의 발현 분석은 쥐 NUC에 의해 도전leic 산 인간의 프로브에 가능한 크로스 혼성화.
다른 접근 방법이 제안되어있다 이종 이식 모델에서 인체 종양 세포의 전방 분석 마우스 세포 오염의 장애물을 회피하기 위해. 많은 연구에서 하류 분석 원하는 타겟 셀은 배타적 인간 종양 세포에 발현 마커 또는 마커의 조합을 이용하여 분리된다. 그러나, 인간 종양 세포의 양의 식별에 대한 신뢰성있는 마커의 부족은 종종 큰 장애물을 나타낸다. 인간 암종에는 EpCAM으로도 광범위하게 표현 마커, 자주 종양 고유의 표현의 차이 (11)을 보여줍니다. 이것은 낮은 발현 개체군은, 예를 들면, 종양 세포가 분리 과정 상피 간 간엽 전환 후의 손실 위험을 증가시킨다. 또한, 상기 타겟 셀에 선택 화제의 직접 결합은 후속 분석 결과에 영향을 미칠 수있다. 마우스에 의해 세포를 파괴의 시도쥐 CD45 및 MHC 클래스 I 항원에 특이적인 항체의 조합을 사용하는 것은도 12를 제조 하였다. 그러나, 이러한 마커 조합은 마우스 세포의 서브 세트를 검출한다. 또 다른 방법은 소프트웨어에 의해 분석하는 방법을 개선하는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 모든 방법 중 하나를 실험 장치의 종류 또는 종양 엔티티 및 이식 방법에 적합하지 않습니다.
이 연구에서 우리는 포괄적으로 마우스 변형 및 기원 조직의 독립적 인 이종 이식 조직으로부터 마우스 세포를 파괴하기위한 새롭고 빠른 방법을 제시한다. (피부, 폐, 뇌, 신장, 골격근 포함) 이종 이식 여러 표적 기관 및 조직의 검사에서는 포괄적 마우스 세포 검출을 허용하는 항체의 조합을 식별 할 수 있었다. 이들 항체는 상자성 입자에 결합 적정 자기 세포 분류를 사용하여 붕괴에 대해 최적화되었다. 으로 만 마우스 특정인간 항체는 표적 세포가 "그대로"유지, 사용되는 상기 방법은 xenotransplanted 종양 조직에 한정되지 않는다. 이종 이식 종양 샘플은 표준화 및 인간 종양 세포의 배양을 용이에서 우리는 포괄적으로 제거 마우스 세포를 보여준다. 더욱이, 우리는 차세대 염기 서열 인간 종양 이종 이식의 분석은 현저하게 개선되는 것을 보여준다. 인간 서열의 특정 선택은 엑솜 농축 동안 수행 하였지만,이 효과는 관찰 된 바와 같이, 전체 게놈 시퀀싱 전 사체에의 영향은 더욱 눈에 띄는 것으로 예상된다. 종합적으로, 이러한 신규 방법을 사용하여 마우스 세포를 제거하여, 인간 종양 세포의 배양을 용이하게 크게 인간 종양 이종 이식의 하류 분석을 개선한다.
프로토콜
모든 동물 실험은 Regierungspräsidium 프라이 부르크 Referat (35)의 지역 윤리적, 법적 지침에 따라 수행되었다.
1. 시약 준비
주 : 실험을 시작하기 전에, 분리 키트 다음의 시약을 제조 :
- 효소 H는 RPMI 1640 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (RPMI 1640) 또는 둘 베코 개변 이글 배지 (DMEM) 3 ㎖의 동결 건조 된 분말의 각 바이알을 녹여 제조 하였다. 20 ° C 최대 6 달 - 반복 동결을 방지하고 녹고 적합한 분취 량 (예를 들어, 200 μL)를 준비하고, 그들을 저장하려면.
- 효소 R은 RPMI 또는 DMEM 배지 2.7 ml의 동결 건조 분말의 병을 녹여 준비합니다. 20 ° C 최대 6 달 - 반복 동결을 방지하고 녹고 적합한 분취 량 (예를 들어, 100 μL)를 준비하고, 그들을 저장하려면.
- v를 용해 효소 A를 준비하려면완충액 A 1 ㎖의 동결 건조 된 분말은 IAL 텍싱없이 키트에 공급된다. (. 예를 들면, 25 μL)를 - 최대 6 개월 동안 20 ° C 반복 동결 융해 적합 분취 량을 준비하고 회피에 보관하기 위해. 철저하게 필요한 반응 볼륨을 철수하기 직전에이 현탁액을 혼합해야합니다.
- 세포 분리 절차 및 항체 염색 250 ml의 버퍼 (1X PBS 0.5 % BSA와 함께)를 준비합니다.
주 : 마우스 세포를 제거한 후 배양 세포가 0.22 μm의 필터를 통해 모든 버퍼 및 효소액을 필터링 할 때.
2. 종양 해리 프로토콜
참고 : 본 연구는 비소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 유래의 이종 이식에서, 신장 암, 방광암 사용 하였다. 이전 13 바와 같이 6 주 오래 NMRI 암컷 뉴 / 뉴 마우스 - 종양 4 비 - 소세포 폐암의 이종 (NSCLC) 신장 암, 방광암 주입에 의해 생성 된 입니다.
주 :이 프로토콜은 종양 유형 완전히 독립적이므로,이 프로토콜의 변형없이 환자 또는 세포주 유래 종양뿐만 아니라 인간 조직 xenotransplanted 다른 종류의 어떠한 종류에 사용될 수있다.
- (갓 셀룰러 분리 튜브에 효소 H 4.7 RPMI 1640 또는 DMEM ㎖의 200 ㎕의 효소 R 100 ㎕, 효소 A의 25 μl를 첨가하여 (1g 이하) 조직 샘플 당 소화 혼합물 5 ㎖를 준비 C 관). 철저하게 필요한 볼륨을 인출하기 전에 효소 R 서스펜션을 혼합해야합니다.
- 마취하에 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 80 % v / V를 에탄올 소량 분무하여 마우스를 소독.
- 조직 배양 후드에서 핀셋 및 가위를 사용하여 마우스의 옆구리 피하 종양으로부터 수확. 가위를 사용하여 종양의 장소에서 열려 피부를 잘라 다음 집게와 가위를 사용하여 인접한 건강한 조직에서 종양을 구분합니다.
참고 :의 목적에 따라실험은 무균 상태에서 이것과 다음 단계를 수행하십시오. 본 연구의 모든 단계의 세포를 배양 할 수있는하기 위해 무균 조건 하에서 세포 배양 후드에서 수행 하였다. - 집게와 메스를 사용하여 멀리 절단하여 (이 감소 생존을 초래할 것 등) 및 괴사 영역 (이 샘플 플로트를 만들 것 같은) 지방을 제거하여 digestions에 대한 종양 샘플을 준비합니다. 메스와 집게를 사용하여 4mm - 2 조각으로 조직을 말하다.
- 소화 혼합물을 함유하는 C 튜브에 조직 조각을 전송.
- 는 C 튜브를 닫고이 단단히 닫혀 있는지 확인하십시오. 거꾸로 벤치 탑 조직 dissociator의 소매에 그것을 연결하고 조직 조각이 회 전자 / 고정자의 지역에 위치하고 있는지 확인하십시오.
- 은 "최대"버튼 또는 "아래로"버튼 모드가 화면에 나타날 때까지 다음 "시작"버튼을 눌러 모드 "h_tumor_01"를 선택합니다.
- 유하는 경우벤치 탑 조직 dissociator의 가열 기능 노래도 히터를 부착해야합니다. 다음 폴더 "Miltenyi 사"가 나타날 때까지 터치 스크린의 폴더 기호를 클릭하여 (하드 종양) 모드 (중간 종양) (소프트 종양) 37C_h_TDK_1, 37C_h_TDK_2 또는 37C_h_TDK_3를 실행합니다.
- 모드를 선택하려면 위쪽 또는 37C_h_TDK_2는 강조 표시하는 해리 모드까지 아래쪽 화살표를 클릭합니다. 벤치 탑 조직 dissociator의 슬리브는 장치의 디스플레이 상에 위치하는 것으로 도시되어있다. 샘플 터치 스크린을 클릭에 의해 실행되는 위치를 선택합니다. 를 눌러 모드를 실행하는 단계 2.16를 계속하려면 "시작".
참고 : 종양의 종류에 따라 다른 해리 프로그램 (단계 2.7.1 참조) 적합 할 수 있습니다.
- 화면에 "프로그램의 종료"를 표시하는 창을 준수하십시오. 프로그램의 종료 후, 벤치 탑 조직 dissociator에서 C 튜브를 분리합니다.
- 37에서 30 분 동안 샘플을 품어튜브 회전을 사용하여, 예를 들어 연속 회전에서 C를 °.
- 배양 후 벤치 탑 조직 dissociator의 소매에 거꾸로 C 튜브를 연결합니다. 다시 샘플 재료는 회 전자 / 고정자의 지역에 위치해야합니다.
- 단계 2.7.1에 설명 된대로 (하드 종양) 해리 프로그램 (소프트 및 중간 종양) h_tumor_02 또는 h_tumor_01를 실행합니다.
- 프로그램의 종료 후, 벤치 탑 조직 dissociator에서 C 튜브를 분리합니다.
- 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어.
- 배양 후 벤치 탑 조직 dissociator의 소매에 거꾸로 C 튜브를 연결합니다. 다시 샘플 재료는 회 전자 / 고정자의 지역에 위치해야합니다.
- 단계 2.7에 설명 된대로 (하드 종양) 해리 프로그램 (중간 종양) (소프트 종양) h_tumor_03, h_tumor_02 또는 h_tumor_01를 실행합니다.
- 상기 튜브의 하단에 샘플 재료를 수집하는 것은 SHO를 수행(10 초 100 XG에) RT 원심 분리 단계.
- 세포를 재현 탁하고 50 ML 튜브에 배치 70 μm의 nesh 크기의 셀 스트레이너에 적용됩니다. RPMI 1640 또는 DMEM 20 ml의 셀 스트레이너를 씻으십시오.
- 7 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는.
- 계산을위한 버퍼 5 ㎖에 재현 탁 세포. 자기 세포 분리 (섹션 3)에 의해 마우스 세포 고갈을 진행합니다.
자기 세포 분리 기술 3. 마우스 세포 고갈
참고 : 아래 자기 라벨링 볼륨은 최대 2 × 10 (6) 종양 세포 또는 적혈구 등 10 7 총 세포 수 있습니다. 종양 크기에 따라 낮거나 높은 세포 수를 획득한다. 지시 된 바와 같이 적은 세포의 경우에, 동일한 양을 사용한다. 높은 세포 수를 사용하는 경우, 그에 따라 (모든 시약 부피 및 총 부피를 확장 예 4 × 106 개 종양 세포를 2 X 10 7 총 세포는 모든 표시 시약 볼륨과 전체 볼륨)의 두 배 볼륨을 사용합니다.
- 계산을위한 현미경과 적절한 챔버를 사용하여 단계 2.21에서 세포 현탁액의 분취 량의 세포 수를 결정합니다.
주 :이 세포 현탁액 인간 종양 세포의 균질 혼합물로 구성 점과 적혈구 포함 마우스 간질 세포 및 혈액에서. 세포 조성물 강하게 이식 종양 종류 및 영역에 따라 달라진다. - 마우스 세포의 제거가 흠 두 번의 컬러 제어의 염색을위한 유세포 분석을 위해 적절한 튜브에 100 μL 씩 인출 한 후 유세포 분석을 수행하는 경우. 또한 염색 단계 (섹션 4)까지 8 °의 C - 2에서 냉장고에 보관하십시오.
- 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 상층 액을 버린다.
- 2 × 106 개 종양 세포 당 107 완충액 80 μL에 재현 탁 된 세포 펠렛총 세포는 마우스 세포의 자기 라벨 시약의 20 μl를 추가합니다.
- 잘 섞어 냉장고에 15 분 동안 품어 (2-8 °의 C). 자성 표시 중에 적합한 자석의 자기장에 배치함으로써, 자기 분리를위한 대형 열 (컬럼 LS)을 제조 제조사의 프로토콜에 따라 (기자재 표 참조). 버퍼의 3 ㎖로 열을 씻어.
- 최대 10 × 2-6 종양 세포 또는 10 7 전체 세포까지 버퍼를 사용하여 500 μL에 샘플 볼륨을 조절합니다. (7 10 × 1 종양 세포까지 또는 5 × 10 7 전체 세포가 하나의 LS 칼럼에 처리 할 수있는 최대. 더 많은 세포로 작업 할 때하면 여러 LS 열 상에 샘플을 분할).
- 유세포 분석, 분자 분석을 수행 또는 문화에 분수를 비교하면, 정렬되지 않은 샘플로 50 μL 나누어지는을 철회. 추가 처리까지 8 °의 C - 2에서 냉장고에 보관합니다.
- 이전에 제조 된 컬럼에 세포 현탁액 500 μl를 적용합니다. , 표지 된 표적 세포를 포함하는 농축 된 인간 종양 세포를 나타내는 플로우 스루 수집.
주 : 3.5 한 컬럼에 적용 할 수있는 단계에 따라 제조 된 세포 현탁액 2.5 mL를까지 높은 세포 수를 사용하여 작업하는 경우. - 버퍼의 2 × 1 ml의 열을 씻으십시오. 통과 세포를 수집하고 단계 3.6에서 흐름을 통해 결합. 즉시 열 저장이 비어로 1 mL의 분취 량 버퍼를 첨가하여 세척 단계를 수행한다.
참고 : 흐름을 통해이 정제 된 인간 종양 세포가 포함되어 있습니다. - 또한 열에서 유지 마우스 세포를 수집하려면 분리기에서 열을 제거하고 적절한 튜브에 놓습니다. 버퍼의 3 ㎖ 칼럼 상에 즉시 피펫 단단히 열로 밀어 마우스 세포를 세척하는 플런저를 사용합니다.
- 10 분 동안 300 XG에 분획 및 대조 시료를 스핀. 대기음 공중으로원하는 용도에 따라 하류 완전히 rnatant 및 완충액, 배양 배지에 재현 탁 된 세포를 액체 질소에서 동결 펠렛.
4. 다운 스트림 분석
- 유세포 분석을 위해 염색
음표 : 하류 분석을 수행하기 전에, 마우스 세포 고갈 절차로부터 얻어지는 세포의 일부를 분석 할 수있는 유세포 분석기 (예를 들면, 순도 및 수율을 평가).- 유세포 분석을 위해 10 분 동안 300 XG에 음성 및 양성 자성 세포 분리 방법 (제 3)에서 얻은 분획뿐만 아니라 단계 3.2로부터 제어 샘플과 3.5의 적어도 10 %를 스핀.
- 상층 액을 버린다. 완충액 90 μL의 단계 3.2에서 염색 대조 시료의 세포 펠렛을 재현 탁. 완충액 80 μL에 자기 세포 분리 과정에서 얻어지는 분획을 재현 탁.
- 모든 마우스의 FcR 차단 시약의 10 μl를 추가견본. 잘 혼합하고 2에서 5 분 동안 품어 - 냉장고에서 8 °의 C.
- 항 - 인간는 EpCAM-PE의 10 μl를 추가가 및 항 - 마우스 - APC 칵테일 25 μL (항체 1:10 희석와 동일) (1 항체 희석과 같다 : 4) 제 3 절에서 샘플 안티의 10 μl를 추가 하나의 컬러 제어 샘플 - 인간는 EpCAM-PE는 및 다른 항 - 인간는 EpCAM-APC의 10 μL (1:10 항체 희석와 동일) (항체 1:10 희석와 동일). 모든 샘플을 혼합하고 2에서 10 분 동안 품어 - 냉장고에서 8 °의 C.
참고는 EpCAM 모든 종양 유형의 종양 세포 마커로서 적합하지 않다. 이 연구는 EpCAM 표현에 사용되는 종양으로 알려져 있었다. - , 샘플을 씻어 5 분 동안 300 XG에 버퍼 각각의 스핀 1 ㎖를 추가합니다.
- 상층 액을 제거하고 유세포 분석 농도로 세포 펠렛을 재현 탁. 죽은 세포는 프로피 디움 아이오다 이드 (/ ㎖ 1 μg의)를 추가 제외합니다.
- 적합한 F를 사용하여 유세포 분석을 수행제조 업체의 프로토콜에 따라 낮은 사이토.
- 인간 종양 세포의 배양
참고 : 또한이 유동 세포 계측법에, 분리 과정에서 얻은 세포 배양 시험관 내에서 추가 분석을 위해 사용 될 수 있습니다.- 5 × 105 세포 / ml의 농도로 배지에서 (3)의 정렬 분율을 재현 탁.
종양 유형 코팅, 적절한 파종 밀도에 따라, 재배 조건이 다를 수 있습니다. - 0.1 % 젤라틴으로 코팅 된 24 웰 플레이트의 우물에 세포 현탁액 500 μl를 추가합니다.
- 37 ° C, 5 %의 세포 배양기에서 세포를 부화.
참고 : 최적의 배양 조건은 사용되는 종양의 유형에 따라 달라집니다. 따라서, 사용 된 종양 유형에 적합한 배양 조건을 적용한다.
- 5 × 105 세포 / ml의 농도로 배지에서 (3)의 정렬 분율을 재현 탁.
- 배양 된 세포의 면역 형광 염색법
- 10 % FCS 및 0.1 % 첨가하여 용액을 차단 준비트리톤 X-100은 PBS를 1 배로.
- 취소 배지. 세포를 씻어 잘 당 1X PBS 500 μl를 추가합니다. 실온 (RT)에서 2 분 동안 품어 후 완전히 1X PBS를 폐기합니다.
- 4 % PFA 용액 300 μL를 첨가하여 세포를 고정한다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
- PFA 솔루션을 폐기하십시오. 단계 4.3.2에 표시된대로 고정 된 세포를 3 회 반복한다.
- 물론 당 차단의 300 μl를 추가하여 permeabilization 및 차단을 수행합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 솔루션을 차단 폐기하십시오. 단계 4.3.2에 표시된대로 세포를 씻으십시오.
- 세포에 차단 솔루션에 희석 차 항체의 300 μl를 추가합니다. 200 :는 EpCAM 항체 1시 40분 희석 한 항 - 인간, 비 멘틴 항체 1 희석한다. 8 °의 C - 2에서 밤새 품어.
참고는 EpCAM 또한 종양 세포에 의해 발현되는 종양 세포 및 / 또는 비 멘틴 발현되지 않을 수도로서 사용되는 항체는 모든 종양 유형에 대해 적합하지 않다. 사용 된 항체는 이종 이식 개월에 적합해야합니다델. - 일차 항체 솔루션을 폐기하십시오. 단계 4.3.2에 표시된대로 세포를 3 회 반복한다.
- 세포에 차단 솔루션에 희석 이차 항체의 300 μl를 추가합니다. 400 : 두 항체, 항 - 토끼 IgG를-Alexe594 및 항 - 마우스 IgG-Alexa488 1 희석한다. 실온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 품어.
- 이차 항체 솔루션을 폐기하십시오. 단계 4.3.2에 표시된 셀을 2 회 반복한다.
- 각 웰에 DAPI 용액 300 μL (0.1 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 품어.
- DAPI 솔루션을 폐기하십시오. 단계 4.3.2에 표시된대로 세포를 3 회 반복한다.
- 각 웰에 1X PBS 500 μl를 추가합니다. 적절한 현미경을 사용하여 형광 현미경을 수행합니다.
- 전체 엑솜 시퀀싱
- 액체 질소의 단계 3.9에서 전체 엑솜 시퀀싱 (WES) 동결 펠릿하십시오. 저장 및 -80 ° C에서 샘플을 수집합니다.
- 세포를 수집 한 후, 엑솜 캡처 및 전체 엑솜의 서열을 수행각 키트 제조업체의 지침에 따라 uencing (재료 및 장비의 표 참조).
결과
다른 접근 방법은, 예를 들면, 이종 이식 인간 종양에서 마우스 세포를 식별하거나 고갈 그러나, 마우스 세포의 개체군이 제안 조합 CD45을 검출하는 반면 이러한 조합을 사용하여 검출 하였다 CD45 및 MHC 클래스 I에 대해 마우스 특이 적 항체의 조합이 제안되어있다 MHC 클래스 I 및 마우스 세포뿐만 아니라 이식 표적 조직에서 발견 마우스 세포의 나머지 부분을 표현한다 (그림 1). 자기 세포 분류에 대한 항체의이 새로운 조합을 활용, 인간 종양 세포는 종양 유형 (그림 2) 독립적으로 분리 할 수있다.
자기 세포 분리 과정 계 마우스 세포의 제거로부터 얻어지는 세포는 인간 종양 세포 (도 4)의 순수 배양 선도 배양 될 수있다. 또한, 마우스의 생존 세포를 수득 할 수 있고 배양에서동일한 샘플. 마우스 세포의 제거 외에, 또한 이물질 마우스 세포 고갈 (MCD) (도 3)에 따라 제거 하였다.
개선 하류 분자 분석을 종합 마우스 세포의 고갈뿐만 아니라 이물질 제거 용 리드. 이것은 세 가지 다른 환자 유래의 이종 이식 종양 모델 (- 9 그림 5)에서 대량 종양 조각 및 마우스 세포 고갈 샘플에서 수행 전체 엑솜 시퀀싱 (WES)에서 얻은 결과를 비교하여 입증되었다. 우리의 데이타는 이종 이식 종양 샘플에서 WES를 수행하기 전에 마우스 세포의 제거뿐만 아니라 상당히 (도 5를) 판독의 총량을 증가뿐만 아니라 상당히 호스트의 수는 인간 참조 게놈 (도 6B)에 매핑 판독 유래 감소 시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 잘못 매핑 된 마우스가 자주 SNP 호출을 방해 읽기, 우리는 거짓 예언의 강한 감소를 관찰SNP를 MCD 후 (그림 7-8). 마지막으로, 우리는 기원의 종에 대한 명확한 순서 기반 할당이 모든 읽기 불가능 있다는 마우스 유래의에 실리 제거가 완전히 실험 절차를 대체 할 수있는 생물 정보학 방법으로 읽는 것을 보여 주었다. 또한, 실리 과정에서 수 향상된 품질과 체외 고갈 샘플을 수반하는 높은 읽기 범위 (그림 9) 올바르지 않습니다.
피부, 폐, 뇌, 신장과 골격 근육을 포함한 여러 장기에 여러 기관 14. 상영을 통해 모든 마우스 세포를 인식하는 항체 칵테일을 구축 그림 1.이 수행되었다. 이 기관은 이종 이식에 대한 주요 표적 조직을 나타냅니다. 이러한 그 인식 양해 각서 (MOU) 등의 조합SE CD45 및 MHC 클래스 I 에피토프 이미 마우스 이종 이식 한 후 세포를 고갈시키기 위해 사용되어왔다. 그러나, 이들 마커 조합은 분석 된 모든 조직에서 쥐 세포의 서브 세트를 인식했다. 이전 검사 다섯 항체의 결합은 마우스 유래의 모든 세포의 광범위한 검출을 가능하게 확인되었다. 이 패널은 적혈구를 포함하고 기원 조직 무관 (A, B, 데이터는 도시하지 않음). (14)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 세포의 그림 2. 안정적이고 빠른 고갈 초상 자성 n 인 항체 조합의 15. 접합체anoparticles 정렬 자기 셀 (자기 세포 분리) (A)에서 인간 종양 이종 이식 마우스에서 세포의 고갈에 대한 최적의 프로토콜을 개발 하였다. 이 새로운 프로토콜에 관계없이 암 유형 미만에서 20 분에, 마우스 세포 오염의> 99 %의 제거를 허용했다. 자기 세포 분리 과정에서 얻은 세포 분획 팬 - 마우스 항체 칵테일 및 CD326 (는 EpCAM)에 대한 인간의 특정 항체 (B)으로 표시 하였다. (15)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인간 아교 모세포종 세포의 격리도 3. 마우스 세포 고갈 키트 성인 MOUS에서 인간 아교 모세포종 세포를 분리하는 데 사용 된전자 두뇌입니다. 파편의 신경 조직 많은 양의 해리 동안 일반적으로 발생한다. MCDK 효율적으로 세포 단위 대 셀 크기를 나타내는 그래프로 볼 때 죽은 세포와 파편을 고갈. 이 복합 칵테일, 그것은 오염 마우스 세포의> 99 %와 파편의> 60 %를 제거 할 수 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 세포의 고갈도 4는 인간 종양 세포 (14)의 하류 배양을 용이하게한다. 마우스 섬유 아세포 자주 이식 된 조직을 분리 한 후, 인간 종양 세포의 배양을 저해 또는 이종 배양 이어질. 섬유 아세포하여 타겟 C를 overgrowing보다 효과적으로 확장 첨부 할 ELL 학생. 이것은 대부분의 경우에 불가능 마우스 세포의 오염으로 인한 효과를 수학적 보정하기 때문에, 시험 관내 세포 배양 분석 (예, 약물 독성 시험)에서 교란. 마우스 세포 고갈 후의 음성 (B) 및 양성 분획 (C)는 사흘 고정 마우스 별 섬유 아세포의 마커 (멘틴) 인간 특정 종양 표지자 CD326 (는 EpCAM)에 대한 염색을 위해 배양 하였다. 대조군으로서, 분리되지 않은 세포를 (A)를 포함하는 원래의 분획을 배양뿐만 아니라 염색. 정렬되지 않은 분획 (A)는 섬유 아세포에 의해 거의 자란이었다 반면 심지어 배양 사흘 인간 종양 세포의 거의 순수한 인구 음극 분획 (B)에서 관찰되었다. 표적 세포의 단지 작은 부분은 양 부분 (C)을 잃었다. (14)에서 수정.ge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 전체 엑솜 시퀀싱 종양 샘플의 (WES) 이전 및 마우스 세포 고갈 (MCD) 15 후 그림. 우리는에 MCD의 영향을 평가하기 위해 인간의 신장, 폐 및 방광암에서 파생 된 세 가지 다른 이종 이식 모델 WES를 실시 차세대 시퀀싱 데이터의 품질. 종양 부피 및 마우스 세포 고갈 후의 절연 종양 세포에서 DNA는 엑솜 캡처 키트 적용 엑솜 캡처 된 서열 라이브러리를 생성하기 위해 사용되었다. 바탕 화면 시퀀서 악기, 바탕 화면 시퀀서 시약 키트 150주기에 순서를 들어, 75 bp의 쌍 엔드 읽 생성하는 데 사용되었다. 클러스터의 밀도를 크게 증가 (p <0.05) (A)뿐만 아니라 AVE33 % (B)의 판독 횟수의 증가 분노 향상 샘플의 품질을 나타내는 마우스 세포 고갈 된 샘플에서 관찰되었다. 대응하여, MCD시 파편과 사균의 강한 환원도 유세포 분석에 의해 입증 될 수있다 (도 3 참조). (15)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 마우스 세포 고갈 (MCD)는 전적으로 잘못 매핑 된 마우스의 수는 전체 엑솜 시퀀싱 (WES) 15 일 이후 읽어 줄입니다. 단백질 코딩 서열의 대상으로 농축에 사용 캡처 올리고 뉴클레오티드는 인간 게놈, 초기 사전을 기반으로 디자인 된 바와 같이 인간 기원의 FR의 DNA 단편의 농축OM 마우스 및 인간 세포의 혼합물을 예상 하였다. 마우스 게놈 DNA와 혼성화 할 수있는 교차 포착 올리고 뉴클레오티드의 수를 평가하기 위해, 우리는 마우스 게놈에 대해 각각 단일 급속 포착 엑솜 프로브의 BLAST 검색을 수행 하였다. 얻어진 정렬 파라미터가 가능한 교차 혼성화를 결정하는 데 사용 하였다. (.. 배향 길이없이 불일치없이 갭) 상기 선택 임계 값에 따라, 우리는 (5)의 교차 - 반응성 예측 - 마우스 성적으로 포획 프로브의 10 % (데이터는 보이지 않음). 어댑터 클리핑 (trimmomatic v0.32 16) 후, 우리는 인간 및 마우스 게놈에 대한 모든 샘플 (광대역 무선 접속 v0.7.12 17)의 읽기 매핑 및 추정 기원은 각각의 정렬 매개 변수에 따라 결정 (리눅스 쉘 명령 줄 펄) (A). 벌크 종양 샘플로부터 유래 읽기 12 %의 평균이 쥐 세포에 기인 하였다. 이 양은 B (마우스 세포의 고갈 전에 0.3 %로 감소 될 수있다 ). 평균 15 %에서와 마우스 유래의 대량 종양 샘플에서 판독 전체의 1.9 %에 해당하는 인간 게놈에 잘못 매핑 판독 격리 암세포 하류 분석에서 마우스 세포 고갈의 강한 긍정적 인 영향 0.04 % 예상 할 수있다.도 6b는 벌크 종양 및 방광 암 이종 유래의 고립 된 인간 종양 세포에 대한 상세한 판독 할당을 예시한다. (15)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 MCD 전적으로 예측 허위의 SNP (15)의 수를 감소. 마우스의 영향을 결정하기 위해 인간 게놈 맵핑 판독 우리 predicte의 수를 결정이전과 MCD 후 이종 이식 샘플 D의 SNP. 더 건강한 조직 비교 수 없었다로서, SNP는 샘플 시퀀스와 기준 게놈 (hg19) 사이의 차이로 정의 하였다. 중복 제거 읽기 후, SNP와 INDEL 전화는 (18)을 실시 하였다 및 엑솜 캡처 키트의 대상 지역으로 제한했다. 모든 SNP를 63 ± 10 %가 벌크 종양 샘플이 더 이상 18 ± 1 %의 단리 된 인간 종양 세포 (A)에 대해 특정 하였다 마우스 세포 고갈 후 검출 하였다 대한 예측. 전자는 주로 잘못 매핑 된 마우스에 의해 발생하는 동안, 후자는 고립 된 인간 종양 세포 샘플에서 높은 읽기 수와 그에 따라 더 높은 범위로 인해 검출 될 듯 읽습니다. 이 효과는 예측 삽입과 삭제 (B) 볼 수 있었다. (15)에서 수정. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
그림 8. MCD는 높은 영향의 예측 SNP를 15 증가합니다. (19)가 예시되어 POLA1 유전자의 단백질 코딩 엑손 내에서 SNP 예측에 MCD의 (A) 영향. 오 매핑 마우스 벌크 신장 암 이종 이식에 잘못 예측 된 SNP를 다수 발생 읽는 동안 이들의 SNP는 MCD 실종 하였다. 또한, MCD는 높은 충격의 SNP의 예측을 개선. 예를 들어, 마우스는 GRIA3 유전자 (B)의 개시 코돈의 잘못 예측 파괴 결과 벌크 종양 샘플에서의 인간 게놈 기준에 매핑 읽는다. (15)에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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마우스 유래의 실리 고갈에 그림 9. 완전 I n은 체외 MCD (15)를 교체 할 수 없습니다 읽습니다.는 계산 시퀀싱 데이터에서 제거 된 마우스의 기원이 될 것으로 예측 읽기 및 SNP 호출을 반복 하였다. 이 방식으로의 SNP의 개수는 (도 8과 비교) 상당의 SNP 총수의 8.5 %로 63 %로 감소 된 벌크 종양 샘플 예측. 그러나 실리 접근 방식이 완전히 개선 된 샘플의 품질과 판독 카운트에 수반 증가와 범위가 고려 특히, 체외 MCD에서 대체 할 수 없습니다. (15)에서 수정."_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
우리는 이종 이식 종양 조직에서 본래 인간 종양 세포를 분리하는 빠르고 쉬운 방법을 개발 하였다. 이 절차는 자동화 조직 해리 자기 세포 분류를 조합하여 마우스 유래의 세포의 광범위한 공 핍층에 기초한다. 모든 마우스 세포와 죽은 세포 파편의 양을 크게 공핍 외에 표적 세포 분획에서 감소된다. 함께 찍은,이 방법은 크게 분자 다운 스트림 분석과 인간 종양 세포의 배양을 향상시킨다.
다른 방법과는 대조적으로, 특정 종양 세포 마커, 마우스 세포 또는 알고리즘의 확립의 조성 변화로 조절 기술에 대한 필요가 없다. 제시된 방법은 마우스 균주 및 종양 유형에 독립적이다. 따라서,는 EpCAM (11)과 같이 표현 다를 수 인간 단일 특정 마커에 기초하여 인간 종양 개체군의 분리를 통해 바이어스 피하기는에디션. 또한,이 종양의 재료에 한정되지 않고, 마우스 세포 대신 특정 인간 종양 개체군의 타겟팅 된 바와 xenotransplanted 조직의 종류에 사용할 수있는 (데이터는 보이지 않음).
마우스 세포의 광범위한 제거가 독점적 마우스 유래의 세포 표면에 발현 된 항원을 표적으로 용이하게된다. 이 외에도 연구에서 제시된 종양 해리의 잘 확립 된 방법에서, 효소의 다른 종류를 사용하여 많은 절차가 있습니다. 세포 표면 에피토프의 보존이 신규 한 방법뿐만 아니라, 인간 종양 세포 집단에 대한 정확한 분석을위한 전제 조건이다. 따라서, 부드러운 효소 종양 조직의 분해에 사용되는 것이 중요하다. 따라서, 마우스 세포 고갈는 분명히 마우스 세포 고갈 절차 중에 표적 에피토프에 영향을 미치지 않는 효소 분해 방법과 조합하여 사용할 수있다. 의심스러운 경우에만 각각의 제조업체에 의해 검증 될 수있다.
이 방법은 인간의 순환 종양 세포 (CTCS) 작동합니다. 그러나, 표적 세포의 빈도가 일반적이기 때문에 <마우스 세포의 0.1 % 탈 추가적으로 기대할 수없고 적혈구 용해하고 50 % 이상의 순도를 필요로한다. 이 경우, 마우스 세포 고갈은 포지티브 마커를 사용하여 농축 하였다 CTCS 사전 농축로서 사용될 수있다 (데이터는 보이지 않음).마우스 세포를 제거하여 현저 마우스 섬유 아세포의 배양 자라다 회피하여 인간 종양 세포의 배양을 향상시킨다. 또한, 차세대 시퀀싱에 의한 인간 종양 이종 이식의 분석은 상당히 향상되고 표준화된다. 타겟 인간 서열 특정 선택은 엑솜 농축 동안 수행 하였지만,이 효과는 관찰 된 바와 같이, 전체 게놈 시퀀싱 전 사체에의 영향은 더욱 눈에 띄는 것으로 예상된다.
또한, 상기 제시된 방법은 ACCURA 용이xenotransplanted 인간의 종양에서 종양 개체군의 테 분자 연구. 두 개의 다른 개체군에서는 인간 종양 세포를 선별 제 1 단계에서 각각의 시료로부터 마우스 세포의 분리 및이어서 벌크 인간 종양 세포 (20)가 관심 종양 모집단 직접 분자량 비교를 가능하게한다. 이 마우스 유래의 분자의 교차 혼성화에 영향되지 않는 종양 세포 아형 사이의 차등 유전자 발현을보다 확실하게 평가할 수있다.
공개 사항
David Agorku, Stefan Tomiuk, Stefan Wild, Silvia Rüberg, Lisa Zatrieb, Andreas Bosio 및 Olaf Hardt는 독일 Miltenyi Biotec GmbH의 직원이거나 직원이었습니다. Kerstin Klingner와 Julia Schüler는 독일 Oncotest GmbH의 직원입니다.
감사의 글
탁월한 기술 지원을 제공해 주신 Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow, Dorothee Lenhard에게 감사드립니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 종양 해리 키트, 인간 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | 는 효소 H, R 및 A를 포함합니다. 재구성 지침은 데이터 시트를 참조하십시오 |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer(70 &마이크로; m) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| 페트리 접시 100mm | 다양한 | ||
| 메스 | 다양한 | ||
| 마우스 세포 고갈 키트 | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | PEB | 완충액에 1x PBS | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | 사용 PEB 완충액에서 2mM의 최종 농도 사용 |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 또는 PEB 버퍼 MACS LS 컬럼에서 5 mg/L BSA 사용 |
| Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
| QuadroMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep 필터 (70 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | 면역형광 염색에 1:40 사용 |
| 안티 비멘틴 항체 | abcam | ab92547 | |
| 염소 안티 마우스 IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| 염소 안티 토끼 IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 0.1 µ의 최종 농도로 희석; 0.1M 중탄산나트륨에 있는 g/ml |
| 내부 염색 키트 | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix는 면역형광 염색 중 고정 단계로 사용할 수 있습니다 |
| FBS | 다양한 | ||
| 트리톤 X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR 차단 시약, 마우스 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq 시약 키트 v3 | Illumina | MS-102-3001 |
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재인쇄 및 허가
