에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Alain Casanova; Shyan H. Low; Mario Emmenlauer; Raquel Conde-Alvarez; Suzana P. Salcedo; Jean-Pierre Gorvel; Christoph Dehio

doi:10.3791/54263

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방법 논문

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험

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DOI:

10.3791/54263

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2016년 8월 5일

Alain Casanova^*¹ , Shyan H. Low^*¹ , Mario Emmenlauer^*¹^,⁴ , Raquel Conde-Alvarez^*¹^,³ , Suzana P. Salcedo² , Jean-Pierre Gorvel² , Christoph Dehio¹

¹Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, ²Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, ³Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, ⁴BioDataAnalysis GmbH

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자에 대한 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 위한 두 가지 분석이 설명됩니다. 진입 분석은 Brucella 진입에 필요한 숙주 인자를 검출하고 종말점 분석은 세포 내 복제에 필요한 숙주 인자를 검출합니다. 대체 접근법에 적용할 수 있지만, HeLa 세포의 siRNA 스크리닝은 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

초록

브루셀라 종은 자연 호스트로 동물을 감염 통성 세포 내 병원균이다. 인간에게 전송은 가장 일반적으로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생되고 심한 만성 감염으로 이어질 수 있습니다.

브루셀라 전문 및 비 전문 식세포의 세포 침입과 소포체 (ER) 유래 액포 내에서 복제 할 수 있습니다. 응급실과 같은 구획 브루셀라 숙주 세포에 진입, 리소좀 분해 회피 및 복제에 필요한 숙주 요인은 거의 알려져 남아있다. 여기에서 우리는 HeLa 세포에서 브루셀라 항목 및 복제에 관련된 호스트 요인을 파악하기 위해이 분석에 대해 설명합니다. 다른 검사 방법을 적용 할 수 있지만 프로토콜은 RNA 간섭의 사용을 설명한다. 분석법은 형광 표지 된 세균의 검출에 사용 자동 형광 표지 된 숙주 세포에 기초와이드 필드 현미경. 형광 이미지는 단일 셀 기반 감염 득점을 허용 CellProfiler에서 표준 이미지 분석 파이프 라인을 이용하여 분석한다.

엔드 분석에서, 세포 내 복제 이틀 감염 후 측정한다. 이 확산 성공적으로 이렇게 강하게 숙주 세포 내에서 증식 할 것이다 세포 내 틈새를 설립 세균 항목입니다. 브루셀라 후 12 시간의 주위에 시작되는 자신의 복제 성 틈새 트래픽에 박테리아를 할 수 있습니다. 세포 내 박테리아가 크게 개별 세포 또는 세포 비 - 복제 성 박테리아를 능가하기 때문에, 구조적으로 GFP를 발현하는 균주를 사용할 수있다. 강한 GFP 신호는 감염된 세포를 식별하기 위해 사용된다.

대조적으로, 엔트리 분석을 위해 세포 내 및 세포 외 박테리아를 구별하는 것이 필수적이다. 여기에서, 테트라 사이클린 - 유도 GFP에 대한 변형 부호화가 사용된다. 유도겐타 마이신에 의한 세포 외 박테리아의 불 활성화와 동시에 GFP의 세포 내 박테리아 GFP를 발현 할 수있는 함께 세포 및 GFP 신호에 기초하여 박테리아 세포의 분화를 가능하게한다. 세포 내 증식이 시작되기 전에이 단일 세포 내 박테리아의 강력한 탐지 할 수 있습니다.

서론

브루셀라 종은 α-프로 테오 박테리아의 클래스에 속하는 그람 음성, 통성 세포 내 병원균이다. 그들은 이러한 풍토 지역에서 심각한 경제적 손실을 초래 소, 염소, 또는 양 등 자연 호스트에서 낙태와 불임의 원인. 브루셀라 병은 전 세계적으로 매년 50 만 새로운 인간 감염 ¹ 위에 일으키는 가장 중요한 인수 공통 질병 중 하나입니다. 인간에 전송 가장 일반적으로 이러한 저온 살균하지 않은 우유로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생합니다. 열성 질환의 증상은 브루셀라 병의 진단에 어려움이 발생하는 불특정입니다. 처리되지 않은 경우, 환자는 관절염, 심내막염, 및 신경 ^병증이 같은 더 심각한 증상으로 만성 감염을 개발할 수 있습니다.

세포 수준에서 브루셀라 식세포는 비 식세포에 침입 할 수 있으며, 세포 내에서 복제브루셀라 함유 공포 (BCV)라고 함. 박테리아의 내면화는 라 세미,의 Rho와 Cdc42 ^3의 직접적인 활성화에 의해 액틴 세포 골격의 재 배열이 필요합니다. 진핵 숙주 세포 내부에서 BCV는 세포 내 이입 경로를 따라 트래 피킹과 리소좀과의 상호 작용에도 불구하고, 세균 분해 ^{4 않....}