방법 논문

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험 브루셀라 HeLa 세포의 감염

DOI:

10.3791/54263

⸱

2016년 8월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, 3Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, 4BioDataAnalysis GmbH

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자에 대한 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 위한 두 가지 분석이 설명됩니다. 진입 분석은 Brucella 진입에 필요한 숙주 인자를 검출하고 종말점 분석은 세포 내 복제에 필요한 숙주 인자를 검출합니다. 대체 접근법에 적용할 수 있지만, HeLa 세포의 siRNA 스크리닝은 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

초록

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브루셀라 종은 자연 호스트로 동물을 감염 통성 세포 내 병원균이다. 인간에게 전송은 가장 일반적으로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생되고 심한 만성 감염으로 이어질 수 있습니다.

브루셀라 전문 및 비 전문 식세포의 세포 침입과 소포체 (ER) 유래 액포 내에서 복제 할 수 있습니다. 응급실과 같은 구획 브루셀라 숙주 세포에 진입, 리소좀 분해 회피 및 복제에 필요한 숙주 요인은 거의 알려져 남아있다. 여기에서 우리는 HeLa 세포에서 브루셀라 항목 및 복제에 관련된 호스트 요인을 파악하기 위해이 분석에 대해 설명합니다. 다른 검사 방법을 적용 할 수 있지만 프로토콜은 RNA 간섭의 사용을 설명한다. 분석법은 형광 표지 된 세균의 검출에 사용 자동 형광 표지 된 숙주 세포에 기초와이드 필드 현미경. 형광 이미지는 단일 셀 기반 감염 득점을 허용 CellProfiler에서 표준 이미지 분석 파이프 라인을 이용하여 분석한다.

엔드 분석에서, 세포 내 복제 이틀 감염 후 측정한다. 이 확산 성공적으로 이렇게 강하게 숙주 세포 내에서 증식 할 것이다 세포 내 틈새를 설립 세균 항목입니다. 브루셀라 후 12 시간의 주위에 시작되는 자신의 복제 성 틈새 트래픽에 박테리아를 할 수 있습니다. 세포 내 박테리아가 크게 개별 세포 또는 세포 비 - 복제 성 박테리아를 능가하기 때문에, 구조적으로 GFP를 발현하는 균주를 사용할 수있다. 강한 GFP 신호는 감염된 세포를 식별하기 위해 사용된다.

대조적으로, 엔트리 분석을 위해 세포 내 및 세포 외 박테리아를 구별하는 것이 필수적이다. 여기에서, 테트라 사이클린 - 유도 GFP에 대한 변형 부호화가 사용된다. 유도겐타 마이신에 의한 세포 외 박테리아의 불 활성화와 동시에 GFP의 세포 내 박테리아 GFP를 발현 할 수있는 함께 세포 및 GFP 신호에 기초하여 박테리아 세포의 분화를 가능하게한다. 세포 내 증식이 시작되기 전에이 단일 세포 내 박테리아의 강력한 탐지 할 수 있습니다.

서론

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브루셀라 종은 α-프로 테오 박테리아의 클래스에 속하는 그람 음성, 통성 세포 내 병원균이다. 그들은 이러한 풍토 지역에서 심각한 경제적 손실을 초래 소, 염소, 또는 양 등 자연 호스트에서 낙태와 불임의 원인. 브루셀라 병은 전 세계적으로 매년 50 만 새로운 인간 감염 1 위에 일으키는 가장 중요한 인수 공통 질병 중 하나입니다. 인간에 ​​전송 가장 일반적으로 이러한 저온 살균하지 않은 우유로 감염된 동물과 직접 접촉하거나 오염 된 음식의 섭취에 의해 발생합니다. 열성 질환의 증상은 브루셀라 병의 진단에 어려움이 발생하는 불특정입니다. 처리되지 않은 경우, 환자는 관절염, 심내막염, 및 신경 병증이 같은 더 심각한 증상으로 만성 감염을 개발할 수 있습니다.

세포 수준에서 브루셀라 식세포는 비 식세포에 침입 할 수 있으며, 세포 내에서 복제브루셀라 함유 공포 (BCV)라고 함. 박테리아의 내면화는 라 세미,의 Rho와 Cdc42 3의 직접적인 활성화에 의해 액틴 세포 골격의 재 배열이 필요합니다. 진핵 숙주 세포 내부에서 BCV는 세포 내 이입 경로를 따라 트래 피킹과 리소좀과의 상호 작용에도 불구하고, 세균 분해 4 않....

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프로토콜

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참고 : 라이브 브루셀라 아 보르 투스 균주 모든 작업이 필요한 모든 규정 및 안전주의 사항을 고려 바이오 안전성 레벨 3 (BSL3) 실험실 내에서 수행해야합니다.

1. 심사 플레이트의 제조 및 박테리아와 세포의 배양

  1. 브루셀라 아 보르 투스 스타터 문화의 준비
    1. 킬 브루셀라 50 μg의 / ㎖ 카나마이신 (TSA / km)을 포함 트립신 콩 한천 (TSA) 접시에 -80 ° C 우유 재고 2308 (B. 보르 투스) 보르 투스. 37 ° C 3-4 일 동안 판을 품어. 항목 분석을 위해 2308 pJC43 (apHT :: GFP) 보르 투스 변형 브루셀라 엔드 포인트 분석 13 및 변형 브루셀라 아 보르 투스 pAC042.08 (apht ::을 DsRed, TETO :: tetR-GFP)를 사용합니다.
      참고 : 브루셀라 아 보르 투스의 부드러운 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)의 중요한 독성 결정하지만 거친 돌연변이가 상대적으로 높은 주파수 (14)에서 발생할 수 있....

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결과

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도 1a는 자동으로 엔드 분석에서 감염된 세포를 식별하는 데 사용되는 이미지 분석의 일례를 나타낸다. DAPI 염색 HeLa 세포의 핵이 확인되었고, 25 픽셀 핵 연장하여 핵 주위 8 화소의 폭 조갑 핵 및 보로 노이 셀 바디를 산출 하였다. 박테리아가 주로 조갑 핵 공간 확산 때문에, 셀이 영역에서 강도 GFP 감염 및 비감염 세포를 구별 할 수있는 가장 강력한 측정이다. 일부 경우에 세균이 핵으로 큰 정도에 조갑 핵 또는 오버레이 외부 증식 발견된다. 따라서, 두 개의 추가 오브젝트는 감염된 세포의 식별을 고려 하였다. 분할뿐만 아니라 GFP 강도 측정은 화상 해석 소프트웨어 CellProfiler이 수행되었다.

브루셀라 3의 성공적인 침략을위한 굴지의 재 배열이 필요합니다. 따라서, 굴지 리모델링 .......

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토론

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박테리아 병원체는 진핵 숙주 세포를 자신에게 유리하게 조작하기 위한 수많은 전략을 진화시켰습니다. 급성 감염을 일으키는 병원체는 종종 면역 체계의 심각한 경각심과 감염된 세포의 생존력 상실을 동반하는 급속한 증식을 보입니다. 대조적으로, 만성 감염을 일으키는 브루셀라 및 기타 병원체는 숙주 세포 내에서 오래 지속되는 상호 작용을 확립합니다. 따라서 박테리아는 세포 항상성을 방해하지 않고 숙주 세포 기능을 미세 조정해야 합니다. 게놈 규모에서 감염 과정에 관여하는 숙주 세포 인자를 식별하기 위한 일반적인 전략은 예를 들어 감염의 기능적 판독과 결합된 siRNA에 의한 체계적인 유전자 고갈을 사용하는 것입니다. 여기에서는 형광 박테리아 검출을 기반으로 한 고함량, 고처리량 스크리닝에 적합한 프로토콜을 제시합니다.

성공적인 대규모 스크리닝의 중요한 측면은 강력한 자동 이미지 분석 및 감염 점수와 관련이 있습니다. 여기에 설명된 방법은 일반적으로 매우 강력한 DAPI 염.......

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 작업은 SystemsX.ch Swiss Initiative for Systems Biology의 틀에서 각각 연구 및 기술 개발(RTD) 프로젝트 InfectX 및 TargetInfectX에 대한 51RT 0_126008 및 51RTP0_151029 보조금의 지원을 받았습니다. 스위스 국립과학재단(SNSF)의 보조금 310030B_149886 인정합니다. S.H.L과 A.C.의 연구는 Biozentrum의 국제 박사 과정 "Fellowships for Excellence"의 지원을 받았습니다. Simone Muntwiler는 기술 지원을 인정받았습니다. pNF106을 제공해 주신 Dirk Bumann님과 pJC43 및 pJC44를 제공해 주신 Jean Celli님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
트립틱 소이 한천 (TSA)BD236950
트립틱 소이 국물 (TSB)Fluka22092
카나마이신 설페이트시그마-알드리치60615
탈지유
250ml 스크류 캡 병코닝8396
DMEM시그마-알드리치D5796
태아 송아지 혈청(FCS)Gibco10270열 비활성화
트립신-EDTA (0.5%)Gibco15400-05410x 원액, PBS에서 1:10 희석
Scepte 2.0 세포 계수기Merck MiliporePHCC20060대체 세포 계수 장치 사용 가능
Greiner CELLSTAR 384웰 플레이트Sigma-AldrichM2062
박리 가능한 알루미늄 호일Costar6570
시약 디스펜서: "Multidrop 384 시약 디스펜서"Thermo Scientific5840150대체 시약 디스펜서를 사용할 수 있습니다.
트랜스펙션 시약: "Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen13778-150
자동 플레이트 세척기: "플레이트 세척기 ELx50-16"BioTekELX5016이 플레이트 세척기에는 384웰 플레이트에 적합한 16채널 매니폴드가 포함되어 있습니다. 생물 안전 캐비닛에 맞고 세척 중 플레이트를 덮는 뚜껑이 있어 에어로졸 생성의 위험을 줄입니다. 유사한 기능을 가진 대체 플레이트 와셔를 사용할 수 있습니다.
겐타마이신, 시그마-알드리치G1397
안히드로테트라사이클린, 염산염시그마-알드리치37919100 μ 100% 에탄올에 있는 g/ml 해결책은 -20°C에 유지된다; C 알루미늄 호일
PBSGibco20012
파라포름알데히드시그마-알드리치P61480.2m hepes 완충액, pH 7.4에 용해 빛으로부터 보호. -20 °에서 보관하십시오. C는 사용 전날 갓 해동합니다. 주의: PFA는 흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 독성이 있습니다.
HEPES시그마-알드리치H3375
트리톤 X-100시그마-알드리치T9284
DAPI로슈10236276001
스크램블 siRNADharmaconD-001810-10
Kif11 siRNADharmaconL-003317-00
ARPC3 siRNADharmaconL-005284-00
Brucella abortus 2308
pJC43 (apHT::GFP)Celli et al.12
pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)Construction: pJC44 4를 EcoRI로 절단한 후 Klenov 효소로 뭉툭한 말단을 생성하고 SalI로 절단했습니다. TetR-GFP는 프라이머 prAC090 및 prAC092를 사용하여 pNF106으로부터 증폭되었습니다. SalI로 분해한 후, TetR-GFP 생성물을 절단된 pJC44 벡터에 연결시켰다.
프라이머 prAC090Sigma-AldrichTTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC GAA ACC
프라이머 prAC092Sigma-AldrichTTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT TC
HeLa CCL-2ATCCCCL-2
ImageXpress 마이크로분자 장치 IXM IMAGINGMSCOPE 정밀 전동 Z-스테이지가 장착된 자동 세포 이미징 현미경. 자동 현미경 검사를 위한 대체 시스템과 아래에 명시된 하드 및 소프트웨어를 위한 대체 구성 요소를 사용할 수 있습니다.
고속 레이저 자동 초점분자 장치 1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X objectiveNikon MRF00100N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC 프리즘: 10X, 스프링 장착
광도 CoolSNAP HQ 흑백 CCD 카메라분자 장치 1-2300-10601,392 x 1,040 이미징 픽셀, 6.45 x 6.45 &마이크로; m 픽셀, 12비트 디지털화
MetaXpress 소프트웨어분자 장치 9500-0100
LUI-Spectra-X-7LumencorSPECTRA X V-XXX-YZ라이트 엔진. 다음과 같은 광원이 사용됩니다 : 보라색 (DAPI), 청록색 (GFP), 녹색 / 노란색 (RFP)
DAPISemrockFF01-377 / 50-25
대역 익사이터 DAPI 용 단일 대역 방출기SemrockFF02-447 / 60-25
DAPI 용 단일 대역 이미터 DemrockFF409-DI03-25x36
SemrockFF02-472 / 30-25
용 단일 대역 익사이터GFPSemrockFF01-520/35-25
GFPSemrockFF495-DI03-25X36
단일 밴드 이미터, RFPSemrockFF01-562/40-25
단일 밴드 이미터, RFPSemrockFF01-624/40-25
단일 밴드 이미터, RFPSemrockFF593-DI03-25x36
, , , , , 용 단일GFP 용 단일 밴드 이미터용 용 용 용 단일 밴드 이미터,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
  2. Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their ....

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