이 문서에서는 질량 세포 분석을 위한 샘플 수집 및 처리에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
질량은 세포 계측법 중금속 라벨, 잘 세포 계측법 기존의 형광 기반의 흐름을 가능한 것 이상으로 매개 변수와 깊은 분석을위한 기회의 수를 크게 증가하고있다 접근 방식으로 결합하는 항체를 사용합니다. 새로운 기술로서, 고품질 데이터의 안정적인 발전을 보장 중요한 단계가 있습니다. 질량 계측법 분석 세포 샘플의 처리를 위해 다수의 기술을 통합 최적화 프로토콜은 여기에 제시 하였다. 여기에 설명 된 방법은 사용자가 일반적인 실수를 방지하고 데이터의 부정확성을 초래할 수 변동을 최소화함으로써 일관된 결과를 달성 할 수 있도록한다. 실험 설계를 알리려면, 프로토콜 및 조사되고 시스템의 생물학의 새로운 연구 결과를 폭로에서의 효능에 옵션 또는 대체 단계 뒤에있는 근거가 덮여있다. 마지막으로, 대표 데이터는 기법 presente 예상 결과를 설명하기 위해 제시여기 거라고.
서론
세포 계측법은 세포의 큰 개체군에 걸쳐 단일 세포 수준에서 여러 항체 표적의 동시 측정을 가능하게한다. 전통적인 형광 계 유동 세포 계측법으로 정량화 될 수있는 매개 변수의 수는 파라미터의 수가 증가함에 따라 점점 더 복잡한 보정 계산을 필요로 여러 형광체의 발광 스펙트럼과 스펙트럼 오버랩에 의해 제한된다. 이러한 제한은 중금속 복합 항체가 검출 크게 동시에 수집 매개 변수의 수를 확장하고 각 셀의 고차원 단백질 풍부 프로파일을 수득 비행 (TOF) 질량 분석 시간 정량화 질량 계측법에 의해 다루어진다.
악기 세포 계측법 질량의 동작의 기본적인 이해는 사용자에게 유용 및 문제 해결에 필수적인 수 있습니다. 보다 철저한 튜닝의 설명과 대량 세포 계측법 기계를 실행하는 경우,관련 원고 1 참조. 간략하게, 세포 시료를 세포 표면 마커, 세포질 단백질, 핵 단백질, 염색질 - 결합 단백질 또는이자 (도 1I)의 다른 에피토프를 표적 금속 복합 항체의 패널로 라벨링된다. 표지 된 세포는 오토 샘플러를 사용하여 컴퓨터 상에 로딩이든 수동 주입하여 한 번에 하나되는 96- 웰 플레이트의 샘플. 로드 셀은 셀 (도 1II)를 봉입 액 적의 분무를 생....
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프로토콜
1. 세포 수확
- 주요 조직에서 수확 세포
참고 : 주요 조직에서 채취 세포에 대해 설명하는 과정은 마우스 유방 종양 조직에 구체적으로 적용되며 다른 소스의 주요 조직에 그대로 적용되지 않을 수 있습니다.- 5 mg을 히알루 조직의 그램 당 10 ㎖의 DMEM / F12 배지에서 30 mg을 용해시킴으로써 콜라게나 제를 분해 완충액을 준비하는 처리한다. 소화 버퍼를 소독 필터.
- 마우스와 기록 종양 무게에서 주요 유선 종양을 분리합니다.
- 적어도 5 분 동안 # 10 메스와 조직을 말하다.
- 분해 완충액 (조직의 그램 당 10 ㎖의 완충액)의 적절한 부피 다진 조직을 추가한다.
- 37 ℃에서 1-3 시간 동안 100 rpm으로 소화 버퍼 다진 조직을 흔들어.
- 50 ㎖의 튜브에 0.4 ㎛의 필터를 통해 세포를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻는.
- 39 °에서 10 분 동안 원심 분리기 (300) XG 세포;기음. 가만히 따르다거나 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
- 재현 탁의 4 mL의 DMEM / F12에서 펠릿 5 ㎖ 둥근 바닥 튜브에 전달.
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결과
여기에 제시된 프로토콜은 광범위 약간만 변형 배양 및 일차 전지 샘플의 다양한 적용 할 수있다. 이러한 바코드 또는 세포 표면 염색과 같은 특정 구성 요소가 필요하지 않은 경우의 실험 조건에 따라,이 모듈 형 방식으로 수행 될 수있다. 전체 이용이 프로토콜은 사균 배제 S 상 인구 식별 표지 최대 38 개 항체 타겟의 정량 시료 염색 계측법 다중화 질량의 제조를 가능하게한다.
이 프로토콜 (도 2)에서 설명하는 방법에 의해 제조 된 기대 결과를도 3에 도시된다. 데이터를 수집하면, 교정 비드 강도에 기초하여 신호 강도의 정규화 질량 계측법 소프트웨어에서 수행 될 수있다. 정상화 후, 초기 데이터 proce을단일 세포 교정 비즈 게이트를 제거하고 죽은 세포를 제거하기 ssing 데이터는 유세포 분석을 .......
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토론
여기에 제시된 프로토콜이 성공적으로 다양한 배양 된 세포주 (H1 및 H9 hESCs는, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) 및 주 조직 샘플 (마우스 골수, 마우스 배아 간 마우스 성인의 처리를 위해 사용되어왔다 간, 마우스 종양). 관계없이 소스, 휴대 상태를 유지하면 세포 계측법 질량 분석 의무해야하지만, 어떤 프로토콜 최적화해야하는 동안 하나의 세포로 해리 될 수있는 조직. 몇 가지 항원이 사용되는 특정 해리, 고정 및 permeabilization 치료에 의해 영향을받을 수 있으며, 이러한 방법은 샘플 별 최적화를 받아야 할 필요가 있으므로주의하는 것이 중요하다. 낮은 신호는 항체에 대해 관찰되는 경우는, 생균의 세포 표면 라벨링을 행하는 방법을 permeabilization 변경 또는 고정 시간을 감소시킴으로써 개선시킬 수있다.
가능하면 실험 설계에서, 일에 바코드를 포함하여즉 시료 처리 흐름 세포와 항체의 농도 수준에서 샘플.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Barton 실험실에서의 연구는 텍사스 암 예방 및 연구소(CPRIT RP110471)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299의 Ryan L. McCarthy를 위한 교육 보조금 펠로우십의 지원을 받았습니다. 질량 세포 분석 기계를 유지 및 운영하는 핵심 시설은 CPRIT 보조금(RP121010) 및 NIH 코어 보조금(CA016672)의 지원을 받습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| mTeSR1 중간 키트 | 줄기세포 기술 | 05850 | 사용 전 실온에서 따뜻하게 |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | 37 에서 따뜻하게; &데그; C 사용 전 |
| Accutase | Stem Cell 기술 | 07920 | Warm at 37 &데그; C 사용 전 |
| 소 혈청 알부민 | Equitech | BAH62 | |
| 인산염 완충 식염수 | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | 1 에서 제공; mM | |
| cell ID pt195 | 플루이디엄 | 1 mM | |
| cell ID pt196 | fluidigm | 제공 1 mM | |
| 시스플라틴 | 엔조 생명 과학 | ALX-400-040-M250 | 25 에 용해; DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd 바코드 키트 | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | 용해성 74 0.2 의 mg/mL; N NaOH |
| 로듐 103 삽입제 | Fluidigm | 201103A | |
| 메탄올 | 피셔 | BP1105-4 | -20 에서 냉각; &데그; C 사용 전 |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5 mL 라운드 바닥 튜브 | Falcon | 352058 | |
| 5 mL 35 μ m 필터 캡 튜브 | Falcon | 352235 | |
| EQ 4 요소 교정 비드 | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해 | 효소 Sigma-Aldrich | C9891 | |
| 일회용 메스 # 10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
참고문헌
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015....
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재인쇄 및 허가
