방법 논문

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

DOI:

10.3791/54397

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2016년 8월 13일

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1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

이 논문에서

요약

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유체 구성 요소와 통합된 미세 가공 장치는 생체 내 미세 환경을 모방한 세포 연구를 위한 체외 플랫폼을 제공합니다. 우리는 단일 또는 공존하는 화학적/전기적/전단 응력 자극 하에서 세포 반응을 연구하기 위해 폴리메틸메타크릴레이트 기반 미세유체 칩을 개발했습니다.

초록

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미세 유체 장치의 pH, 온도, 염농도, 다른 물리적 또는 화학적 자극을 정밀하고 제어 가능한 세포 미세 환경을 조성 할 수있다. 이들은 일반적으로 주변 같은 생체 내에서 제공하여 시험 관내 세포의 연구를 위해 사용되어왔다. 이러한 현상은 세포의 특성과 기능을 이해하는데 중요하기 때문에 특히, 세포가 화학 그라디언트, 전기 필드 및 전단 응력에 대응하여 얼마나 많은 관심을 받고있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기판, 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 기판에 제작 될 수있다. 이들 재료 중에서, PMMA 기판을 저렴하고 간편하게 레이저 어블 및 기입을 사용하여 처리 될 수있다. 몇 마이크로 유체 장치는 다수의 화학 물질을 생성하는 전기 자극을 공존 설계 및 제작 하였지만, 이들 중 어느 것도 고려되지 않았다충분히 목적을 선별 특히 실험적인 반복을 감소 시키는데 효율적입니다. 이보고에서는, 단일 또는 공존 화학적 / 전기적 / 전단 스트레스 자극에 따라, 반응성 산소 종의 생산 및 마이그레이션에, 세포 반응을 조사하는 두 PMMA 계 미세 유체 칩 우리의 설계 및 제작을 설명한다. 첫 번째 칩은 다섯 상대 농도를 생성 0, 1/8, 함께 각 영역 내에서 생산되는 전단 응력 구배와 문화 지역에서 1/2, 7/8, 1,. 두 번째 칩은 있지만, 각 문화 영역 내에서 생성 된 다섯 가지의 전계 강도와 같은 상대적으로 농도를 생성합니다. 이러한 장치는 정확하고 제어 가능한 마이크로 - 셀 환경을 제공 할뿐만 아니라, 매우 실험 처리량을 증가시키지.

서론

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생체 내 세포 외 기질 (ECM), 탄수화물, 지질 및 기타 생체 세포를 포함하는 다양한 둘러싸여있다. 그들은 각종 성장 인자의 화학 그라디언트에 ECM과의 상호 작용 및 응답으로 마이크로 환경 자극에 반응하여 기능화. 세포 및 시약의 소비가 크고 세포 환경 (비순환) 고정 성장할 여기서 전통적으로, 시험 관내 세포 연구 세포 배양 접시에서 수행된다. 최근, 유체 구성 요소와 통합 마이크로 제조 장치는 더 많은 제어 방식으로 세포 연구에 대한 대안 플랫폼을 제공하고 있습니다. 이러한 장치는 세포 및 시약의 소비를 최소화하면서 화학적 및 물리적 자극의 정확한 미세 환경을 조성 할 수있다. 이 마이크로 유체 칩은 유리 기판, 실리콘 웨이퍼, 폴리 디메틸 실록산 제조 될 수있다 (PDMS) 중합체, 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 기재 또는 polyethylenetere프탈레이트 (PET)를 1-3 기판들. PDMS 기반 디바이스는 장기간 세포 배양 및 연구에 적합하게 투명 생체 적합성 및 기체 투과성이다. PMMA 및 PET 기판을 레이저 제거와 쓰기를 사용하여 처리 할 저렴하고 쉽습니다.

미세 유체 장치는 세포가 서로 다른 화학적, 물리적 자극에 될 수 있습니다 안....

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프로토콜

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1. 칩 설계 및 제조

  1. 그리기 패턴은 상용 소프트웨어 (24)를 사용하여 PMMA 기판 및 양면 테이프에 절제합니다.
    1. 다섯 배양 영역 (도 1a 및도 1b)의 각각의 말단에 가변 폭의 "크리스마스 트리"패턴을 그리는, 화학 농도 및 전단 응력의 ​​효과를 연구한다.
    2. 소금 교량이 더 유체 채널 (그림 2A와 2B)와 "크리스마스 트리"패턴을 그려, 화학 물질 농도와 전기장의 효과를 연구합니다.
  2. 스크 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 시트 또는 CO 2 레이저 스크 라이버에 해당 파일을로드하여 양면 테이프의 개별 패턴입니다.
    1. 레이저 스크 라이버를 켜고 컴퓨터와의 연결을 확인합니다. 패턴을 열고하면 상용 소프트웨어를 사용하여 절제합니다.
    2. 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 시트 또는 양면 테이프 (을)를 배치스크 라이버의 무대 n 개의 탑. 교정 바와 가시 He-Ne 레이저를 사용하여 필요에 CO 2 레이저의 초점을 조정한다.
    3. PMMA 시트 또는 테이프에 절제의 스크 라이버로 ....

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결과

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화학 전단 응력 (CSS) 칩

CSS의 칩이 양면 테이프를 통해 함께 연결된 세 PMMA 시트 두께 1mm 각, 두께가 0.07 mm (도 1A 및 1B) 각각에 형성된다. 은 "크리스마스 트리"구조는 0의 다섯 상대 농도를 생성 1/8, 다섯 문화 분야에서 1/2, 7/8, 1. 체적 유량, 유체 점도 및 유체 채널의 사이즈에 관련된 크기로, 삼각형, 전단 응력 구배로 배양 영역을 설계함으로써, 각 영역 내에서 생성된다. 이 칩은 배양 폐암 CL1-5 세포 배양 접시에, 또 0.07 mm 두께의 양면 테이프로 부착하고, ROS의 생성은 다른 화학적 농도 및 전단 응력에 응답하여 관찰 하였다. 폐암 세포 내 ROS의 생성은 고도의 LU와 관련된NG 암 전이 개발 및 특정 화학 전단 응력은 ROS의 생.......

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토론

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PMMA 계 칩보다 복잡한 소프트 리소그래피를 필요 PDMS 기반의 칩에 비해 저렴하고 쉬운 방법이다 레이저 어블 및 기입을 사용하여 제조된다. 미세 유체 칩을 설계 한 후, 제조 및 조립은 5 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 주의 실험을 수행에 지급해야 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 "부착"문제이다. 어댑터는 칩의 최상위 계층에 제대로 붙어해야합니다. 너무이인가되면 접착제 유체 채널로 누출 수 있고, 너무 적은 접착제가 사용되는 경우, 액체는 칩 밖으로 유출 할 수있다. 또한, 상기 PMMA 기판과 양면 테이프를 조립할 때, 그 액체 누출을 방지하기 위해 밀접 전체 칩을 눌러 압력을 적용하는 것이 중요하다. 두 번째는 "버블"문제이다. 기포를 제거하기 위해, 1X PBS 연속 20 μL / 분의 유속으로 1 또는 2 분 동안 유체 채널로 유입 된 후, 상기 칩은 P이고37 ° C에서 하룻밤 5 % CO 2에서 인큐베이터 안에 레이스. 유체 채널 내에 남아.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 계약 번호에 따라 대만 과학기술부의 재정 지원을 받았습니다. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), 아니오. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) 및 National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). 저자는 또한 세포 배양실을 사용한 국립 대만 대학의 신흥 재료 및 첨단 장치 센터(Center for Emerging Material and Advanced Devices)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092세포 배양 배지
TrypsinGibco25300-054접시에서 세포 분리
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10082147세포 배양 배지
10 cm 세포 배양 Petri dishNunc150350세포 배양
Bright-Line  헤마사이토미터 시그마Z359629세포 계수 장비
PMMA맞춤형미세유체 칩
어댑터맞춤형미세유체 칩
0.07/0.22mm 양면 테이프 3M8018/9088미세유체 칩
저융점 아가로스시그마A9414솔트 브릿지
2'-7'-디클로로디하이드로플루오레시스 디아세테이시그마D6883세포 내 ROS 측정
인듐 주석 산화물 (ITO) 유리Merck300739히터
비례-통합-파생 컨트롤러 JETEC 전자 (주)TTM-J4-R-AB온도 컨트롤러
열 커플러TECPELTPK-02A온도 컨트롤러
CO2 레이저 스크라이버레이저 도구 및 테크닉스 코퍼레이션ILS2미세유체 칩 제조
주사기 펌프New EraNE-300펌핑 매체 및 화학 물질을 칩에
전원 공급 장치주요 과학 MP-300V직류 공급
도립 현미경 OlympusCKX41세포 이동 모니터링
거꾸로 형광 현미경NikonTS-100모니터링 세포 이동 및 형광 신호 DSLR
카메라Canon60D명시야 이미지 기록 
CCD 카메라NikonDS-Qi1형광 이미지 녹화 
슈퍼 접착제3M 스카치7004PMMA 기판에 어댑터 부착
AutoCADAutodesk Inc.미세유체 칩 설계
DMSOSigmaD8418용해 DCFDA
ImageJNational Institutes of Health광 강도 및 세포 이동 정량화
트 주입 , 형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B.

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