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방법 논문

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

11K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54445

⸱

2016년 10월 7일

 ,  , 
1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

이 논문에서

요약

세포 및 약물 전달을 위한 장치로서 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 알킨 변성 폴리아크릴산(PAA)과 RGD-아지드 유도체 사이의 구리 촉매 알카인-아지드 고리첨가(CuAAC)가 포함됩니다. 하이드로겔은 마이크로파 보조 중축합을 사용하여 형성되며 물리화학적 특성이 조사됩니다.

초록

고분자를 생체 재료로 사용하면 치료 응용 분야에서 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 특히, 생체 적합성, 기계적 특성 또는 세포 생존력을 개선할 수 있는 화합물로 고분자 사슬을 변형하고 기능화할 수 있는 가능성은 생물 의학 분야의 새로운 과제를 해결할 수 있는 새로운 재료의 설계를 가능하게 합니다. 고분자 기능화 전략을 통해 클릭 화학은 고분자 장치의 세포 호환성 및 약물 전달 특성을 개선하는 강력한 도구입니다. 이와 유사하게, 생물학적 환경의 독성 또는 오염과 같은 잠재적인 부작용을 피하기 위해 멸균 도구를 사용해야 하는 생물 의학의 근본적인 필요성은 마이크로파 지원 전략에 대한 관심을 불러일으키고 있습니다.

클릭 화학과 마이크로파 지원 방법의 조합은 생체 의학 응용 분야에서 원하는 기능과 향상된 성능을 가진 생체 적합성 하이드로겔을 생산하는 데 적합합니다. 이 연구는 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하는 것을 목표로 합니다. RGD(아르기닐글리실아스파르트산)는 세포 접착 단백질을 모방하고 세포 표면 수용체에 결합하여 하이드로겔의 3D 고분자 네트워크 내에서 세포를 위한 쾌적한 미세환경을 만들 수 있는 트리펩타이드입니다. RGD 기능화는 Huisgen 1,3-쌍극자 고리추가(huisgen 1,3-dipolar cycloaddition)를 통해 발생합니다. 일부 PAA 카르복실기는 알킨 부분으로 변형되는 반면, RGD는 펩타이드 서열의 말단 잔기로서 아지도산으로 기능화됩니다. 마지막으로, 두 제품 모두 펩타이드를 PAA에 영구적으로 연결하기 위해 구리 촉매 클릭 반응에 사용됩니다. 이 변형 중합체는 카보머, 아가로스 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 함께 사용되어 하이드로겔 매트릭스를 합성합니다. 3D 구조는 마이크로파 보조 중축합을 통해 PAA의 카르복실기와 아가로스 및 PEG의 카보머 및 하이드록실기를 포함하는 에스테르화 반응으로 인해 형성됩니다. 겔화 메커니즘의 효율성은 높은 수준의 RGD 기능화를 보장합니다. 또한 이 기능화된 네트워크 내에서 치료용 화합물 또는 생물학적 도구를 로드하는 절차는 매우 간단하고 재현 가능합니다.

서론

하이드로 겔은 천연 또는 합성, 및 독특한 입체 구조 특징 친수성 가교 중합체에 의해 형성되는 삼차원 네트워크이다. 이 장치는 약물 전달, 조직 공학, 유전자 사업자와 스마트 센서 1, 2의 생물 의학 분야에서 점점 더 매력적이다. 실제로, 높은 수분 함량뿐만 아니라 유동 학적 및 기계적 특성들에게 연조직 미세 환경을 모방 수용성 사이토킨 또는 성장 인자의 전달을 위해 그들에게 효과적인 도구를 만들기에 적합한 후보를 만든다. 가장 유망한 사용 중 하나는 세포 및 생물 활성 화합물을 담지 주사 생체 같다. 생체 외 및 생체 내 실험 3,4에서 관찰 하이드로 겔은 잡고 정확하게 생리 관련 방식으로 줄기 세포 규제 신호를 제공함으로써 세포 생존 및 제어 줄기 세포 운명을 향상시킬 수 있습니다. 이것의 주요 장점은 가능성신체를 통해 모든 마이그레이션 및 대상 목표 (5)를 잃고, 순환 토런트로 지역과 extravasates 잎 세포의 양을 최소화 (현장에서) 접종의 영역 내 주입 된 세포를 유지합니다. 삼차원 네트워크 하이드로 겔의 안정성은 고분자 사슬 6 간의 공유 결합 또는 응집력에 의해 형성의 가교 부위에 기인한다.

이 프레임 워크에서는 직교 선택적 화학 고분자 사슬에 적용이 하이드로 겔 공연 (7)을 개선 할 수있는 다목적 도구입니다. 실제로, 적절한 화학기를 갖는 중합체의 변형은 세포 생존 및 조직 형성에서의 사용을 향상시키기 위해 적절한 화학적, 물리적 및 기계적 성질을 제공하도록 도울 수있다. 동일한 방식으로, 기술 중 RGD 펩티드의 사용은 세포 부착 및 생존율의 개선을 허용 겔 매트릭스 내에 세포 성장 인자를로드한다. RGD는 구성된 트리 펩티드이다지금까지 아르기닌, 글리신, 아스파르트 산, 가장 효과적인 인해 종종 하나 이상의 세포 부착 수용체를 처리 할 수있는 능력 및 세포 정박 동작 생존 8,9에 생물학적 충격 트리 펩티드를 사용. 본 연구에서는 RGD-작용 하이드로 겔의 합성은 친절 세포 미세 환경에 대한 충분한 생화학 적 특성을 특징으로 네트워크를 설계하는 목적으로 연구되고있다.

하이드로 젤 합성 마이크로파 방사선의 사용은 부반응을 최소화하고, 종래의 열 공정 (10)에 비해 짧은 시간에 높은 반응 속도 및 수율을 얻을 수있는 간단한 방법을 제공한다. 이 방법은 중합체의 상호 작용 및 반응 시스템 (11) 내의 유기 용매의 부재에 의한 정제 단계 및 수율 멸균 하이드로 겔을 필요로하지 않는다. 따라서, 어떤 모드 때문에 고분자 네트워크에 연결 RGD의 높은 비율을 보장합니다ifications 겔 형성에 관련된 고분자 화학 그룹으로 요구된다. 카르복실기, PAA와 카보 머, 하이드 록실 그룹, PEG에서 아가 로스에서 중축 합 반응을 통해 하이드로 겔 입체 구조를 야기. 언급 된 중합체는 척수 손상 수리먼트 (12) 하이드로 겔의 합성에 사용된다. 이러한 장치는 이전에보고 된 생체 적합성뿐만 아니라 많은 생체 조직들 및 요변 특성에 유사한 기계적 물리 화학적 특성을 보여, 13, 14 일. 또한, 그들은 주입의 영역에서, 현장에서 현지화 된 상태로 유지됩니다.

이 연구에서, PAA의 카르복실기 알킨 잔기 (도 1)를 수정하고 RGD 지드 화합물 구조 (CH 2) N으로 준비된 화합물과 트리 펩티드 단기 -NH (2)의 반응을 이용한 합성 - N 3 (<강한> 그림 2). 그 후, 수정 된 PAA는 CuAAC 클릭 반응 15-17 (그림 3)를 통해 RGD-아 지드 유도체와 반응한다. 구리 (I) 촉매를 사용하여 반응 속도 및 선택성 둘 다의 주요 개선 리드. CuAAC 반응은 유기 합성에서 폭넓게 중합체 과학 분야에서 사용된다. 이는 작용기 고효율 및 높은 내성을 결합하고, 유기 용매의 사용에 의해 영향을받지 않는다. 높은 선택성, 빠른 반응 시간 및 간단한 정제 과정은 원하는 부분 (18)을 이식 성 중합체, 블록 공중 합체 또는 사슬의 획득을 허용한다. 이 클릭 전략은 가능한 최종 생화학 응용 프로그램에 따라 물리 화학적 특성을 사용자 정의 할 수 중합 후 폴리머를 수정할 수 있습니다. CuAAC 실험 조건은 쉽게 (구리의 산화가 최소한으로 발생할 수있는 반면, 반응이 물에 민감하다) 재현, 그리고 자연이다졸 형성된 제품의 안정성을 보장한다. 구리 금속의 사용으로 인해 세포에 대한 잠재적 인 독성 효과 및 생물학적 미세 환경에서 중요한 점으로 간주 될 수 있지만, 투석 촉매 잔기의 완전한 제거를 허용하도록 정제 방법으로 사용된다. 마지막으로, PAA는 RGD 세포 또는 약물 담체로서 이러한 시스템의 잠재적 기능을 확인하기 위해 조사되는 하이드로 겔의 합성 (도 4) 및 생성 된 네트워크의 물리 화학적 특성에 사용되는 변성.

figure-introduction-1
그림 1 : PAA는 알킨의 합성을 수정 알킨 그룹과 PAA의 작용의 방식을,. "N"은 카르복실기가 propargylamine와 반응에 단량체를 나타냅니다. 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.

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그림 2 :.. RGD-아 지드 합성 RGD-아 지드 유도체의 합성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 : 반응을 클릭 제도 RGD-아 지드 유도체 및 알킨-PAA 사이 클릭 반응의.. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-introduction-4
그림 4 : 히드로 겔 SYNThesis. RGD 작용 하이드로 겔 합성 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

주 : 수신 한 화학 물질이 사용된다. 선형 RGD 구입되지만 FMOC 표준 고체상 펩타이드 합성 16, 19에 의해 제조 될 수있다. 용제는 분석 등급의이다. 투석 차단 동일 3,500 다 승 M과 멤브레인의 사용을 요구한다. 합성 된 화합물 1 400 메가 헤르츠 분광기하여 클로로포름에 기록 H NMR 스펙트럼 (CDCl3 중) 또는 용매와 같은 산화 중수소 (D 2 O)을 특징으로하고, 화학적 이동은 백만 분의 δ 값으로보고된다. 또한, 하이드로 겔을 KBr 펠렛 기술을 이용하여 FT-IR 분석을 실시하고 그 물리적 특성은 37 ° C에서 반전 된 테스트 튜브를 사용하여 평가 겔화 과정을 포함한다.

4 Azidobutanoyl 1. 합성 염화 1

  1. 디클로로 메탄 10 ㎖ 및 디메틸 포름 아미드 0.5 ㎖에 azidobutanoic -4- 카복실산 (3.90 mmol)을 500 mg의 녹인다.
  2. 0 ° C에서 상기 용액을 냉각빙욕을 사용.
  3. 교반하면서, 반응계를 서서히 적가 디클로로 메탄 5 ㎖에 옥 살릴 클로라이드 (5.85 mmol)을 505 μl를 첨가하고.
  4. 빙욕을 사용하여 0 ℃에서 1 시간 후, 실온으로 복귀.
  5. 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거 하였다.
  6. CDCl3 중 16 샘플을 용해시키고, 1 H-NMR 분광법에 의해 얻어진 생성물을 특성화.

파생 RGD-아 지드 2의 2. 합성

  1. 1 M NaOH를 1 ml의 RGD 50 밀리그램 (0.145 밀리몰)을 녹인다.
  2. 테트라 히드로 푸란 2 ㎖에 1 (0.16 밀리몰)에 24 mg의 녹인다.
  3. 빙욕을 사용하여 0 ℃에서 적가 한 용액에 RGD 용액 모두를 추가한다.
  4. 실온으로 돌아가서 밤새 교반.
  5. 1 M 염산 1 ㎖를 추가합니다.
  6. 회전식 증발기에서 감압하에 용매를 제거 하였다.
  7. OBT를 특성화ained 1 H-NMR 분광법으로 제품, D 2 O (16)에 시료를 용해.

3. PAA 알킨 수정 (3)

  1. 증류수 15 ml의에서 PAA 용액 (2.8 mmol)의 W / W 35 % 200 mg을 녹이고.
  2. propargylamine 하이드로 클로라이드 (0.20 mmol)을 15.4 mg을 추가합니다.
  3. 1 v / V를 아세토 니트릴 : 1의 14 ml의 1- 히드 록시 벤조 트리아 졸 수화물 42.8 mg의 (의 HOBt, 0.28 밀리몰)을 녹이고 50 ℃로 가열하여 증류수 솔루션을.
  4. 실온에서 PAA 수용액으로의 HOBt 용액 전부를 추가한다.
  5. 반응 혼합물에 ethyldimethylaminopropylcarbodiimide 53.6 mg의 (EDC, 0.28 밀리몰)을 추가한다.
  6. 5.5로 pH를 조정하고, 실온에서 밤새 반응 시스템을 교반하고 1 M 염산을 사용한다.
  7. 솔루션을 투석. 증류수 2 L의 염화 나트륨 11.2 g을 용해하고 염산 W / W 37 % 0.2를 가하여. 3.5 kDa의 컷오프의 승 M의 멤브레인을 사용하여 상기 용액을 투석.
  8. PERFO3 일 동안 RM 투석. 염산 w / w 37 %, 0.2 mL를 함유 갓 준비한 증류수 2 L 매일 투석액을 변경한다.
  9. -80 ° C에서 최종 솔루션을 저장합니다. 제조사의 프로토콜에 따른 동결 건조기로 동결 건조.
  10. D 2 O (16)의 샘플을 용해시키고, 1 H-NMR 분광법으로 기능화 중합체 특성화.

PAA-RGD 4. 합성 고분자 (4)

  1. PAA 78 mg을 증류수 10ml에 알킨 3 (1.083 밀리몰)을 수정 녹인다.
  2. 테트라 히드로 푸란 5 ㎖에 RGD 지드 유도체 2 (0.0722 mmol)를 25 mg의 녹인다.
  3. 고분자 용액에 RGD 솔루션을 모두 추가합니다.
  4. 요오드화 구리 (0.0116 mmol) 및 아스 코르 빈산 나트륨 2.2 mg의 (0.0111 mmol)을 2.2 mg을 추가합니다.
  5. 교반하면서 60 ℃에서 생성 된 혼합물을 밤새 환류시켰다.
  6. 25 ℃로 혼합물을 냉각.
  7. Dialyz솔루션을 전자. 증류수 2 L의 염화 나트륨 11.2 g을 용해하고 염산 W / W 37 % 0.2를 가하여. 3.5 kDa의 컷오프의 승 M의 멤브레인을 사용하여 상기 용액을 투석.
  8. 사흘 동안 투석을 수행합니다. 염산 w / w 37 %, 0.2 mL를 함유 갓 준비한 증류수 2 L 매일 투석액을 변경한다.
  9. -80 ° C에서 최종 솔루션을 저장합니다. 제조사의 프로토콜에 따른 동결 건조기로 동결 건조.
  10. D 2 O (16)의 샘플을 용해시키고, 1 H-NMR 분광법에 의해 얻어진 생성물을 특성화.

5. RGD-작용 하이드로 젤 합성

  1. PBS를 준비. 증류수 50 ml의 PBS 염 645 mg을 용해.
  2. 실온에서, 카보 머, 40 mg의 PBS (단계 5.1)의 용액에 9 관능 4 PAA 10 ㎎을 혼합 완전히 용해 (30 분)까지.
  3. 솔루션에 PEG 400 mg을 추가하고 45 분 동안 교반 유지.
  4. 교반을 중지하고 시스템이 30 분 동안 정착 할 수 있습니다.
  5. 7.4으로 산도를 조정 1 N 수산화 나트륨을 사용합니다.
  6. 얻어진 혼합물을 5 ml에, 아가로 오스 분말 25 mg을 추가합니다.
  7. 일반적으로 30 초와 1 분 사이의 시간 동안, 끓는까지 500 W에서 마이크로파 방사선 시스템을 조사하고, 전자 기적으로 80 ° C까지 가열한다.
  8. 온도가 50 ° C로 감소 될 때까지 상온에 노출 된 혼합물을두고 1의 용액을 수득하기 위해, PBS (단계 5.1) 5 mL를 추가 한 체적 비율.
  9. 1.1 cm의 직경 (12) 멀티 웰 플레이트 포함 강철 실린더를 준비합니다.
  10. 용액으로부터 500 ㎕를 분취 액을 가지고 각각의 강철 실린더에 배치합니다.
  11. 시스템을 완전히 겔화 될 때까지 45 분 동안 휴식을 남겨주세요.
  12. 하이드로 겔을 얻기 위해 스테인리스 집게를 사용하여 실린더를 제거한다.

치료 도구 6.로드 (의약품 또는 세포)

  1. 일을 반복5.1-5.7 주당 순이익.
  2. 1 부피 비율 (이미 졸 상태로) 혼합물을 37 ℃에 도달 할 때, 1에서 최종 시스템을 얻기 위해, 원하는 약액 또는 세포 배양을 포함하는 용액 5 mL를 추가한다.
  3. 반복 물리적 겔 내에서 포획 biocompounds와 고분자 네트워크를 얻을 수 5.9-5.12 단계를 반복합니다.

7. 하이드로 겔 특성

  1. FT-IR 분석
    1. 젤 형성 후, 24 시간 동안 증류수 250 mL를 상기 synthetized 하이드로 하나 소크.
    2. 하이드로 겔이 침수되는 수성 용지를 제거하고 동결 건조 액체 N 2.
    3. 을 KBr 펠릿 법에 따른 하이드로 겔 샘플을 라미네이트.
      1. 마노의 박격포로 KBr을 가득 주걱을 추가합니다. 하이드로 겔 샘플을 소량 취하고을 KBr 분말과 혼합합니다 (KBr을 양 또는 주걱의 선단을 덮도록 충분한 약 0.1 %).
      2. 분말이 미세하고 균일 한 때까지 혼합물을 갈기.
      3. 적외선 펠렛을 형성을 KBr 펠렛 키트를 사용한다. 수동 실험실 프레스를 사용하여 분말을 누릅니다 : 10t의 압력 용량의 3 분 후 5t 동일한 압력 용량에서 3 분.
      4. 모양으로 균일하고 투명한 최종 펠렛을 얻기 위해 압력을 해제합니다. 적외선 샘플 홀더에 펠렛을 삽입하고 스펙트럼 (16)를 실행합니다.
  2. 겔화 연구
    1. PBS 900 μL와 2 ML의 microcentrifuge 관을 채우고 37 ° C 평형.
    2. 하이드로 겔을 형성하고 37 ℃에서 부화 제조 된 고분자 용액 100 μl를 추가합니다.
    3. 튜브를 전환하고 겔이 1, 2, 5, 10 및 20 분에서 관찰 흐르면. 겔은 겔화 시간으로 흐르지 않는 시간을 기록한다.

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결과

n은 카르복실기, 아민과 반응 단량체 라벨도 1에 나타내었다 같이 PAA의 알킨 유도체를 효율적으로, 폴리 아크릴산 및 propargylamine에서 합성된다. 제품의 아이덴티티는 1 H-NMR 분광법으로 확인 하였다. (5) 삼중 결합 변성 PAA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.

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그림 5 : PAA의 1 H-NMR 스펙트럼은 알킨을 수정 알킨 부분에 관련된 신호가 강조

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토론

알킨 부분을 사용한 PAA 중합 후 변형과 아지드 그룹을 사용한 RGD 기능화는 폴리머와 펩타이드 사이의 안정적인 결합 형성을 보장합니다. 실제로, 트리아졸은 1,2,3-트리아졸 고리의 1,4 위치에 부착된 탄소 원자 사이의 단단한 연결 단위 역할을 하며 가수분해 또는 다른 방식으로 절단될 수 없습니다. 또한, 트리아졸은 벤제노이드 및 관련 방향족 헤테로사이클과 같은 다른 고리형 구조와 달리 산화 및 환원이 극히 어렵습니다24. 이러한 방식으로 PAA-RGD 생성물의 화학적 불안정성은 하이드로겔 합성의 실험 조건에서 거의 없습니다. 펩타이드는 화학 결합의 특성으로 인해 3D 고분자 네트워크에 접목되며 물리적으로 갇히지 않습니다(따라서 시스템을 떠날 수 있음).

알킨 PAA는 아민 유도체를 얻기 위해 EDC 및 HOBt가 있는 수용액에서 프로파르길아민을 사용하여 제조됩니다. 실험 결과는 PAA에 결합되는 삼중 결합의 백분율이 사용된 아민의 양에 비례한다는 것을 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없으며 이 원고를 준비하는 데 어떠한 대가도 받지 않았다고 밝혔습니다.

감사의 글

저자는 언어 편집을위한 유익한 토론을위한 교수 마우리 치오 MASI 미스 키아라 Allegretti에게 감사의 말씀을 전합니다. 저자의 연구는 반도 히오바니 Ricercatori 2010 (Ministero 델라 경례 GR-2010-2312573)에 의해 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
폴리(아크릴산) 용액 평균 Mw ~100,000, H2O시그마 알드리치523925CAS 9003-01-4
폴리(에틸렌 글리콜) 2,000시그마 알드리치84797CAS 25322-68-3
카보미어 974PFagron1387083
아가로스 Invitrogen 주식 회사16500-500UltraPure Agarose
RGD 펩타이드abcamab142698
4-azidobutanoic acidAurum PharmatechZ-2421  CAS 54447-68-6
옥살릴 클로라이드시그마 알드리치O8801CAS 79-37-8
프로파르길아민 염산염 95%시그마 알드리치P50919CAS 15430-52-1
구리(I) 요오드화물시그마 알드리치3140CAS 7681-65-4
아스코르브산나트륨시그마 알드리치Y0000039CAS 134-03-2
인산염 완충 식염수시그마 알드리치P4417
투석 멤브레인스펙트럼 실험실, Inc.132725Spectra/Por 3 투석 멤브레인  표준 RC 튜빙
MWCO : 3.5 kD

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