의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

요약

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

초록

박테리아 흔히 pH의 변화, 온도, 산화 환원 상태, 노광 또는 기계적 힘 등의 환경 변화에 노출된다. 이러한 조건 중 많은 셀 전개 단백질 원인 유기체의 생존에 불리한 영향을 미친다. 무관 스트레스 특정 분자 샤페론의 그룹이 스트레스 조건의 생존에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 완전히 접혀 및 보호자 - 비활성 스트레스 전에,이 단백질은 빠르게 전개 및 특정 스트레스 조건에서 chaperone 단백질을 활성화하는 동안. 일단 이들 조건 무질서 샤페론 다른 응집 경향 많은 단백질에 결합 활성, 그 응집을 방지하고, 직접 또는 간접적으로 비 응력 조건에 따라 반환 폴딩 단백질을 용이하게한다. 자신의 활성화 및 클라이언트 인식의 메커니즘에 대한 자세한 이해를 얻기위한 기본 접근 방식은 정화 및 subsequen을 포함시험관 샤페론 분석에서 사용하는 이들 단백질의 t 특성화. 생체 스트레스 분석에 후속 독립적으로 시험 관내 결과에서 얻어진 확인할 절대적으로 필수적이다.

이 프로토콜은 E.의 샤프론 활성을 특성화하기 위해 시험 관내 및 생체 내 방법에 대해 설명 콜라이 HdeB, 산 - 활성화 된 샤페론. 광산란 측정은 시험 관내에서, 설정된 모델 클라이언트 단백질 MDH의 산 - 유도 된 응집을 방지하기 HdeB 용량 편리한 판독을 사용 하였다. 분석 초 원심 분리 실험은 아닌 스트레스 조건에 자신의 복귀에 따라 클라이언트 단백질의 운명에 빛을 창고에, HdeB 및 클라이언트 단백질 LDH 사이의 복합체 형성을 나타 내기 위해 적용되었다. 클라이언트 단백질의 효소 활성 분석법을 pH 유도 클라이언트 비활성화 및 활성화에 HdeB의 효과를 모니터링하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 생존 연구 과정 제어하는 ​​데 사용 된생체 내에서 HdeB의 보호자 기능의 영향을 r에.

서론

미생물 병원체가 산에 의한 단백질 전개 상황을 경험하는 일반적인 자연 환경은 그 산성 pH 식중독 병원균 ^1에 대한 효과적인 장벽 역할을하는 포유류 위 (pH 범위 1-4)입니다. 아미노산 측쇄 양성자로 인한 단백질 응집 펼쳐지는 생물학적 과정, 손상 세포 구조에 영향을 미치며, 결국 세포 사멸 ^{1,2-시킨다.} 박테리아 페리 플라 즘의 pH 의한 다공질 외측 막을 통한 양성자의 자유로운 확산을 거의 즉시 환경 pH를 평형화하기 때문에, 그람 음성 박테리아의 주변 세포질과 내막 단백질 산 스트레스 조건 ³ 하에서 가장 취약한 세포 성분이다. 빠른 산 - 매개 손상에 대한 자신의 주변 세포질 프로테옴을 보호하기 위해, 그람 음성 세균은 산 활성화 주변 세포질 보호자 HdeA 및 HdeB을 사용한다. HdeA는 조건 흐트러 보호자입니다 ^{4,5 : 중성 pH에서 HdeA가 접혀, 보호자 - 비활성 이합체로 존재한다. pH가 3 이하의 pH 변화에 따라, HdeA의 보호자 기능은 신속 6,7 활성화됩니다. HdeA의 활성화는 단량체 6-8의 전개 깊은 구조 단량체로는 해리를 포함하여 변경 및 부분이 필요합니다. 활성화되면, HdeA은 산성 조건 하에서 전개 단백질에 결합한다. 그것은 효과적으로 낮은 pH에서 배양하는 동안뿐만 아니라 pH를 중화에 모두 자신의 응집을 방지 할 수 있습니다. pH가 7.0 반환에, HdeA는 ATP 독립적 인 방식으로 자사의 클라이언트 단백질의 접힘을 용이하게하고 이량 체, 샤페론 비활성 형태 9로 다시 변환합니다. 마찬가지로, 동성 보호자 HdeB은 샤페론 비활성화되어 pH가 7.0에서. HdeA 달리, HdeB의 보호자 활동, pH가 4.0에서 HdeB 여전히 크게 접힌 10 이량되고있는 조건을 겉보기 최대에 도달한다. 또한, 상기 pH를 저하 CAUSHdeB의 비활성화 말이지. 이러한 결과는 광범위한 유사성에도 불구하고 HdeA HdeB은 그들의 보호 샤페론 기능 넓은 pH 범위를 커버 할 수 있도록 기능을 활성화 모드들이 다르다는 것을 제시한다. E.의 내산성에 관여 한 또 다른 보호자 대장균은 중립 상태가 복원 될 때까지 펼쳐진 클라이언트 단백질을 안정화 나타나는 세포질 Hsp31이다. Hsp31의 작용의 정확한 모드는, 그러나, 12 수수께끼 남아있다. 살모넬라와 같은 다른 장내 유해 세균이 hdeAB 오페론이 부족한 점을 감안, 다른 아직 미확인 주변 세포질 보호자가이 박테리아 (11)의 내산성에 관여하는 것을있을 수 있습니다 가능성이 높다.}

여기에 제시된 프로토콜은 생체 ^열 관내 및 HdeB에서의 pH 의존성 샤페론 활성을 모니터링 할 수 있도록 다른 샤페론을 조사하기 위해 적용 할 수있다Hsp31 등. 대안 적으로, hdeAB의 발현을 조절하는 전사 인자의 복잡한 네트워크는 잠재적으로 생체 내 응력 분석에 의해 조사 할 수있다. 생체 내에서 단백질의 샤페론 기능을 특성화하기 위해 상이한 실험 설정을 적용 할 수있다. 하나의 경로는 단백질 전개 응력 조건을 적용 표현형 중 관심의 유전자를 과발현 또는 유전자의 삭제를 수행하는 변이주를 특징 화하는 것이다. 프로테오믹스 연구가 보호자가 존재하면 응력 조건 집합을 더 이상 어떤 단백질들을 식별하기 위해 수행 될 수도 있고, 특정 효소의 샤페론의 영향 효소 분석법 ^14-16을 사용하여 응력 조건에서 측정 할 수있다. 이 연구에서 우리는 모든 주요 E.의 발현을 제어 RpoH 열 충격 시그마 인자 (32)이 부족 rpoH 삭제 변형에 HdeB를 과발현하기로 결정했습니다 콜라이 샤페론 및 삭제는 SENS 증가하는 것으로 알려져단백질 ^(15)을 전개 발생할 환경 스트레스 조건 itivity. HdeB의 생체 샤페론 활성은 Δ rpoH 균주의 pH 민감성을 억제하는 능력을 모니터하여 측정 하였다. 전체적으로 여기에 제시된 프로토콜은 시험 관내에서뿐만 아니라 생체 내 환경에서 산 활성화 샤페론 활성을 특성화하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다.

프로토콜

1. 발현 및 주변 세포질 HdeB의 정제

참고 : HdeB는 E. 표현했다 폴리 믹신 용해시의 페리 플라 즘에서 플라스미드 pTrc- hdeB ¹⁰ 및 정제를 보유하는 대장균 세포.

1. E.의 야간 문화를 준비 200 μg의 / ㎖의 앰피 실린 (LB _{앰프)를 포함하는} 30 ml의 LB에 플라스미드 pTrc- hdeB ^(10)를 숨겨 대장균 세포. 0.7 OD를 _{600 ㎚에} 도달 _할 때까지 LB _앰프 네 1 L 배양 물을 접종하고 37 ℃에서 성장을 200 RPM. 그리고, HdeB의 발현을 유도하고, 30 ℃로 성장 온도를 감소 300 μM IPTG를 추가한다.
2. 30 ℃에서의 단백질 발현을 5 시간 후에는 4 ° C에서 5 분 동안 8000 × g으로 원심 분리하여 세포를 수확.
3. 4 ℃에서 5 분 동안 8,000 XG에서 세포를 다시 A (50 mM 트리스 / 염산, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)와 원심 분리기 버퍼 100 ㎖로 세포 펠렛을 씻으십시오.
4. 그 후,에 resuspend80 세포 펠렛은 용액 1 ㎎ / ㎖ 폴리 믹신 설페이트를 함유하는 버퍼. 외막의 효율적인 붕괴를 들어, 부드럽게 4 ° C에서 1 시간 동안 정지를 저어.
5. 세포질 분획 및 세포 파편을 제거하려면, 4 ℃에서 15,000 XG에서 20 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 이 ~에 용해 HdeB를 포함하는 60 ml의 상층 액을 발생합니다.
6. 6 kDa의 MW 갖는 투석막을 이용하여 버퍼 B (20 mM 트리스 / 염산, 0.5 mM의 EDTA, pH를 8.0)의 150 배 부피에 대해 밤새 주변 세포질 추출물을 함유하는 상청액을 투석 차단한다. 3 kDa의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 15 ml의 단백질을 농축시킨다. 0.2 ㎛의 기공 필터를 사용하여 단백질 용액을 필터.
7. 2.5 ㎖ / 분의 유속으로 5 컬럼 부피의 완충액 B로 평형화 한 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼 (컬럼 부피 5 ㎖)에 단백질을 적용한다. 단백질이 컬럼에로드되면, 10 분에 대한 버퍼 B와 열을 씻어/ 분으로 2.5 ㎖의 유속. 2.5 ㎖ / 분 ^(6)의 유량을 50 분의 시간주기 동안 버퍼 B에서 0.5 M 염화나트륨 0 내지 선형 구배로 용출 HdeB.
8. 15 % SDS-PAGE를 사용하여 HdeB을 포함하는 분획을 확인합니다. 5 ㎕의 5 배 감소 SDS 로딩 버퍼 20 μl의 샘플을 섞는다. 로드 (10) 젤 위에 μL 및 트리스 - 글리신 버퍼 (14.4 g / L의 글리신, 2.9 g / L 트리스 1 g / L 황산 도데 실 나트륨, 산도 8.3)에서 실행됩니다. 브로 모 페놀 밴드가 젤 (~ 45 분)의 바닥에 가까운 마이그레이션 할 때까지 150 V에서 젤을 실행합니다.
9. 풀 모든 HdeB 함유 분획 4 L HdeB 저장 완충액에 대하여 밤새도록 4 ℃에서 투석 (50mM 트리스 / 염산, 200 mM의 염화나트륨, pH를 8.0), 및 분자량 원심 필터 유닛을 이용하여 약 300 μM로 단백질을 농축 컷 - 오프 3 kDa의의를. 흡광 계수 ε = _{280 ㎚에서} 15,595 M을 사용하여 280 nm에서 HdeB의 농도를 결정 ^-1 cm ^-1. 100 ㎕를 분취 및 플래시없는 준비액체 질소의 분취 량을 '제.
   주 : HdeB 적어도 6 개월 -70 ℃에서 저장 될 수있다.

2. 보호자 활동 분석 말 레이트 탈수소 효소를 펼쳐 열적으로 사용 (MDH)

주 : 열 상이한 pH 값에서 돼지 미토콘드리아 말산 탈수소 효소 (MDH)를 전개의 응집 그래피 HdeB의 영향을 아래와 같이 조사 하였다. 나열된 모든 단백질 농도는 단량체 농도를 참조하십시오.

1. MDH를 제조 밤새 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대하여 4 ℃에서 MDH을 투석 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 100 μM로 단백질을 농축 kDa의.
   참고 : MDH는 황산 암모늄 용액으로 전달 될 때 MDH의주의 투석이 필요합니다.
2. 집계를 제거하려면, 4 ℃에서 20,000 XG에서 20 분 동안 단백질을 원심 분리기. ε <(280 nm에서 흡광도 MDH 농도를 측정서브> 280 나노 미터 = 7950 M ^-1 cm ^-1). MDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결.
3. 온도 조절 샘플 홀더 및 교반기가 장착 된 형광 분광 광도계에 1 ml의 석영 큐벳을 놓습니다. 설정 λ _{전 / EM} 350 nm이다.
4. 큐벳과 세트 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에 미리 예열 (43 ° C) 버퍼 D (150 mM의 인산 칼륨, 150 mM의 염화나트륨)의 적절한 볼륨을 추가 43 ° C에 큐벳 홀더의 온도. 총 부피는 1000 μL이다.
5. 0.5 μM의 MDH 첨가 한 후 상기 버퍼 12.5 μM HdeB (또는 대안 적으로, 버퍼 컨트롤 HdeB 저장 버퍼의 동일 부피)을 추가한다. 광산란 모니터링을 시작. MDH의 전개 충분한 수 있도록 360 초 동안 반응을 품어.
6. HPO ₄ 2 M 버퍼링 K _2의 0.16-0.34 볼륨을 추가하여 7 pH를 올리고 다시 계속또 다른 440 초 동안 광 산란 등에 이용.
7. 중화 이후 소정 시점에서 샤페론의 부재에 기록된다 MDH 응집의 정도를 100 %로 설정 (여기서는 MDH의 최대 광산란 관찰 하였다 500 초 후). 각각 나타낸 pH 값에서 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 HdeB의 활성을 정상화.

분석 초 원심 분리에 의해 HdeB-LDH 복합체 형성 3. 검출 (AUC)

주 : HdeB 단독으로 또는 열적 젖산 탈수소 효소 (LDH)를 전개로 복잡 침강 속도 실험 분석 초 원심 분리기를 사용하여 수행 하였다.

1. 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대해 밤새 39 ° C에서 LDH를 투석, LDH을 제조 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 200 μM로 단백질을 집중 kDa의.
   참고 : LDH의주의 투석이 LD로 필요H는 황산 암모늄 용액으로 전달된다.
2. 4 ° C에서 20,000 XG에 20 분 동안 집계, 원심 분리기 LDH를 제거합니다. 280 nm에서 흡광도 LDH 농도를 측정 _{(280 nm의} ε = 43,680 M ^{-1 cm-1).} LDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결.
3. 41 ° C에서 15 분 동안 버퍼 D에 30 μM의 HdeB의 유무 (각각의 pH 4, 7)에서 3 μM의 LDH을 품어.
   참고 : 완전한 집계에 높은 온도 결과에서 LDH의 배양 및 HdeB없이 보호자 효과를 관찰 할 수있다.
4. 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 그런 다음, 표준 분야를 포함하는 세포로로드 샘플은 1.2 cm 경로 길이와 2 채널 중앙 장식품을 형성. 초원 심 분리기에 세포를로드 전에 침전 적어도 1 시간 동안 22 ° C 평형.
5. 스핀 22 ° C에서 샘플을 12 시간 동안 각각의 로터에서 167,000 XG, 그리고 나오지도를 모니터링계속해서 280 nm에서의 단백질 imentation. 이미 증명 된 바와 같이 각 채널의 투과광 강도보다 오히려 흡광도를 측정 할 때, 신호 대 잡음비가 향상된다. 이는 또한 후속 데이터 피팅의 품질을 향상시킨다.
6. 연속 C (S) 배포 모델 ^(17)을 사용 SEDFIT (버전 15.01b 2015 12월)으로 데이터 분석을 수행. 방법 SEDFIT를 사용하는 설명하는 튜토리얼 참조 ^(18)에서 찾을 수 있습니다.
   1. 0.7에 ME (최대 엔트로피) 정규화에 대한 신뢰 수준을 설정합니다.
7. SEDNTERP ¹⁹ 사용하여 버퍼 밀도뿐만 아니라 점도를 계산합니다. 집계 클라이언트 단백질의 양을 추정 기준으로 pH 7로 pH를 4로 침강 LDH의 적분 값을 비교한다.
   주 : 침강 분포도의 통합 SEDFIT에서 직접 수행 될 수있다. 침강 속도 데이터를 분석하는 다른 소프트웨어는 최근의 검토 ^(20)에서 찾을 수있다.

HdeB의 존재 4. 모니터링 MDH 불 활성화 및 재 활성화

주 : pH의 펼친 MDH의 폴딩 그래피 HdeB의 영향에 MDH 중화 활성을 모니터링함으로써 측정 하였다.

1. 부재 또는 25 μM의 HdeB의 존재에 37 ° C에서 1 시간 동안 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에서 버퍼 D 1 μM의 MDH을 품어. 그 후, 10 분 동안 20 ℃로 온도를 이동.
   주 : MDH는 37 °의 C보다 높은 온도에서 배양했을 때 어떤 MDH의 폴딩 심지어 HdeB의 존재는 관찰되지 않았다.
2. 산 변성 된 MDH의 폴딩을 개시 0.5 M 인산 나트륨, pH를 8.0 0.13-0.42 양을 첨가하여 pH 7로 시료를 중화한다.
3. 20 ° C에서 2 시간 동안 배양 한 후, 340 nm의 ^구에서 NADH의 감소를 모니터함으로써 MDH 활성을 결정한다.
   참고 : MDH는 L 말 산염에 옥 살로 아세테이트의 NADH 의존 감소를 촉매한다.
   1. 분석 완충액 950 μL의 (50 mM의 인산 나트륨, pH를 8.0, 1 밀리미터 옥 살로 아세테이트 및 150 μM NADH)와 인큐베이션 반응물 50 μl를 섞는다.
      참고 : 분석 버퍼에 MDH의 최종 농도는 44 nM의해야합니다.
   2. 20 ° C로 설정 펠티에 온도 제어 블록을 구비 한 분광 광도계 흡광도의 변화를 모니터한다.
   3. pH를 7.0로 유지 된 44 nM의 기본 MDH에 MDH 활동 상대를보고합니다.

E.에 HdeB 과발현 5. 효과 산 스트레스에서 대장균 생존

참고 : E. 대장균 MG1655의 게놈 DNA가 발행 프로토콜 ^(21)을 사용하여 단리 하였다.

1. E.에서 hdeB를 증폭 를 BamHI-레브 GGT의 GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA의 GTC의 AT & T와 hdeB - -를 EcoRI-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C를 PCR 프라이머의 hdeB를 사용하여 대장균 MG1655
2. 다음과 같이 50 μL의 PCR 반응 설정 : 10 μL 5 배 중합 효소 버퍼, 200 μM의 dNTPs, 0.5 μM 프라이머 JUD2, 0.5 μM 프라이머 JUD5, 150 ng를 게놈 DNA의 MG1655, 0.5 ㎕의 DNA 중합 효소를, DDH ₂ O 50 μl를 추가합니다.
3. 다음과 같이 hdeB의 증폭을 수행 1 단계 : 95 ° C, 1 사이클에서 5 분; 2 단계 : 95 ° C에서 30 초, 55 ° C에서 30 초, 72 ° C, 40 회에서 30 초; 3 단계 : 72 ° C에서 10 분.
4. 제한 부위 클로닝을위한 표준 방법을 이용하여 플라스미드를 EcoRI pBAD18의 I 및 I를 BamHI 부위로 PCR 단편을 생성 클론. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다. 시퀀싱 ^(10)에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다.
5. HdeB 또는 변형 BB7224에 빈 벡터 제어 pBAD18 (Δ rpoH) (유전자형 발현하는 플라스미드 변환 : F를 ^- λ ^- E14 ^- [araD139] _{B / r에} [6 (된 argF-락) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (SM ^R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: 테네시 (10) (TC ^S) suhX401 deoC1 아라드 ⁺ rpoH :: 관 ^{+ 16)} 화학적으로 유능한 세포를 사용.
   참고 :이 변형 온도를 구분합니다.
6. 45 초 42 ° C에서 열 충격과 이전에 도금을 한 후, 30 ° C, 200 rpm에서 세포를 배양한다. 긍정적 인 클론의 단일 콜로니 연속 아웃을 수행하고 하룻밤에 30 ° C를 품어. 50 ml의 LB _앰프에서 하룻밤 문화를 준비하고 200 rpm으로 30 ℃에서 세포를 배양.
7. 밤새 배양 물을 25ml의 LB _앰프로 40 배 희석하고 HdeB 단백질 발현을 유도하기 위하여 30 ° C 및 OD를 _{600 ㎚} 내지 200 RPM = 1.0 0.5 % 아라비 노스 (아)의 존재 하에서 박테리아 성장.
8. pH를 변화 실험에, LB를 사용앰프 + 아라는 0.5 OD의 _{600 ㎚로} 세포를 희석 (여기서는의 pH 2.0, pH가 3.0, pH를 4.0) 각각의 pH 값을 조정합니다 (5) M 염산의 적절한 볼륨을 추가하여.
9. 표시된 시점 (하여 pH 3, 2.5 분; pH를 2, 1 분, 4의 pH, 30 분) 한 후, 5 M NaOH를 적절한 양을 첨가하여 배양을 중화.
10. OD 측정을 사용하여 30 ℃에서 12 시간 동안 액체 배양에서 중화 문화의 성장을 모니터링합니다.

결과

HdeA 및 HdeB는 E. 상동 있습니다 산 스트레스 조건 ^(10)에 대해 주변 세포질 단백질을 보호하는 것으로 알려져 대장균 단백질. 우리의 작업은 산 분자 보호자 활성화로 HdeA 유사은 HdeB 또한 기능 것으로 나타났습니다. 그러나, 여전히 잠재적 살균하지만 HdeA ^6,9,10,22의 pH 최적보다 상당히 더 높은 pH에서 HdeA, HdeB 기능 대조적이다. 체외 HdeB의 샤페론 활성의 최적 pH를 조사 네이티브 MDH는 HdeB의 유무에 표시된 pH를 예열 된 (43 ℃로) 완충액으로 희석 하였다. 인큐베이션 360 초 후, 배양 반응물을 중화시켰다. 이 중화은 43 ° C를 ^9에서 MDH의 집계를 트리거합니다. 대표적인 결과 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 때문에 MDH의 응집 중화시 급격히 증가 시킨다는 것을 보여준다 (도 ...

토론

활성화 및 HdeB의 샤페론 기능의 메커니즘을 연구하기 위해, HdeB 다량이 발현되고 정제 될 수있다. 발현 벡터 시스템의 숫자는이 연구에 사용 하였다 둘 PTRC 또는 pBAD 벡터를 포함하는 목적 단백질의 높은 수준의 생산에 사용할 수있다. 발기인은 E.에 대해 쉽게 접근 할 수 있습니다 대장균 RNA 중합 효소 및 E.에서 HdeB의 이렇게 강하게 상향 조절 허용 식 대장균 균주. 이 측면은 rpoH 결핍 균주가 사용 된 산 스트레스 조건 하에서 HdeB의 생체 과발현 연구에 특히 적합하다. 이 균주는 보호자의 대부분을 부족하고, 따라서 높은 온도, 낮은 pH 및 산화 스트레스 ^(15)을 포함하는 다양한 스트레스, 대한 더 민감하다. 대안으로, 생존 목적 유전자 결여 변이주에서 수행 될 수있다 여기에서 제시된 것과 유사한 연구.

t "> 임의 샤페론 활성에 대한 실험 설계 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NEB10-beta E. coli 세포	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
염화나트륨	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
폴리믹신 B 황산염	ICN 바이오메디컬 Inc.
0.2 & 마이크로; m pore sterile 주사기 필터	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)Roche		10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium 인산염 (이염기성)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 형광 분광 광도계	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
인산나트륨 일염기성	시그마	S9390-2.5KG
인산나트륨 이염기성	시그마	S397-500
젖산 탈수소효소(LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I 분석 초원심분리기	Beckman Coulter	392764
중앙 장식, 12mm, 에퐁 숯으로 채워진	베크만 쿨터	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 플라	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	(프로토콜 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
형광 세포 큐벳	Hellma Analytics	119004F-10-40
올리고뉴클레오티드	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
수산화나트륨	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL	Millipore	UFC900324
원심분리기 Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 분광 광도계	Agilent Tech
Spectra/Por 1 투석 멤브레인 MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon 울트라 원심 필터 장치 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786