HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.
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방법 논문
방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
과분극 활성화 주기적 뉴클레오티드 - 게이트 (HCN) 채널들이 신경 세포의 흥분성을 조절하는 기능을 뇌 전체에 보편적으로 표현된다. 해마 영역 CA1의 피라미드 뉴런이 채널의 세포 내 분포는 tetratricopeptide 반복 함유 Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b), 보조 서브 유닛에 의해 조절된다. HCN의 유전자 녹아웃은 HCN 채널의 기능을 제한하는 주요 우울 장애 (MDD)에 대한 치료로서 유용 할 수 있음을 시사 서브 유닛 또는 TRIP8b, 항우울제 같은 행동의 증가에 모두 리드 기공 형성. 중요한 치료 적 관심에도 불구하고, HCN 채널은 또한 그들이의 리듬을 조절 중심부에 표현된다. 심장 HCN 채널 차단과 관련된 오프 대상 문제를 회피하기 위해, 본 연구실은 최근 특히 뇌 HCN 채널 기능을 방해하기 위하여 HCN과 TRIP8b 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용을 표적으로 제안 하였다.여기에 초점이 TRIP8b의 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인 및 HCN1의 C 터미널 꼬리 사이의 상호 작용에 있지만 TRIP8b는 두 가지 상호 작용 사이트의 서브 유닛을 형성 HCN의 기공에 결합한다. 이 프로토콜 TRIP8b 정제 및 HCN과 TRIP8b 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하는 높은 처리량 스크린을 실행하는 방법의 확장의 설명에서 설명한다. 높은 처리량의 선별 방법은 형광 편광 (FP)는 HCN1 C 말단 테일에 상응하는 산 펩티드 아미노 ㄱ 형광 표지 된 11 개의 큰 TRIP8b 단편의 결합을 모니터링하는 분석 기반 이용한다. 이 방법은 수 '히트'화합물은 출사 광의 편광 변화에 기초하여 식별된다. 유효성 검사 분석은 다음 화합물을 인공적 아닌 '히트'있는지 확인하기 위해 수행된다.
서론
과분극 활성화 환상 뉴클레오티드 게이팅 (HCN) 채널은 막 흥분성을 조절하는 하나의 중요한 역할을하는 중심부 및 중추 신경계에 발현된다. HCN 채널 HCN 채널 약리 기능을 제한하는 MDD 3의 신규 한 치료에 효과적 일 수 있음을 제시하는 여러 그룹을 이끌었다 주요 우울 장애 (MDD) 2의 병인에 연루되어있다. 그러나 직접 HCN 채널을 대상 이유로 인해 심장 활동 전위 (4)에서의 중요한 역할의 생존이 아니다. Ivabradine 유일한 FDA는 HCN 채널 길항제를 승인하는 서맥 효과 (5)를 생성하는 심부전의 치료에 사용된다. 따라서, 중추 신경계에서 독점적 HCN 채널 기능을 제한 약리학 적 제제에 대한 필요성이 존재한다.
반복 함유 Tetratricopeptide Rab8b 상호 작용하는 단백질 (TRIP8b하면) 뇌 정시이다HCN 채널 6,7의 표면 발현 및 현지화를 제어 HCN 채널 FIC 보조 서브 유닛. TRIP8b의 유전자 녹아웃 심장 8 HCN의 발현에 영향을주지 않고 뇌 HCN 채널 (7)의 감소를 야기한다. 흥미롭게도, TRIP8b 녹아웃 마우스는 강제 ....
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프로토콜
TRIP8b (241-602) 단백질의 정제 (1)
- 관할 E.으로 박테리아 단백질 발현 벡터 pGS21 3 (241-602) TRIP8b를 포함하는 플라스미드를 변형 대장균 제조업체의 지침에 따라 단백질 발현합니다. 플레이트 루리아 국물 (LB)의 문화 300 μL는 클로람페니콜과 암피실린의 5 ㎍ / ㎖로 -agar. 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 다음 날, 하나의 식민지가 클로람페니콜과 암피실린의 50 μg의 / ㎖와 50 ㎖ LB를 접종 선택합니다. (진탕) 16 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어.
- 암피실린 50 ㎍ / ml의 LB의 1 L에 50 ml의 문화를 추가합니다. 진탕 37 ° C에서 품어.
- 배양은 0.8 내지 1.2의 OD 판독 (600)에 도달하면, 18 ° C로 인큐베이터의 온도를 변경하여 최종 농도 1mM IPTG (이소 프로필 - 베타 - 디 - 티오 갈 락토 시드)를 추가한다. 단백질 발현 16 시간 동안 진행하도록 허용.
- E.는 스핀 다운 4 ° C에서 15 분 동안 6,000 XG에 대장균 박테리아 펠렛합니다. 원심 분리기에서 튜브를 제거한 후, ....
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결과
이전 출판과 저작권 문제를 방지하기 위해, TAMRA 태그가 프로브 HCN1 TAMRA는 그림 2와 3을 생성하는 데 사용되었다. 이 대체가 결과에 상당한 차이를하지 않았 음을 참고하고, 프로토콜 HCN1 FITC와 위에서 설명한 것과 동일하다. HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602)과의 상호 작용을 평가하기 위해 2 단계 (그림 2)에 설명 된 프로토콜을 사용하여 HCN1 TAMRA의 고정 농도로 적정 하였다. 다음, 3 단계에서 설명 된 실험을 수행하고, 레이블이없는 HCN1 펩타이드는 TRIP8b (241-602) 및 HCN1 TAMRA (그림 3)의 고정 농도로 적정 하였다.
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토론
때문에 MDD 24 치료 목표로서의 잠재력 중추 신경계 4 HCN 채널 기능을 길항 약물 학적 접근법에 상당한 관심이 있었다. 그러나, 이러한 노력들은 심장 박동 심장에서 HCN 채널의 중요한 역할 및 부정맥 (25)의 위험으로 정체되어왔다. 우리는 HCN과 뇌 특정 보조 단위체 TRIP8b (8) 사이의 상호 작용을 방해하는 것은 심장 HCN 채널 (3)에 영향을주지 않고 항우울제와 같은 효과를 생성하기에 충분할 수 있음을 추론. 이 가설은 쥐가 항우울제 같은 행동 7을 전시 TRIP8b 부족한 관찰에 의해 강화되었다. 이러한 상호 작용을 표적으로하는 MDD의 치료를위한 새로운 패러다임이 될 수있다.
TRIP8b의 TPR 도메인과 HCN1의 C 단자 트리 펩티드 사이의 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 상세한 프로토콜위에서 제시했다. 그 일반적인 어플.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R21MH104471 및 R01MH106511(D.M.C.), 뇌 연구 재단 SG 2012-01(D.M.C.), 노스웨스턴 대학교 임상 및 중개 과학 연구소(Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute) 8UL1TR000150(Y.H.), 시카고 생물의학 컨소시엄(Chicago Biomedical Consortium HTS-004)(Y.H. 및 D.M.C.) 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 2T32MH067564(K.L.)의 지원을 받았습니다. 이 작업의 일부는 분자 혁신 및 약물 발견 센터(CMIDD)의 노스웨스턴 대학교 의약 및 합성 화학 코어(ChemCore)에서 수행되었으며, 이 센터는 시카고 커뮤니티 트러스트 및 암 센터 지원 보조금 P30 CA060553 시카고 커뮤니티 트러스트의 Searle Funds의 지원과 함께 Chicago Biomedical Consortium의 자금 지원을 받습니다. 고처리량 스크리닝 작업은 Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center의 핵심 시설이기도 한 High Throughput Analysis L....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ni-NTA 아가로스 | Qiagen | 30210 | |
| 투석 카세트 | ThermoFisher | 66456 | |
| 이소프로필 b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384-웰 블랙 플레이트 | 코닝 | 3820 | |
| 프록시플레이트 | 퍼킨-엘머 | ||
| Anti-GST Acceptor 비즈 | 퍼킨-엘머 | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| 단백질 집중 장치 | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire 멀티모드 플레이트 리더 | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) 컴피턴트 셀 | 애질런트 | 200131 |
참고문헌
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (2....
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재인쇄 및 허가
