방법 논문

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

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DOI:

10.3791/54598

⸱

2017년 2월 28일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

이 논문에서

요약

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

초록

유도만능줄기세포(iPS)는 서로 다른 방법을 사용하여 정의된 전사 인자의 강제 발현에 의해 마우스 및 인간 체세포에서 생성됩니다. 여기서, 우리는 비바이러스 기반 트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 iPS 세포를 생산했습니다. 얻어진 모든 iPS 세포주는 in vitro 및 in vivo에서 3개의 생식층의 유도체로 분화하는 능력을 포함하여 만능 세포의 특성을 보였습니다. 이 전략은 선천적 결함에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위해 병에 걸린 태아의 세포를 사용할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

서론

산전 진단은 유전 질환 (즉, 염색체 이상, monogenetic 또는 인성 / polygenetic 질환)과 선천성 기형 (즉, 선천성 횡격막 탈장, 낭포 성 폐 병변, exomphalos, 배벽 갈림 증)을 평가하는 중요한 임상 도구입니다. 양수 (AF) 세포는 임신의 두 번째 임신 중 정기적으로 예약 절차에서 획득하는 간단한 (즉, 양수 천자 및 amnioreduction) 또는 제왕 절개 섹션 1, 2입니다. 태아 또는 신생아 환자 AF 세포의 이용은 재생 의학이 소스를 사용할 수있는 가능성을 제공하고, 여러 연구자들은 AF 3, 4, 5, 6에서 분리 된 줄기 세포 집단을 사용하여 서로 다른 조직 손상 또는 질환을 치료하는 가능성을 조사7, 8, 9, 10, 11, 12. 쉽게 질병들은 종종 고정 된 시간 윈도우에서 질병 환자 AF 셀을 획득 할 가능성은 프로그래밍 목적이 셀 소스를 사용하는 아이디어에 방법을 연다. 실제로, AF 세포로부터 유래 된 유도 다 능성 줄기 (IPS) 세포는 출산 전에 적절한 환자 별 치료를 준비하기 위해, 시험관 내 약물 검사 또는 조직 공학 방법에 대한 관심의 세포 분화 될 수있다. 많은 연구가 이미 AF 세포의 능력은 세포 형태 13, 14, 15, 16, 17 <넓은 범위로 재 프로그램과 차별화 될 입증/ SUP> 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

네 개의 전사 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)의 강제 표현을 통해 다카하시 및 재 프로그램 체세포의 야마나카 (28)에 의해 발견 이후, 진행 프로그래밍의 분야에서했다. 다른 방법을 고려하여, 우리는 바이러스 및 비 - 바이러스 성 방법을 구별 할 수있다. 첫번째 부분 재 프로그램 세포주의 결과와의 위험 모두 고효율이지만 레트로 바이러스 유전자 보통 불완전 침묵을 가질 바이러스 벡터 (레트로 바이러스 및 렌티 바이러스)의 사용을 예상삽입 성 돌연변이 29, 30, 31. 즉, 플라스미드 벡터, mRNA의 단백질, 트랜스포존 : 비 - 바이러스 성 방법은 다른 전략을 사용한다. 유전자 서열의 무료 만능 줄기 세포의 유도는 새는 유전자 발현 및 삽입 성 돌연변이 유발의 잠재적으로 해로운 영향을 회피하는 것을 목표로하고있다. 위에서 언급 한 모든 비 바이러스 전략 중, 피기 백 (PB) 트랜스포존 / 트랜스 시스템은 삽입 또는 절제 이벤트 (32)을 촉매하는 유전자와 트랜스 효소의 일시적인 발현을 측면에만 역전 된 말단 반복을 필요로한다. 만능 줄기 세포의 생성을위한 다른 방법을 통해 트랜스포존을 사용의 장점은 레트로 바이러스 벡터의 동일 효율을 나타내는 비 - 바이러스 벡터 방식 벡터 프리 만능 줄기 세포를 얻을 수 있다는 것이다. 이것은 reprogr위한 통합 트랜스포존 인코딩 트레이스 이하로 절단 할 수있다만능 줄기 세포 (33)의 트랜스의 새로운 일시적 발현 다음과 같은 요소를 amming. PB가 다른 세포 유형 34, 35, 36, 37 효율적임을 감안할 때, 바이러스 벡터에 대한 임상 적 접근 방식에 더 적합하며, 생체이 물을 사용하여 현재의 바이러스 생산 프로토콜 달리 이종없는 만능 줄기 세포의 생산을 허용 조건은,이 시스템은 뮤린 AF에서 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 사용된다.

여기에서 우리는 마우스 AF 세포 (IPS-AF 세포) (38)로부터 만능 만능 줄기 클론의 생산을 보여주기 위해 이미 게시 작업을 다음과 같은 세부적인 프로토콜을 제안한다.

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프로토콜

모든 절차 이탈리아 법에 따라했다. 쥐의 AF 샘플은 GFP라는 C57BL / 6-Tg는 (UBC-GFP) 30Scha / J 마우스에서 13.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 한 쥐에서 수확했다.

1. 트랜스포존 생산

주 : 트랜스포존 발현 벡터는 표준 클로닝 방법을 사용하여 생성 하였다. 마우스 AF 세포 형질 전환 용 플라스미드 DNA 상업용 키트를 사용하여 제조 하였다.

  1. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 DH5α 박테리아의 50 μL와 플라스미드 DNA 10ng의 섞는다. 20 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 품어.
  2. 40 초 동안 42 ° C에서 열 충격.
  3. 2 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 놓습니다.
  4. 미리 예열 (37 ° C) 원성 국물 (LB) 배지 250 μl를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃ (300 RPM)를 흔든다.
  5. 0.1 ㎎ / ㎖ 앰피 실린와 LB 플레이트에 각 변형의 30 μl를 확산. 판 건조, 37 ° C 오븐에서 반전 품어 허용ernight.
  6. 다음날, 오후에, 각각의 변환에서, 멸균 200 μl의 팁을 사용하여, 3 식민지를 선택하고 0.1 ㎎ / ㎖ LB 앰프에 전송합니다.
  7. 하룻밤 37 ° C에서 (300 RPM) 박테리아를 흔들어.
  8. 플라스미드 정제 용 상용 장비를 사용합니다. -20 ° C에서 스톡 플라스미드.

2. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 문화

  1. 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트의 코팅
    1. 여섯 개의 우물 각 멸균 0.1 % 젤라틴 1 ㎖를 추가 후드 코트 판. 젤라틴 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C)를 중합 할 수 있습니다.
    2. 초과 폐기하고, 1 시간 동안 접시를 건조.
    3. 실온에서 저장 판을 밀봉하고 파라 필름을 사용합니다.
  2. 미토 마이신 C와 MEF의 불 활성화
    1. 37 ° C 조를 이용하여 4 × 10 6 MEF 세포의 병을 해동.
    2. MEF 매체와 페트리 접시 (150mm)의 후드에서 MEF을 시드.
    3. 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포 배양.
    4. (주) 세포가 합류 있습니다 마이 토마 이신 C (5 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
    5. 인큐베이터에 장소 세포 (37 ° C와 5 % CO 2) 3 시간 동안.
    6. 마이 토마 이신 C를 세척 세포와 1 배의 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 매체를 제거합니다.
    7. 5 분 동안 37 ° C 배양기에 상업 트립신과 장소 세포 2 ㎖를 추가합니다. 후, 트립신 반응을 정지 매체를 차단 18 ml에 추가 할 수 있습니다.
    8. 제조사의 프로토콜에 따라 BURKER 챔버를 사용하여 세포를 카운트.
    9. 5 분 145 XG에 원심 분리기 세포. 상층 액을 버린다.
    10. 씨앗 60,000 세포 / 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에 불 활성화 MEF의 cm 2.
    11. AF 및 / 또는 AF-만능 줄기 세포를 파종 전에, 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 세포를 배양.

3. 마우스 AF 세포 분리

  1. 시간 제한 교배를 설정하고 질 PLU를 확인공동 주택의 24 시간 후 GS.
  2. 13.5 DPC 때까지 관찰하고 자궁 경부 전위를 통해 임신 댐을 희생.
  3. 70 % 에탄올을 사용하여 동물의 복부 벽을 청소한다.
  4. 가위를 사용하여 복강에 접근하기 위해 복부 벽의 길이를 절개 정중선 개복을 수행한다.
  5. 집게를 사용하여 자궁을 노출. 1X PBS 얼음에 배치 멸균 가득 100mm 배양 접시에 가위 및 전송을 사용하여 자궁을 제거합니다.
  6. 10 배 배율에서 AF를 수집하는 실체 현미경을 사용합니다.
  7. 집게와 자궁을 잡고 가위로 자궁 벽을 제거합니다. 태아 막과 그에 따른 양수 누수에 손상을 피하기 위해주의해야합니다.
  8. 멸균 1X PBS로 가득 100mm 배양 접시에 태아를 수집하고 얼음에 배치합니다.
  9. 깨끗한 100mm 페트리 접시에 좋은 점 집게와 장소 하나 태아의 태반을 잡고.
  10. 좋은 점 집게를 사용 골목 노른자를 제거합니다.
    11. 좋은 점 집게를 사용하여 양막을 방해하고 15 ML 원뿔 유리 병에 인슐린 주사기를 사용하여 각 태아에 대한 AF의 30 μl를 수집합니다.
  11. AF 컬렉션 후, 1 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 멸균 1X PBS로 각 태아 세척하고, 15 mL의에 AF를 함유하는 원뿔형 튜브를 수집한다.
  12. 5 분 145 XG에 원심 분리기 AF. 후드 뜨는을 제거하고 펠렛 AF 세포를 시드.

4. 마우스 AF의 세포 배양

  1. 마우스 AF 세포의 파종
    1. 어느 날 전에 시드로, 마이 토마 이신 C 처리 MEF와 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다.
    2. AF 컬렉션 후, AF 배지를 사용하여 (약 1 × 10 7 세포는 태아에서 얻은 6)를 비활성화 mitotically MEF 상으로 양수로부터 얻은 세포를 시드.
    3. 매일 매체를 변경, 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 배양.
    4. 문화 7 일, 트랜스 후아래에 설명 된 절차에 따라 AF에는 영향 셀.

5. 형질, 만능 줄기-AF 세포 생성 및 문화

주 : 마우스 AF 세포 (PB-CAG-rtTA) 트랜스포존 플라스미드 트랜스 발현 플라스미드 (mPBase)과 관련하여 역방향의 테트라 사이클린 transactivator 더불어 PB-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포존 플라스미드로 형질 감염시켰다. 모든 플라스미드는 교수 안드라스 나기 (33)에 의해 제공되었다.

  1. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 (2 μg의 전체 DNA) 0.5 mPBase의 μg의 0.5 PB-CAG-rtTA의 μg의와 PB-tetO2-IRES-OKMS 1 μg의 혼합.
  2. 무 혈청 배지 100 μL (- DMEM 둘 베코 변형 이글 배지)로 DNA를 희석.
  3. (플라스미드 DNA의 비율로 8 μL 형질 제 2 μg의 (DNA)의 형질 전환 제) (예를 들면, 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene) 형질 감염 시약 8 μL를 추가 1.5 ML의 microcentrifuge 관 함유하는 DNA로.
  4. 실온에서 15 분 동안 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 인큐베이션.
  5. / 웰이 용액의 최종 부피 마우스 AF 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 100 μL를 적하 첨가하고 완만 한 소용돌이로 배포한다. 24 시간 동안 둡니다.
  6. 하루 후, 독시사이클린 1.5 μg의 / ㎖ (각 웰에 대한 미디어 2 mL)으로 보충 된 신선한 만능-AF 배지로 세포를 공급하여 야마나카의 인자 (인 Oct4, Klf4, cMyc, Sox2이)의 발현을 유도한다.
  7. 신선한 DOX 함유 배지 (포인트 5.13까지 독시 싸이클린 보충 미디어에서 세포를 유지)를, 통과하지 않고, 매일 세포를 공급.
  8. mCherry 발현 24 시간 이내에 매일 콜로니 형성 (식민지는 일반적으로 형질 전환 후 20 30 일 사이에 표시)에 대한 세포를 관찰한다.
  9. 하루 콜로니 피킹 전에, 마이 토마 이신 C 처리 된 MEF가있는 96- 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다.
  10. 볼륨 날기의 50 μL에 하나의 식민지를 선택GA 200 μL 피펫, 개별 웰에서 96 웰 플레이트로 순차적으로 전달.
  11. 하루 후, 상용 트립신의 50 μL를 추가하여 하나의 셀에 각 콜로니를 해리하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양한다.
  12. 식민지를 해리하는 아래로 피펫합니다.
  13. 독시 싸이클린 보충 신선한 만능 줄기-AF 매체의 100 μL 가득 96 웰 플레이트 코팅 된 0.1 % 젤라틴에 불 활성화 MEF와 새로운 잘으로 해리 식민지를 포함하는 트립신의 양도 50 μL.
  14. 세포를 60-70 %의 컨 플루 언스에 도달하면, 24 웰 플레이트의 웰에 나누어.
  15. 식민지 독시 싸이클린없는 상태로 나타날 경우 확인이 우물, 독시사이클린없이 독시사이클린 한 다른, 2 : 세포가 60-70%의 합류에 도달하면 1 분할.
  16. IP에-AF 매체에 불 활성화 MEF에, 독시사이클린 독립적 인 만능 줄기-AF 클론을 유지하기 위해 계속합니다.
  17. 채널 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양매일 매체를 anging.

6. 알칼리성 포스파타제 염색

  1. 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이있을 때마다 제조사의 프로토콜은 다음 알칼리성 포스파타제 염색을 수행한다.

7. 면역 형광

  1. 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이 될 때마다, 비활성 MEF있는 24 웰 플레이트의 웰에 150,000 세포 / cm 2 시드, 37 ° C, 5 % CO 2에서 48 시간 동안 세포를 성장한다.
  2. (주의)을 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 웰 당 300 μl를 첨가하여 세포를 고정.
  3. 0.1 % NP-40 Permeabilize 하시려면하는 세포 300 μl를 추가합니다.
  4. 0.1 % PBS-트윈 20의 300 μL로 세포를 씻어.
  5. 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (PBS 1X 10 % 말 혈청) 300 μL를 추가한다.
  6. (1:10 인 Oct4 (1:80), Sox2이 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog를 다음 일차 항체를 사용하여0)과 SSEA1 (1:80). 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청으로 희석 SSEA1 0.3 M 글리신, 0.1 %의 PBS-트윈 -20. 1X PBS 10 % 말 혈청과 다른 모든 항체 희석.
  7. 4 ℃에서 밤새 항체를 품어.
  8. 0.1 % PBS-트윈-20의 300 μl를 씻어.
  9. 1X PBS에서 10 % 말 혈청 희석 보조 항체를 사용 Alexa594 결합 염소 항 - 마우스 IgG (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭고기 방지 염소 IgG를 (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭 항 - 토끼 IgG의를 (1 : 200) Alexa568 결합 염소 항 - 마우스 IgM의 (1 : 200). 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션.
  10. 1X PBS로 씻어.
  11. 1X PBS에서 : 훽스트 용액 (10,000 1)와 얼룩 핵.

체외 세포 분화 8.

  1. 매달려 드롭 배아 체 (사채)을 형성, 분화 배지를 사용하여 배양 접시의 뚜껑에 (2,000 세포 / 20 μL) 한 방울을 육성.
  2. 37 ° C에서 요리를 품다4 일 동안 5 % CO 2.
  3. 분화 배지에서 3 일간 현탁 배양에 100mm 박테리아 수준의 요리로 사채를 전송합니다.
  4. 또 다른 14 일간 (DMEM에서 1:10 희석) 기저막 행렬로 코팅 된 24 잘 번호판 플레이트 사채.
  5. T (1 : 100), αfp (1 : 200) 및 Tubb3 (1 : 500) 37 면역 형광 분석의 경우, 일차 항체를 사용합니다.

9. 생체 기형 종 형성

  1. - / - γC - / - 생쥐 Rag2의 사지의 근육에 1 × 10 6-AF 만능 줄기 세포를 포함하는 1X PBS 100 ㎕를 주입한다.
  2. 육주 세포 주입 후 자궁 전위를 통해 쥐를 희생.
  3. 다음과 같은 분석을위한 쥐의 뒷다리에서, 크기에 의해 구별 종양 덩어리를 제거합니다.
  4. 그라 이오 스탯을 사용하여 이소 펜탄 냉동 종양의 7 ~ 10 μm의 두께 횡단면을 잘라.
  5. 헤 마톡의에 대한D의 에오신 (HE) 얼룩 :
    1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 종양 조직 구성을 평가하는 HE와 얼룩.
  6. immunoperoxidase 얼룩의 경우 :
    1. 실온에서 15 분 동안 4 % PFA로 기형 섹션을 고정한다.
    2. 0.1 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면.
  7. 다음 항체와 인큐베이션 : Tubb3 (1 : 100) αfp (1시 50분) 및 αSMA (1 : 100) 1X PBS에 1 % BSA에서 희석한다. 1 (Tubb3 용) 37 ° C에서 시간 또는 밤새 4 ° C에서 (다른 항체)에 대한 품어.
  8. 20 분 동안 100 % 메탄올을 사용하여 블록 옥시다아제.
  9. 37 ° C에서 45 분 동안 품어 HRP - 복합 (1 : 150) 이차 항체 항 - 마우스는.
  10. 1X PBS로 씻어.
  11. 5 분 동안 퍼 옥시 다제 (HRP) 기판 (재료 표 참조)에 품어.
  12. 5 분 동안 수돗물로 씻어.
  13. 9 초 동안 헤 마톡 QS로 얼룩.
  14. 수돗물로 씻어.

    15. 세포에서 10 RNA 추출

    1. 제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용합니다.

    기형 종에서 11 RNA 추출

    1. 샘플을 해동 피하기 위해 봉과 박격포와 액체 질소를 사용하여 기형 종을 균질화.
    2. 조직의 25 mg의 무게.
    3. RNA 추출을위한 상용 시약 1 mL의 클로로포름 200 μL를 추가합니다.
    4. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
    5. 13,000 XG에 원심 분리기 15 분 동안 4 ° C.
    6. 새로운 튜브에 클리어 뜨는을 전송합니다.
    7. RNA의 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용 정화합니다.

    (12) 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 분석

    1. 역전사 (RT) -polymerase 연쇄 반응 (PCR)과 올리고 (DT) 코르위한 역전사 효소를 이용하여 제 1 가닥 cDNA의 합성제조 업체의 프로토콜 땡은 50 NG / cDNA를 μL을 얻었다. 10 NG / μL의 농도의 RNase없는 물과 cDNA를 희석.
    2. RT-PCR은 1 NG를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 폴리머 라 아제를 사용하여 수행 / μL의 cDNA.

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결과

프로그래밍의 능력을 평가하기 위해 마우스 AF 세포를 GFP 마우스의 태아로부터 수집 하였다. 세포는 솔더 (Soler) (a 독시사이클린 - 유도 방식으로 mCherry 형광 단백질에 연결된 야마나카 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)를 나타내고, 원형 트랜스포존 플라스미드 PB-tetO2-IRES-OKMS, 형질 및 테트라 사이클린 transactivator 역방향했다 CAG-rtTA)은 트랜스의 발현 플라스미드 (mPBase)와 함께 플라스미드. 마우스 AF 세포는 MEF 피더 레이어를 통해 체외 확장 1 주 이후 인 Oct4, Klf4, cMyc 및 Sox2이 형질했다. 앞서 설명한대로 39 외인성 인자의 발현을 위해, 독시사이클린은 1.5 μg / ml의 농도 형질 다음날 하였다. mCherry의 발현 형질을 나타내는 독시사이클린 추가에서 24 시간 후에 볼 수 있었다. ES-같은...

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토론

능성의 유도를 얻기 위해 선택된 방법은 장기 이식에 대한 임상 세포의 안전을 위해 적합하다. 요즘 프로그래밍에 적합한 여러 가지 방법이 있습니다. 비 통합 방법 중에서, 센다이 바이러스 (SEV) 벡터는 감염된 세포의 핵 (40)로 통합하지 않고 대량의 단백질을 생산할 수 및 만능 줄기 세포를 수득하기위한 전략 될 수있는 RNA 바이러스이다. SEV 벡터는 병진 급 IPS 세포의 생성을위한 매력적인 후보가 될 수 있지만, 몇 가지 단점을 나타낸다. 리플리 바이러스는 유전자 서열의 특성에 민감하다. SEV 벡터가 구조적으로 복제하기 때문에, 서로 다른 전략이 측면 (41), (42)을 개선하기 위해 사용되는 경우에도, 숙주 세포로부터 제거하기 어렵다. 이 같은 레벨 2 생물 안전 캐비닛 등의 특수 처리가 필요합니다. 이 전하나의 상용 공급 업체가 사용할 수에요. 프로그래밍에 대한 임...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 작업은 CARIPARO 재단 보조금 번호 13/04 및 Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza 보조금 번호 10/02의 지원을 받았습니다. 마르티나 피콜리(Martina Piccoli), 키아라 프란진(Chiara Franzin), 미켈라 포조본(Michela Pozzobon)은 Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza의 지원을 받습니다. 엔리카 베르탱(Enrica Bertin)은 카리파로 재단(CARIPARO Foundation) 보조금 번호 13/04의 지원을 받습니다. Paolo De Coppi는 Great Ormond Street Hospital Children's Charity에서 자금을 지원합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mm 세균 등급 페트리 접시 BD Falcon351029in vitro 차별화
2-메르캅토에탄올 SigmaM6250마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM Thermo Fisher ScientificA210432차 항체 (면역형광)
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG Thermo Fisher ScientificA214682차 항체 (면역형광)
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG Thermo Fisher ScientificA214422차 항체 (면역형광)
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG Thermo Fisher ScientificA110052차 항체 (면역형광)
알칼리성 인산분해효소 키트 Sigma85L1알칼리 인산가수분해효소  염색
암피실린SigmaA0166세균 선택용
소 혈청 알부민 SigmaA7906BSA, 블로킹 솔루션용. RNA
클로로포름SigmaC2432
Thermo Fisher Scientific18265-017클로닝 절차를
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039MEF, 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 배지용
독시사이클린 SigmaD9891외인성 인자 발현용
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 ml) 사르스테트 72.706PB 생산의 경우 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체
FBS용 Thermo Fisher Scientific10270106MEF 매체용
세밀한 포인트 펜치F.S.TDumont #5 AF 절연
젤라틴J.T.Baker131에 희석 된 0.1 %
를 사용하여 차단 용액을 사용했습니다. PBS 1x
Haematoxylin QSVector LaboratoriesH3404핵 검출
;Bio-Optica04-061010기형종 Hoechst의 조직학적 분석
 Thermo Fisher ScientificH3570핵 검출
말 혈청 Thermo Fisher Scientific16050-122차단 용액
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGSantaCruzsc2005보조 항체 (immunoperoxidase)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Peroxidase substrate
Insulin syringe with needle (25 G)TerumoSS+01H25161양수천자 절차
Klf4 SantaCruzsc-20691토끼 다클론 IgG
L-글루타민 Thermo Fisher Scientific25030마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체
LB 브로스 (Lennox)SigmaL3022세균 성장
LIF SigmaL5158마우스 AF 및 iPS-AF 세포용
매체 Matrigel BD354234in vitro 차별화를 위해. DMEM에서 1:10으로 희석됨
메탄올Sigma32213Peroxidase 차단
MULTIWELL 24 웰 플레이트BD Falcon353047in vitro 분화를 위해
MULTIWELL 6 웰 플레이트BD Falcon353046MEF, 마우스 AF 및 iPS-AF 세포 배양
Nanog ReproCELLRCAB0002P-F토끼 다클론 IgG
비필수 아미노산 SigmaM7145마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000차단 솔루션용. PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0세포 투과화용. PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279마우스 단클론 IgG2b
Oligo (dT)에 희석됨 RT-PCR
파라포름알데히드(용액)Sigma441244고정성,
PBS PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, Ca2+/Mg2+ 없음. PBS 1x 페니실린을 얻기 위해 멸균수로 희석됨
- 스트렙토마이신;Thermo Fisher Scientific15070063MEF, 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체
페트리 디쉬 (150 mm)BD Falcon353025MEF 배양, 조직 배양
PiggyBac transposase 발현 플라스미드 Andras Nagy 교수 제공 연구실-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포손 플라스미드: Andras Nagy 연구실-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663플라스미드 정제용
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106플라스미드 정제용
역 테트라사이클린 트랜스액티베이터 트랜스포존 플라스미드 교수 Andras Nagy 실험실-rtTA
RNeasy Mini Kit  제공;Qiagen74134RNA 추출용
Sox2 SantaCruzsc-17320염소 다클론 IgG
SSEA1 Abcamab16285마우스 단클론 IgM
SuperScript II 역전사효소 Thermo Fisher Scientific18064-014RT-PCR
T Abcamab20680토끼 다클론 IgG
Taq DNA 중합효소Thermo Fisher Scientific 10342020PCR
트립신 Thermo Fisher Scientific25300-054세포 배양 패스에이징
Triton X-100Bio-Rad161-047세포 투과화용, PBS 1x
TRIzol 시약Thermo Fisher Scientific15596-026RNA 추출
Tubb3   프로메가 G712A마우스 단클론 IgG1
TWEEN-20SigmaP1379세포 투과화용, PBS 1x&alpha에 희석;
FP     R& D SystemsMAB1368마우스 단클론 IgG1
&알파&SMA Abcamab7817마우스 단클론 IgG2a
트랜스펙션 시약 (FuGENE HD)Promega E2311AF 세포 형질 주입
실체현미경NikonSM2645양수천자를 수행하기 위해 
200 &뮤; l 팁Sarstedt 70.760012박테리아 군집을 선택하기 위해
가위F.S.T14094-11 스테인리스 25U양수 천자를 수행하기 위해 
에탄올시그마2860임산부 댐의 복벽을 청소하기 위해
조직 배양 페트리 접시 (150mm) BD Falcon353025MEF 확장용
미토마이신 CSigmaM4287-2MGMEF 비활성화용
MULTIWELL 96 웰 플레이트BD Falcon353071iPS-AF 배양용
추출 DH5α 세포용 PBS 1x 에 희석 위한 박테리아 은 PBS 1x Glycine Bio-Rad 161-0718에 희석됨에 희석됨 용 PFA용 Thermo Fisher Scientific 18418012, 제공에 희석

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