이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유도만능줄기세포(iPS)는 서로 다른 방법을 사용하여 정의된 전사 인자의 강제 발현에 의해 마우스 및 인간 체세포에서 생성됩니다. 여기서, 우리는 비바이러스 기반 트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 iPS 세포를 생산했습니다. 얻어진 모든 iPS 세포주는 in vitro 및 in vivo에서 3개의 생식층의 유도체로 분화하는 능력을 포함하여 만능 세포의 특성을 보였습니다. 이 전략은 선천적 결함에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위해 병에 걸린 태아의 세포를 사용할 수 있는 가능성을 열어줍니다.
서론
산전 진단은 유전 질환 (즉, 염색체 이상, monogenetic 또는 인성 / polygenetic 질환)과 선천성 기형 (즉, 선천성 횡격막 탈장, 낭포 성 폐 병변, exomphalos, 배벽 갈림 증)을 평가하는 중요한 임상 도구입니다. 양수 (AF) 세포는 임신의 두 번째 임신 중 정기적으로 예약 절차에서 획득하는 간단한 (즉, 양수 천자 및 amnioreduction) 또는 제왕 절개 섹션 1, 2입니다. 태아 또는 신생아 환자 AF 세포의 이용은 재생 의학이 소스를 사용할 수있는 가능성을 제공하고, 여러 연구자들은 AF 3, 4, 5, 6에서 분리 된 줄기 세포 집단을 사용하여 서로 다른 조직 손상 또는 질환을 치료하는 가능성을 조사7, 8, <....
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프로토콜
모든 절차 이탈리아 법에 따라했다. 쥐의 AF 샘플은 GFP라는 C57BL / 6-Tg는 (UBC-GFP) 30Scha / J 마우스에서 13.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 한 쥐에서 수확했다.
1. 트랜스포존 생산
주 : 트랜스포존 발현 벡터는 표준 클로닝 방법을 사용하여 생성 하였다. 마우스 AF 세포 형질 전환 용 플라스미드 DNA 상업용 키트를 사용하여 제조 하였다.
- 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 DH5α 박테리아의 50 μL와 플라스미드 DNA 10ng의 섞는다. 20 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 품어.
- 40 초 동안 42 ° C에서 열 충격.
- 2 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 놓습니다.
- 미리 예열 (37 ° C) 원성 국물 (LB) 배지 250 μl를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃ (300 RPM)를 흔든다.
- 0.1 ㎎ / ㎖ 앰피 실린와 LB 플레이트에 각 변형의 30 μl를 확산. 판 건조, 37 ° C 오븐에서 반전 품어 허용ernight.
- 다음날, 오후에, 각각의 변환에서, 멸균 200 μl의 팁을 사용하여,....
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결과
프로그래밍의 능력을 평가하기 위해 마우스 AF 세포를 GFP 마우스의 태아로부터 수집 하였다. 세포는 솔더 (Soler) (a 독시사이클린 - 유도 방식으로 mCherry 형광 단백질에 연결된 야마나카 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)를 나타내고, 원형 트랜스포존 플라스미드 PB-tetO2-IRES-OKMS, 형질 및 테트라 사이클린 transactivator 역방향했다 CAG-rtTA)은 트랜스의 발현 플라스미드 (mPBase)와 함께 플라스미드. 마우스 AF 세포는 MEF 피더 레이어를 통해 체외 확장 1 주 이후 인 Oct4, Klf4, cMyc 및 Sox2이 형질했다. 앞서 설명한대로 39 외인성 인자의 발현을 위해, 독시사이클린은 1.5 μg / ml의 농도 형질 다음날 하였다. mCherry의 발현 형질을 나타내는 독시사이클린 추가에서 24 시간 후에 볼 수 있었다. ES-같은.......
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토론
능성의 유도를 얻기 위해 선택된 방법은 장기 이식에 대한 임상 세포의 안전을 위해 적합하다. 요즘 프로그래밍에 적합한 여러 가지 방법이 있습니다. 비 통합 방법 중에서, 센다이 바이러스 (SEV) 벡터는 감염된 세포의 핵 (40)로 통합하지 않고 대량의 단백질을 생산할 수 및 만능 줄기 세포를 수득하기위한 전략 될 수있는 RNA 바이러스이다. SEV 벡터는 병진 급 IPS 세포의 생성을위한 매력적인 후보가 될 수 있지만, 몇 가지 단점을 나타낸다. 리플리 바이러스는 유전자 서열의 특성에 민감하다. SEV 벡터가 구조적으로 복제하기 때문에, 서로 다른 전략이 측면 (41), (42)을 개선하기 위해 사용되는 경우에도, 숙주 세포로부터 제거하기 어렵다. 이 같은 레벨 2 생물 안전 캐비닛 등의 특수 처리가 필요합니다. 이 전하나의 상용 공급 업체가 사용할 수에요. 프로그래밍에 대한 임.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
이 작업은 CARIPARO 재단 보조금 번호 13/04 및 Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza 보조금 번호 10/02의 지원을 받았습니다. 마르티나 피콜리(Martina Piccoli), 키아라 프란진(Chiara Franzin), 미켈라 포조본(Michela Pozzobon)은 Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza의 지원을 받습니다. 엔리카 베르탱(Enrica Bertin)은 카리파로 재단(CARIPARO Foundation) 보조금 번호 13/04의 지원을 받습니다. Paolo De Coppi는 Great Ormond Street Hospital Children's Charity에서 자금을 지원합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100mm 세균 등급 페트리 접시 | BD Falcon | 351029 | in vitro 차별화 |
| 2-메르캅토에탄올 | Sigma | M6250 | 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체 |
| Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | 2차 항체 (면역형광) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | 2차 항체 (면역형광) |
| Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | 2차 항체 (면역형광) |
| Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 2차 항체 (면역형광) |
| 알칼리성 인산분해효소 키트 | Sigma | 85L1 | 알칼리 인산가수분해효소 염색 |
| 암피실린 | Sigma | A0166 | 세균 선택용 |
| 소 혈청 알부민 | Sigma | A7906 | BSA, 블로킹 솔루션용. RNA |
| 클로로포름 | Sigma | C2432 | |
| Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | 클로닝 절차를 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | MEF, 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 배지용 |
| 독시사이클린 | Sigma | D9891 | 외인성 인자 발현용 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 ml) | 사르스테트 | 72.706 | PB 생산의 경우 |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체 |
| FBS용 | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | MEF 매체용 |
| 세밀한 포인트 펜치 | F.S.T | Dumont #5 | AF 절연 |
| 젤라틴 | J.T.Baker | 131 | 에 희석 된 0.1 % |
| 를 사용하여 차단 용액을 사용했습니다. PBS 1x | |||
| Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | 핵 검출 |
| ; | Bio-Optica | 04-061010 | 기형종 Hoechst의 조직학적 분석 |
| Thermo Fisher Scientific | H3570 | 핵 검출 | |
| 말 혈청 | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | 차단 용액 |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | 보조 항체 (immunoperoxidase) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
| Insulin syringe with needle (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | 양수천자 절차 |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | 토끼 다클론 IgG |
| L-글루타민 | Thermo Fisher Scientific | 25030 | 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체 |
| LB 브로스 (Lennox) | Sigma | L3022 | 세균 성장 |
| LIF | Sigma | L5158 | 마우스 AF 및 iPS-AF 세포용 |
| 매체 Matrigel | BD | 354234 | in vitro 차별화를 위해. DMEM에서 1:10으로 희석됨 |
| 메탄올 | Sigma | 32213 | Peroxidase 차단 |
| MULTIWELL 24 웰 플레이트 | BD Falcon | 353047 | in vitro 분화를 위해 |
| MULTIWELL 6 웰 플레이트 | BD Falcon | 353046 | MEF, 마우스 AF 및 iPS-AF 세포 배양 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 토끼 다클론 IgG |
| 비필수 아미노산 | Sigma | M7145 | 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체 |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | 차단 솔루션용. PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | 세포 투과화용. PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | 마우스 단클론 IgG2b |
| Oligo (dT)에 희석됨 | RT-PCR | ||
| 파라포름알데히드(용액) | Sigma | 441244 | 고정성, |
| PBS PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, Ca2+/Mg2+ 없음. PBS 1x 페니실린을 얻기 위해 멸균수로 희석됨 |
| - 스트렙토마이신; | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | MEF, 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체 |
| 페트리 디쉬 (150 mm) | BD Falcon | 353025 | MEF 배양, 조직 배양 |
| PiggyBac transposase 발현 플라스미드 | Andras Nagy 교수 제공 연구실 | - | mPBase |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포손 플라스미드 | : Andras Nagy 연구실 | - | PB-tetO2-IRES-OKMS |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | 플라스미드 정제용 |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | 플라스미드 정제용 |
| 역 테트라사이클린 트랜스액티베이터 트랜스포존 플라스미드 | 교수 Andras Nagy 실험실 | - | rtTA |
| RNeasy Mini Kit 제공; | Qiagen | 74134 | RNA 추출용 |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | 염소 다클론 IgG |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | 마우스 단클론 IgM |
| SuperScript II 역전사효소 | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | RT-PCR |
| T | Abcam | ab20680 | 토끼 다클론 IgG |
| Taq DNA 중합효소 | Thermo Fisher Scientific 10342020 | PCR | |
| 트립신 | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 세포 배양 패스에이징 |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | 세포 투과화용, PBS 1x |
| TRIzol 시약 | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | RNA 추출 |
| Tubb3 | 프로메가 | G712A | 마우스 단클론 IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | 세포 투과화용, PBS 1x&alpha에 희석; |
| FP | R& D Systems | MAB1368 | 마우스 단클론 IgG1 |
| &알파&SMA | Abcam | ab7817 | 마우스 단클론 IgG2a |
| 트랜스펙션 시약 (FuGENE HD) | Promega | E2311 | AF 세포 형질 주입 |
| 실체현미경 | Nikon | SM2645 | 양수천자를 수행하기 위해 |
| 200 &뮤; l 팁 | Sarstedt | 70.760012 | 박테리아 군집을 선택하기 위해 |
| 가위 | F.S.T | 14094-11 스테인리스 25U | 양수 천자를 수행하기 위해 |
| 에탄올 | 시그마 | 2860 | 임산부 댐의 복벽을 청소하기 위해 |
| 조직 배양 페트리 접시 (150mm) | BD Falcon | 353025 | MEF 확장용 |
| 미토마이신 C | Sigma | M4287-2MG | MEF 비활성화용 |
| MULTIWELL 96 웰 플레이트 | BD Falcon | 353071 | iPS-AF 배양용 |
참고문헌
- You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
- Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection.
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