진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

요약

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

초록

이러한 폐, 간, 뼈 등의 보조 사이트에 전이가 약 90 % ^1의 사망률과 외상 이벤트입니다. 이러한 사이트 중 폐 인해 몸, 섬세한 자연과 적절한 생리 유지에 중요한 역할 내에서 밀폐 된 위치로 생체 내에 광학 영상을 사용하여 평가하기가 가장 어렵다. 임상 양상 (양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT)이)이 조직의 비침 이미지를 제공 할 수있는 반면, 한 번의 픽셀과 초기 시드 이벤트를 시각화하는데 필요한 해상도를 결여 거의 천 세포로 구성. 단지 종양 세포의 도착 후 이벤트가 생존과 이후의 성장에 결정적 전이성 폐 시드 가정의 현재 모델. 이 단일 세포 ^분석이 실시간으로 생체 내에 이미징 도구 시딩 CEL의 표현형을 정의하기 위해 필요하다는 것을 의미LS는이 모델을 테스트합니다. 폐의 고해상도 광학 영상은 다양한 생체 제제를 사용하여 수행되었지만, 이러한 실험은 전형적으로 단일 시간 시점 분석하고 (인해 대폭 변화된 환경 온도 풍부, 사이토 카인 등 아티팩트 가능한 잘못된 결론에 취약 ) 흉강 및 순환 시스템 ^3에서 제거한. 최근 작품은 진공 그러나 영상 창 ^{2,4,5 안정화} 사용 가능한 그대로 폐의 시간 경과 생체 내에 광학 영상입니다 보이고있다 일반적인 영상 시간은 약 6 시간으로 제한되어있다. 여기에서 우리는 12 시간의 기간에 걸쳐 이러한 윈도우를 이용한 폐의 장기간 생체 내에 촬영 된 영상을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법을 사용하여 얻어진 시간 경과 이미지 시퀀스는 폐의 시각화 및 세포 - 세포 상호 작용의 정량, 막 역학과 혈관 관류 수 있습니다. 우리는 더 라폐의 미세 혈관의 전례 명확한 도면을 제공하는 영상 처리 기술을 방접원을 그리다.

서론

고해상도 생체 내에 광학 영상은 단일 셀 및 하위 세포 매개 변수 측정 및 정량화 될 수 있도록 다수의 생물학적 과정을 이해하는데 중요한 것으로 입증되었다. 암 연구에서, 종양 및 기질 세포의 생체 내에 영상은 그대로 동물에만 존재하는 많은 미세 환경의 상호 작용 ^6-11의 발견하게되었다.

생체 내에서 단일 세포 해상도 광학 영상을 이용하여 유방암 intravasation 및 종양 세포의 보급과 관련된 미세 환경에 대한 발견은 심지어 예후 유방암 환자의 ^12-16 치료에 대한 반응에 대한 신규 마커하게되었다. 그대로 내부 중요한 장기 내에서 깊은 볼에 사용할 수있는 최고의 영상 기술은 전체 기관의 뛰어난 전망을 제공하고 임상 증상을 생산하기도 전에 병리을 표시 할 수있는 임상 양상 (MRI, PET, CT)입니다. 그들은 수없는, 시간owever 때문에 단일 셀 해상도의 부족으로 종양의 진행을 구동 전이의 초기 단계와 세포 메커니즘을 공개합니다. 그 때까지는 폐 전이가이 양식에서 볼 수 있습니다, 그들은 잘 설립 및 확산된다. 그들은 훨씬 이전에 이미 도달 생존의 초기 단계 촬상 ¹⁹ 예상보다 도착 파종 성 종양의 폐에 도달하거나 ^{17 생존하지} ....

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 알버트 아인슈타인 대학의 사전 승인을 포함한 척추 동물의 사용에 대한 지침과 규정에 따라 수행되었다.

1. 생성 형광 표지 된 마우스 모델 및 종양 세포

1. PBS 100㎖로 BSA 0.1 g을 혼합하여 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민 / 인산 완충 생리 식염수 (BSA / PBS) 완충액 100 ㎖를 준비한다.
2. 안정적인 형질 전환에 의해 형광 표지 된 종양 세포를 준비합니다.
   참고 : 여기에서 우리는 E0771-LG 세포, 정맥 부모 E0771 셀 ^(38)를 주입 C57BL / 6 마우스의 폐에서 개발 된 전이성 종양에서 고립 된 E0771 마우스 유방 선암 세포 ^(37)의 높은 전이성 유도체를 사용합니다.
   1. 형질 전환 이전에 24 시간, 플레이트 (1) × 10 antibio 2 ㎖에 60mm 조직 배양 접시에 ⁵ EO771-LG 세포틱 무료 10 % FBS (소 태아 혈청) DMEM (둘 베코의 변형 이글 중간) 및 37 ° C에서 품어 5 % CO _2.
   2. 트랜시, 혈청 감소 배지 190 μl를 첨....

결과

이 방법으로 얻을 수있는 결과의 유형을 설명하기 위해, 수술 전에 시점 변화에 MacBlue 마우스 ^(44)의 꼬리 정맥에 형광 단백질 클로버 표지 E0771-LG 종양 세포 주입. 수술 후, 155 가와사끼 로다 민 표지 된 덱스 트란은 혈관과 시간 경과 영상이 수행 된 표시하는 IV를 주입 하였다.

쥐 24 시간 후 분사를 이미징 할 때, 하나의 세포는 대 식세포와 단핵 세포와의 상호 작용, 혈관의 안쪽에 볼 수 있습니다. 이것의 예는도 2A (보조 영화 1)에 나타낸다. 그것은 일시적 거주자의 대 식세포 (시안)과 상호 작용으로 여기에 12 μm의 깊이가 폐 혈관에 박혀 독방 종양 세포 (녹색)의 단일 광학 부분은 5 시간 20 분에 걸쳐 이미징된다. 혈관은 고 분자량 덱스 .......

토론

단백질 및 항체로 형광 표지 기능 태그와 함께 생체 광학 영상에서 높은 해상도는 전이성 캐스케이드에 대한 우리의 이해를 증가 극적으로했다. 이는 직접적인 시각화 및 단일 셀 및 종양 세포의 서브 세포 매개 숙주 세포 및 미세 정량화있게되었다. 기본 종양 내에서이 영상은 성장 침입 또는 보급 ^6,7 중 하나의지지 이산 미세 환경의 발견, 예를 들어, 주도하고있다. 침략의 경우, 생체 내 이미징은 intravasation ^7,50에서 대 식세포 및 종양 세포의 공동 migrational 스트리밍의 우선적 인 역할을 공개했다.

폐와 같은 보조 사이트, 종양 세포의 하나의 작은 그룹이 도착했을 때, 전이의 초기 단계에서 종양 세포 행동의 역학을 이해하는 사전 미세 전이의 시드 단계를 포함 및상기 혈관 내피 세포와 상호 작용 만 고해상도 광학 영상을 이용하여 달성된다. 표준 임상 이미징을 모세관 층.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
니켈 도금 황동 진공 레귤레이터 1/8 NPT 여성, 게이지 포함, 0 - 20" Hg 진공 청소기	McMaster Carr	4172K12	진공 레귤레이터
1/4" 호스 ID x 1/8" NPTF 남성 파이프용 황동 가시 호스 피팅 어댑터	McMaster Carr	5346K13	진공 조절기 호스 어댑터
Pyrex 브랜드 필터링 플라스크와 튜뷸레이션; 고무 마개 No. 4용 넥 툴링; 용량: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	진공 플라스크
라운드 글라스 커버슬립 두께 #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	테드 펠라, Inc.	260368	커버 슬립
Exel International 일회용 Safelet I.V. 카테터; 22 g x 1 in.	Exel International	26746	기관 카테터
PERMA-HAND 블랙 브레이디드 실크 봉합사, ETHICON LIGAPAK 디스펜싱 릴 사이즈 2-0	VWR	95056-992	스트링
리퀴드 슈퍼 글루, 클리어, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate 접착제
Tetramethylrhodamine isothiocyanate– Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD Dextran
실험실 투명 Tygon PVC 튜브, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" 벽 두께, 25피트 길이	McMaster Carr	5155T12	얇은 튜브 및 루어
균열 저항성 폴리에틸렌 튜빙용 튜빙, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" 벽 두께, 흰색, 50피트 길이	맥마스터 카	5181K24	두꺼운 튜빙
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MoFlo 형광-활성화 세포 분류기	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 &마이크로; m Mesh	Falcon	352235
96 웰 플레이트	Costar	3599
60mm 배양 접시	코닝	430196
10cm 배양 접시	코닝	353003
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A4503
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J 마우스	잭슨 연구소	000664
김 와이프	피셔 사이언티픽	06-666-A

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