방법 논문

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

DOI:

10.3791/54608

⸱

2016년 10월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

초록

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포유류의 망막 신경 세포는 여러 종류로 이루어지는 층상 티슈이다. 그 복잡한 시냅스 네트워크 내에서 처리하는 방법을 시각적 신호를 이해하기 위해, 전기 생리 녹음 자주 개별 뉴런 사이의 연결을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 마우스 망막의 GCL (신경절 세포 층) 및 INL 모두 유 전적으로 표시 뉴런의 패치 클램프 기록 (내부 핵 층)에 대한 평면 장착 준비를 최적화했다. 수직 및 횡 방향 모두 연결이 전 구성에 보존되어 있기 때문에 평면 마운트에 기록 INL 신경 세포를 연구하는 많은 측면 구성 요소와 망막 회로를 허용 조각을 통해 선호한다. 우리는 콜린성 스타 버스트 무 축삭 세포 (보안 인증)으로 망막의 거울 트너가 신경 세포의 반응을 비교하기 위해이 절차를 사용하고 있습니다.

서론

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망막은 중추 신경계에서 쉽게 접근할 수 있는 부분으로서 수십 년 동안 신경 과학 연구에서 유용한 모델이었습니다. 뉴런의 유전적 표시는 망막의 시냅스 연결을 자세히 특성화할 수 있게 해주었습니다. 망막 뉴런의 기능과 형태를 조사하는 데 사용할 수 있는 많은 방법론을 통해 패치 클램프 기록 기술은 망막에서 수직으로 전달된 신호에 대한 현재 이해에 중요한 역할을 했습니다. 이러한 신호는 광수용체의 광자 흡수에서 비롯되어 망막 신경절 세포(RGC)의 스파이크를 통해 뇌 시각 중추로 보내집니다. 지금까지 축적된 많은 지식에도 불구하고 혈관화된 포유류 망막의 신경 다양성은 해결되지 않은 상태로 남아 있으며 정상적인 시력을 제공하는 망막 회로의 완전한 인식을 방해합니다. 이것은 부분적으로는 대부분의 녹음이 더 많은 근위 망막 뉴런1-3에 접근하기 위해 측면 회로 무결성을 교환하기 위해 망막 절편에서 수행되었기 때문입니다. 따라서 망막이 시각 신호를 계산하는 방법에 대한 포괄적인 그림을 얻기 위해서는 크고 작은 측면 연결이 더 잘 보존될 수 있는 플랫 마운트에 뉴런을 기록하는 것이 바람직합니다.

탈분극 양극성 세포4-6에서 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6) 신호 경로의 결함으로 인해 광수용체에서 양극성 세포로의 시냅스 전달이 중단되거나 단순히 퇴행성망막 7-10의 광수용체 손실로 인해 많은 망막 신경절 세포가 진동 활동을 보입니다. 이러한 진동은 여러 출처에서 발생하지만, AII 무축삭 세포(AII-ACs)와 탈분극 원뿔 양극성 세포(DCBC) 사이의 간극 접합 결합과 관련된 진동이 가장 주목을 받았기 때문에 가장 잘 이해되고 있습니다1,7,11. 우리는 앞서 언급한 AII-AC/DCBC 네트워크의 약리학적 차단에도 지속되고 탈구성 망막을 가진 RhoΔCTA 및 Nob 마우스에서 OFF-type SAC의 진동을 유도하는 또 다른 소스를 찾았습니다7,8,12. 여기에서는 INL 뉴런 기록을 위해 망막 플랫 마운트를 준비하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 접근 방식은 상용 마우스 라인(Jax, 재고 번호 006410 및 007905)을 사용하여 콘트라스트 향상 광학 장치가 장착된 형광 현미경에서 식별할 수 있는 형광 단백질(tdTomato) 발현으로 콜린성 망막 뉴런을 표시합니다. 이 접근법을 통해 얻은 일부 실험 결과는 이전에 보고된 바 있다4,5,7,13.

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프로토콜

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윤리 승인 - 기관 동물 관리의 승인과 의학의 베일러 대학의위원회를 사용할 때 동물 주제와 관련된 절차, 규칙 및 연구 동물을위한 건강 지침의 국립 연구소의 규정에 따라 실시 하였다.

1. 외부 및 내부 솔루션

  1. 망막 박리시 이후 전기 생리 녹음에 외부 솔루션으로 포유 동물의 링거액을 사용합니다. 기록의 날 (칼슘)없이 10 배 원액에서 포유 동물의 링거액을 준비하고 carbogenation 15 분 (95 % O 2, 5 % CO 2) 후 염화칼슘 2 드롭 현명한을 추가합니다. 최종 1X 용액은 (mM 단위로)의 NaHCO3 0.8 나 2 HPO 4 0.1의 NaH 2 PO 4,이 CaCl2를 1 황산 10 D 글루코오스 (120)의 NaCl, 5 KCl을 25.
  2. SAC 진동을 특성화하기 위해 두 개의 내부 솔루션을 사용합니다. 테스트성인 마우스 망막 신경절 세포에 장기간 전체 셀 패치 클램프 녹음에 준비된 솔루션의 유용성과는 사용할 때까지 -20 ° C에서 500 μL 씩의 확인 배치를 저장합니다.
    1. 막 잠재적 인 진동을 기록, (mm 단위)가 포함 된 칼륨 기반 내부 솔루션을 사용 : 125 K-글루코 네이트, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 및 0.2 % biocytin (/ w V). KOH와 7.3의 pH를 조정합니다.
    2. (100 CS-메탄, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 0.2 % biocytin : 흥분성과 억제 성 시냅스 후 전류를 기록, (mm 단위)가 포함 된 세슘 기반 내부 솔루션을 사용 w / V). CsOH와 7.3의 pH를 조정합니다.

기록의 날 2. 준비

  1. 개방 구멍 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조하기 위해, 수동으로 무딘 16 G 주사기 바늘로 이루어진 사용자 정의 펀칭기로 막을 펀치 개의 깨끗한 유리 플레이트 사이의 평탄 막. 도매상에 대한, 망막 마운트 직경 중앙 구멍을 0.2 mm을 직경 1-1.2 mm이다 4 큰 구멍으로 그것을 둘러싸고 있습니다.
  2. 전극에 내부 솔루션을로드하기위한 사용자 정의 백필 필라멘트하려면 중간에 10 μL 피펫 팁을 용해하고 냉각 및 경화 될 때까지 부드럽게 녹아 부분을 길게. 직전, 사용이 약간 긴 패치 피펫보다 때까지 필라멘트를 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다.
  3. 내부 필라멘트와 붕규산 유리 관에서 프로그램 풀러에 패치 피펫을 당깁니다. 실험 당일 가능한 Micropipette 제조 및 즉시 사용합니다.
    참고 : 열 : 기록 주머니를 들어, 우리는 다음과 같은 풀러 설정 사용 484; 당기 : 0; 속도 : 25; 시간 지연 : 1; 압력 : 400, 462 붕규산 튜브의 OD 및 ID의 램프 값은 각각 1.65 mm, 1.0 mm이다. 피펫의 저항은 10-14 MΩ이다.
  4. 한 시간 조직 수확하기 전에, 샤키하여 내부 용액의 튜브를 해동> 30 분 동안 소용돌이에 겨.

3. 망막 해부

  1. 동물이 발가락 핀치에 응답을 잃을 때까지 산소에 4 % 이소 플루 란으로 동물을 마취. 자궁 전위에 의해 동물을 희생.
  2. 멀리 직선 지적 홍채 가위로 시신경 헤드 1-2mm의 시신경 오프 모두의 시선을 잘라.
  3. 혈액을 제거하고 carbogenated 포유 동물 링거액에서 그들을 젖어 깨끗한 종이 타월에 눈알을 굴립니다. 23 G 바늘로 윤부에 구멍을 펀치와 마이크로 가위로 윤부를 따라 절단하여 시선을 이등분. 미세 집게를 사용하여 각막과 렌즈를 제거합니다.
    1. 망막 전체 마운트를 들어, 부드럽게 미세 집게와 색소 상피 오프 전체 망막 박리 및 시신경의 머리를 향해 가장자리에서 4 1.5-2 mm 직교 인하합니다.
  4. 접시에 천공 니트로 셀룰로오스 막 담가 부드럽게 그것을 통해 망막을 드래그GCL면을 위로. 전체 마운트 망막을 준비 할 때 중앙 홀에 시신경의 머리를 놓습니다. 또 다른 깨끗한 접시에 망막과 멤브레인을 전송합니다. 부드럽게 몰타 십자가 모양과 구멍을 통해 네 개의 모서리를 배치하기 위해 미세 페인트 브러시와 망막을 평평.
    1. 망막의 일부가 한 번에 조사 할 경우, 색소 상피 세포가 부착 상태를 유지하여 면도날 3-4 개로 단계 3.3에서 제조 한 각각의 아이 컵 잘랐다. carbogenated 외부 용액에 빛에서 사용되지 않는 부분을 보호하고 12 시간 내에서 사용합니다.
  5. 건조 필터 종이와 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 가릴와 집게로 유리체 및 내부 경계 막 및 페인트 브러시를 제거합니다.
  6. 모든 망막 가장자리가 완전히 바닥에 밀봉 된 유리 커버 슬립으로 기록 챔버로 어셈블리를 전송하기 전에 막에 부착되어 있는지 확인하십시오. 커버 슬립과 rehydrat에 진공 그리스와 멤브레인을 고정외부 솔루션 망막 전자. 어셈블리 아래에 공기 방울 트랩에주의하지 말라.
  7. 직립 현미경의 무대에 챔버를 설정합니다. 분당 ~ 3 ㎖의 속도로 따뜻한 (34-35 ℃) carbogenated 외부 용액으로 관류 챔버.
  8. 미분 간섭 대비 (DIC) 및 / 또는 표면 형광 아래 GCL 및 INL 뉴런을 볼 수있는 60 배 물 침지 렌즈를 사용하여 먼저 10 배 대물 렌즈에서 망막을 검사합니다. tdTomato 발현 보안 인증을 시각화 흰색은 554 나노 미터의 여기 필터 및 581 나노 미터의 방출 필터와 조합 된 LED 광원을 사용한다.

평면 마운트 망막 4. 전체 셀 패치 클램프 녹음

  1. 사용자 지정 백업 광고 필라멘트에 주사기 필터를 통해 내부 솔루션을 필터링합니다.
  2. 갓 뽑아 마이크로 피펫으로 필라멘트를 삽입하고 솔루션>의은 전극 와이어를 커버 할 때까지 끝 근처의 내부 솔루션을 분배5mm. 가압 또는 튜브에 연결된 10 ㎖ 플라스틱 주사기의 플런저를 당김으로써 조정될 수있는 전극 내부의 압력을 통해 흡입 극 전극 홀더 상에 마이크로 피펫을 고정.
  3. 목적 아래 피펫을 찾아 망막 위 ~ 100 μm의 아래로 가져. 전류 종동 모드 (I = 0)에서 DC가 기립 DC 전압 신호를 제로로 오프셋을. 이 욕에있는 동안 피펫을 고정 크기의 구형파 전류를 주입 전류 클램프 (I 클램프) 모드에서 피펫 저항을 측정하고 Raccess 노브를 돌려서 차이를 중화. 옴의 법칙에 의해 피펫 저항을 계산하기 위해 Raccess 노브에 읽기를 사용합니다.
  4. 천천히 10 μm의 망막 위의 전극에 ~를 가져온다. 전극에 긍정적 인 압력을 적용합니다. 이 망막에 접근 피펫 팁 근처의 반사 변화를보십시오. 신속하게 그러나 부드럽게 GCL에 피펫을 강제하고 긍정적 인 pressu을 감소즉시 다시.
  5. 표지 된 신경 세포를 향해 피펫을 이동합니다. 다른 신경, 혈관과 뮐러 세포의 endfeet 접촉하지 마십시오. 전극의 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 긍정적 인 압력을 적용합니다.
  6. 딤플이 보일 때까지 레이블 신경 세포의 중간 선 근처에 피펫 팁을 배치합니다. 긍정적 인 압력을 해제하고 세포막은 피펫 팁에 다시 반송 할 수 있습니다.
  7. 기가 옴 밀봉의 형성을 돕기 위해 피펫 20 120 pA에 부정적인 전류를 적용합니다. 피펫으로 세포막을 당길 필요 부드러운 흡입을 적용한다. 세포막을 파열 인감 형성 후 5 분을 기다립니다. 이 누출 된 내부 솔루션은 superfusion에 의해 삭제 될 수 있습니다. 부드럽게 흡인 막 파열.
  8. 막 파열 후 현재 클램프 모드에있는 동안, 다리의 균형을 전환하고 Raccess 노브를 사용하여 조정합니다.
    주 : 어떤 경우 SAC 같은 작은 세포의 경우, 단지 약간의 조정이 필요하다. Alternatively, 기록 흥분성 각각 (0 MV 주위)에 (-75 MV 주변) 클로라이드의 반전 전위에서 셀과 글루타메이트를 유지하여 전압 클램프 모드 (V 클램프)의 억제 시냅스 전류. 확인하고 가끔 망막 및 / 또는 미세 조작기 드리프트를 수용하기 위해 필요한 경우 피펫 위치를 조정합니다.
  9. 신선에 (예 CNQX, AP5, 피크로 톡신, tubocurarine 등) 및 채널 변조기 (예 flupirtine, 도파민 meclofenamic 산 등) 시냅스 차단제 준비 과정 및 약물 치료 전후 막 전위 또는 전류 변화를 기록 할 냉동 주식에서 실험의 날. carbogenated 링거액과 함께 약물을 희석. 관류를 통해 일괄 적으로 적용 할 수 있습니다.
  10. 녹화 후, 부드럽게 소마에서 피펫을 제거합니다. 깨끗한 접시에 실에서 어셈블리를 전송합니다. 분리 및 천공 HOL하지 않고 다른 평평 니트로 셀룰로오스 막에 망막을 재 부착ES는 고정 동안 망막 평탄도를 확인합니다.
  11. RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드에 침지하여 망막 수정. 니트로 셀룰로오스 막에서 망막을 제거하고 1X PBS로 광범위하게 그것을 씻어. 4 ° C (14)에 0.4 % 트리톤 X-100과 1X PBS에 희석 염료 결합 된 스트렙 타비 딘과 O / N 염색으로 기록 된 세포의 형태를 알 수있다. antifade 매체에서 망막을 마운트하고 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 기록 된 세포를 관찰합니다.
    참고 : 휘발성과 독성이 파라 포름 알데히드를 포함하는 절차는 안전을위한 초안 챔버에서 수행되어야한다.

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결과

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ON-와 deafferentated 마우스 망막에서 OFF 형 주머니의 대표적인 녹음은 그림 1에 나타내었다. GCL 및 INL 모두 콜린성 세포를 안정적으로 tdTomato 형광에 의해 식별 및 DIC에서 전체 셀 패치 클램프 녹음 대상이 될 수 있습니다 (그림 1A) 그들의 막 전위 (상단 트레이스) 및 (하단 흔적, 그림 1B)를 구동 시냅스 전류의 진동을 공개합니다. 억제 및 흥분성 시냅스 전류는 전압 클램프 조건 (그림 1B, 바닥 흔적)에서 각각 0 MV과 -75 MV,에서 세포를 잡고 공개됩니다. IPL을 (그림 1C)에서 전형적인 SAC 수지상 arborization 및 층화 수준은 내부적으로 투석 biocytin에 대한 사후 스트렙 타비 딘 염색으로 시각화 할 수 있습니다. 의 리듬과 막...

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토론

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많은 실험실이 준비 15-18을 마운트 평평에서 GCL 신경 세포에서 기록했지만, 우리의 절차는 INL 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 우리는 이에 성공 일상적인 레코딩을위한 중요한 몇 가지 단계를 강조한다.

망막의 신선도 및 평탄성 기록 피펫을 관통 중요하다. 이 점에있어서, 상기 천공 된 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 확고한 부착 최우선 적시 재수 (단계 3.4-3.6)이어서 용액의 과도 흡수에 의해 달성된다. 이 짧은 기간 동안, 보통 미만 30 초, 유리체는 느슨한 젤리처럼 동작 및 박리 할 수있다. 유리체 수동 용액 17,19 또는 18,20 효소 작업에 의해 제거되어 여러 문서 절차에 비해 우리의 기술이 더 효율적이다. 또 다른 자주 사용되는 방법은 각 셀에 대해 빈 패치 피펫을 사용하여 떨어져 내 경계 막 찢어하는 것입니다21, 22를 기록합니다. 우리는 망막을 해체 두려워 인열 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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기술 지원을 해주신 Joung Jang과 Xin Guan에게 감사드립니다. 버지니아 커먼웰스 대학교(Virginia Commonwealth University)의 로리 맥퀴스턴(Rory McQuiston) 박사가 첫 번째 패치 클램프 리그를 설정하고 실험 절차에 대해 조언해 주신 것에 감사드립니다. 전압 클램프 녹음에 대한 제안을 해주신 Samuel Wu 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 EY013811, EY022228 및 비전 코어 보조금 EY002520의 지원을 받습니다. C-KC는 베일러 의과대학의 Alice R. McPherson Retina Research Foundation 기부 의장입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DIC 고정 스테이지 형광 현미경OlympusBX51-WI
MicromanipulatorsSutterMP-225
패치 클램프 증폭기AM 시스템AM2400
AD 컨버터National InstrumentNI-USB-6221
히터 컨트롤러Warner InstrumentTC-324B
인라인 히터Warner InstrumentSC-20
연동 펌프RaininDynamax
피펫 풀러셔터 기기P-1000
필라멘트가 있는 유리관King Precision Glass맞춤형
자극기A.M.P.I.Master-8
BiocytinSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-glucoseSigmaG6152
K-gluconateSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTA시그마E0396
HEPES시그마H4034
KOH시그마P5958
Cs-메탄설포네이시그마C1426
CsOH시그마232041
주사기 필터Nalgene171
1ml 주사기Rainin
10 μ l 피펫 팁Genesee Scientific24-130RL
Streptavidin-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
트 17013002

참고문헌

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  5. Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
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  12. Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
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  22. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).

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재인쇄 및 허가

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태그

tdTomato

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