Summary

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

Published: October 13, 2016
doi:

Summary

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

포유류의 망막 신경 세포는 여러 종류로 이루어지는 층상 티슈이다. 그 복잡한 시냅스 네트워크 내에서 처리하는 방법을 시각적 신호를 이해하기 위해, 전기 생리 녹음 자주 개별 뉴런 사이의 연결을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 마우스 망막의 GCL (신경절 세포 층) 및 INL 모두 유 전적으로 표시 뉴런의 패치 클램프 기록 (내부 핵 층)에 대한 평면 장착 준비를 최적화했다. 수직 및 횡 방향 모두 연결이 전 구성에 보존되어 있기 때문에 평면 마운트에 기록 INL 신경 세포를 연구하는 많은 측면 구성 요소와 망막 회로를 허용 조각을 통해 선호한다. 우리는 콜린성 스타 버스트 무 축삭 세포 (보안 인증)으로 망막의 거울 트너가 신경 세포의 반응을 비교하기 위해이 절차를 사용하고 있습니다.

Introduction

As an easily accessible part of the central nervous system, the retina has for decades been a useful model in neuroscience studies. Genetic marking of neurons has allowed detailed characterization of synaptic connections in the retina. With many methodologies available to examine function and morphology of retinal neurons, the patch clamp recording technique has been instrumental in our current understanding of vertically transmitted signals in the retina. These signals are originated from photon absorption in photoreceptors and sent to brain visual centers through spiking of retinal ganglion cells (RGCs). Despite a large body of knowledge accumulated thus far, neural diversity in vascularized mammalian retina remains unsolved and obstructs the full appreciation of retinal circuits that subserve normal vision. This is in part because most recordings were performed on retinal slices to trade lateral circuit integrity for access to more proximal retinal neurons1-3. To gain a comprehensive picture on how retina computes visual signals, it is thus desirable to record neurons in flat-mounts wherein lateral connections, large and small, may be better preserved.

When synaptic transmission from photoreceptors to bipolar cells is interrupted due to a defective metabotropic glutamate receptor 6 (mGluR6) signaling pathway in depolarizing bipolar cells4-6 or simply as the result of photoreceptor loss in degenerated retinas7-10, many RGCs exhibit oscillatory activities. These oscillations originate from multiple sources, however the one involving gap junction coupling between AII amacrine cells (AII-ACs) and depolarizing cone bipolar cells (DCBCs) has received the most attention and hence is best understood1,7,11. We have found another source, which persists under pharmacological blockade of the aforementioned AII-AC/DCBC network and drives oscillation of OFF-type SACs in RhoΔCTA and Nob mice with deafferentated retinas7,8,12. Here we detail our protocol of preparing retinal flat-mounts for INL neuron recording. This approach uses commercial mouse lines (Jax stock no. 006410 and 007905) to mark cholinergic retinal neurons by fluorescent protein (tdTomato) expression that is identifiable under a fluorescent microscope equipped with contrast enhancing optics. Some experimental results acquired through this approach have been previously reported4,5,7,13.

Protocol

윤리 승인 – 기관 동물 관리의 승인과 의학의 베일러 대학의위원회를 사용할 때 동물 주제와 관련된 절차, 규칙 및 연구 동물을위한 건강 지침의 국립 연구소의 규정에 따라 실시 하였다. 1. 외부 및 내부 솔루션 망막 박리시 이후 전기 생리 녹음에 외부 솔루션으로 포유 동물의 링거액을 사용합니다. 기록의 날 (칼슘)없이 10 배 원액에서 포유 동물의 링거액을 준비하고 carbogenation 15 분 (95 % O 2, 5 % CO 2) 후 염화칼슘 2 드롭 현명한을 추가합니다. 최종 1X 용액은 (mM 단위로)의 NaHCO3 0.8 나 2 HPO 4 0.1의 NaH 2 PO 4,이 CaCl2를 1 황산 10 D 글루코오스 (120)의 NaCl, 5 KCl을 25. SAC 진동을 특성화하기 위해 두 개의 내부 솔루션을 사용합니다. 테스트성인 마우스 망막 신경절 세포에 장기간 전체 셀 패치 클램프 녹음에 준비된 솔루션의 유용성과는 사용할 때까지 -20 ° C에서 500 μL 씩의 확인 배치를 저장합니다. 막 잠재적 인 진동을 기록, (mm 단위)가 포함 된 칼륨 기반 내부 솔루션을 사용 : 125 K-글루코 네이트, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 및 0.2 % biocytin (/ w V). KOH와 7.3의 pH를 조정합니다. (100 CS-메탄, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 0.2 % biocytin : 흥분성과 억제 성 시냅스 후 전류를 기록, (mm 단위)가 포함 된 세슘 기반 내부 솔루션을 사용 w / V). CsOH와 7.3의 pH를 조정합니다. 기록의 날 2. 준비 개방 구멍 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조하기 위해, 수동으로 무딘 16 G 주사기 바늘로 이루어진 사용자 정의 펀칭기로 막을 펀치 개의 깨끗한 유리 플레이트 사이의 평탄 막. 도매상에 대한, 망막 마운트 직경 중앙 구멍을 0.2 mm을 직경 1-1.2 mm이다 4 큰 구멍으로 그것을 둘러싸고 있습니다. 전극에 내부 솔루션을로드하기위한 사용자 정의 백필 필라멘트하려면 중간에 10 μL 피펫 팁을 용해하고 냉각 및 경화 될 때까지 부드럽게 녹아 부분을 길게. 직전, 사용이 약간 긴 패치 피펫보다 때까지 필라멘트를 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다. 내부 필라멘트와 붕규산 유리 관에서 프로그램 풀러에 패치 피펫을 당깁니다. 실험 당일 가능한 Micropipette 제조 및 즉시 사용합니다. 참고 : 열 : 기록 주머니를 들어, 우리는 다음과 같은 풀러 설정 사용 484; 당기 : 0; 속도 : 25; 시간 지연 : 1; 압력 : 400, 462 붕규산 튜브의 OD 및 ID의 램프 값은 각각 1.65 mm, 1.0 mm이다. 피펫의 저항은 10-14 MΩ이다. 한 시간 조직 수확하기 전에, 샤키하여 내부 용액의 튜브를 해동> 30 분 동안 소용돌이에 겨. 3. 망막 해부 동물이 발가락 핀치에 응답을 잃을 때까지 산소에 4 % 이소 플루 란으로 동물을 마취. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 멀리 직선 지적 홍채 가위로 시신경 헤드 1-2mm의 시신경 오프 모두의 시선을 잘라. 혈액을 제거하고 carbogenated 포유 동물 링거액에서 그들을 젖어 깨끗한 종이 타월에 눈알을 굴립니다. 23 G 바늘로 윤부에 구멍을 펀치와 마이크로 가위로 윤부를 따라 절단하여 시선을 이등분. 미세 집게를 사용하여 각막과 렌즈를 제거합니다. 망막 전체 마운트를 들어, 부드럽게 미세 집게와 색소 상피 오프 전체 망막 박리 및 시신경의 머리를 향해 가장자리에서 4 1.5-2 mm 직교 인하합니다. 접시에 천공 니트로 셀룰로오스 막 담가 부드럽게 그것을 통해 망막을 드래그GCL면을 위로. 전체 마운트 망막을 준비 할 때 중앙 홀에 시신경의 머리를 놓습니다. 또 다른 깨끗한 접시에 망막과 멤브레인을 전송합니다. 부드럽게 몰타 십자가 모양과 구멍을 통해 네 개의 모서리를 배치하기 위해 미세 페인트 브러시와 망막을 평평. 망막의 일부가 한 번에 조사 할 경우, 색소 상피 세포가 부착 상태를 유지하여 면도날 3-4 개로 단계 3.3에서 제조 한 각각의 아이 컵 잘랐다. carbogenated 외부 용액에 빛에서 사용되지 않는 부분을 보호하고 12 시간 내에서 사용합니다. 건조 필터 종이와 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 가릴와 집게로 유리체 및 내부 경계 막 및 페인트 브러시를 제거합니다. 모든 망막 가장자리가 완전히 바닥에 밀봉 된 유리 커버 슬립으로 기록 챔버로 어셈블리를 전송하기 전에 막에 부착되어 있는지 확인하십시오. 커버 슬립과 rehydrat에 진공 그리스와 멤브레인을 고정외부 솔루션 망막 전자. 어셈블리 아래에 공기 방울 트랩에주의하지 말라. 직립 현미경의 무대에 챔버를 설정합니다. 분당 ~ 3 ㎖의 속도로 따뜻한 (34-35 ℃) carbogenated 외부 용액으로 관류 챔버. 미분 간섭 대비 (DIC) 및 / 또는 표면 형광 아래 GCL 및 INL 뉴런을 볼 수있는 60 배 물 침지 렌즈를 사용하여 먼저 10 배 대물 렌즈에서 망막을 검사합니다. tdTomato 발현 보안 인증을 시각화 흰색은 554 나노 미터의 여기 필터 및 581 나노 미터의 방출 필터와 조합 된 LED 광원을 사용한다. 평면 마운트 망막 4. 전체 셀 패치 클램프 녹음 사용자 지정 백업 광고 필라멘트에 주사기 필터를 통해 내부 솔루션을 필터링합니다. 갓 뽑아 마이크로 피펫으로 필라멘트를 삽입하고 솔루션>의은 전극 와이어를 커버 할 때까지 끝 근처의 내부 솔루션을 분배5mm. 가압 또는 튜브에 연결된 10 ㎖ 플라스틱 주사기의 플런저를 당김으로써 조정될 수있는 전극 내부의 압력을 통해 흡입 극 전극 홀더 상에 마이크로 피펫을 고정. 목적 아래 피펫을 찾아 망막 위 ~ 100 μm의 아래로 가져. 전류 종동 모드 (I = 0)에서 DC가 기립 DC 전압 신호를 제로로 오프셋을. 이 욕에있는 동안 피펫을 고정 크기의 구형파 전류를 주입 전류 클램프 (I 클램프) 모드에서 피펫 저항을 측정하고 Raccess 노브를 돌려서 차이를 중화. 옴의 법칙에 의해 피펫 저항을 계산하기 위해 Raccess 노브에 읽기를 사용합니다. 천천히 10 μm의 망막 위의 전극에 ~를 가져온다. 전극에 긍정적 인 압력을 적용합니다. 이 망막에 접근 피펫 팁 근처의 반사 변화를보십시오. 신속하게 그러나 부드럽게 GCL에 피펫을 강제하고 긍정적 인 pressu을 감소즉시 다시. 표지 된 신경 세포를 향해 피펫을 이동합니다. 다른 신경, 혈관과 뮐러 세포의 endfeet 접촉하지 마십시오. 전극의 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 긍정적 인 압력을 적용합니다. 딤플이 보일 때까지 레이블 신경 세포의 중간 선 근처에 피펫 팁을 배치합니다. 긍정적 인 압력을 해제하고 세포막은 피펫 팁에 다시 반송 할 수 있습니다. 기가 옴 밀봉의 형성을 돕기 위해 피펫 20 120 pA에 부정적인 전류를 적용합니다. 피펫으로 세포막을 당길 필요 부드러운 흡입을 적용한다. 세포막을 파열 인감 형성 후 5 분을 기다립니다. 이 누출 된 내부 솔루션은 superfusion에 의해 삭제 될 수 있습니다. 부드럽게 흡인 막 파열. 막 파열 후 현재 클램프 모드에있는 동안, 다리의 균형을 전환하고 Raccess 노브를 사용하여 조정합니다. 주 : 어떤 경우 SAC 같은 작은 세포의 경우, 단지 약간의 조정이 필요하다. Alternatively, 기록 흥분성 각각 (0 MV 주위)에 (-75 MV 주변) 클로라이드의 반전 전위에서 셀과 글루타메이트를 유지하여 전압 클램프 모드 (V 클램프)의 억제 시냅스 전류. 확인하고 가끔 망막 및 / 또는 미세 조작기 드리프트를 수용하기 위해 필요한 경우 피펫 위치를 조정합니다. 신선에 (예 CNQX, AP5, 피크로 톡신, tubocurarine 등) 및 채널 변조기 (예 flupirtine, 도파민 meclofenamic 산 등) 시냅스 차단제 준비 과정 및 약물 치료 전후 막 전위 또는 전류 변화를 기록 할 냉동 주식에서 실험의 날. carbogenated 링거액과 함께 약물을 희석. 관류를 통해 일괄 적으로 적용 할 수 있습니다. 녹화 후, 부드럽게 소마에서 피펫을 제거합니다. 깨끗한 접시에 실에서 어셈블리를 전송합니다. 분리 및 천공 HOL하지 않고 다른 평평 니트로 셀룰로오스 막에 망막을 재 부착ES는 고정 동안 망막 평탄도를 확인합니다. RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드에 침지하여 망막 수정. 니트로 셀룰로오스 막에서 망막을 제거하고 1X PBS로 광범위하게 그것을 씻어. 4 ° C (14)에 0.4 % 트리톤 X-100과 1X PBS에 희석 염료 결합 된 스트렙 타비 딘과 O / N 염색으로 기록 된 세포의 형태를 알 수있다. antifade 매체에서 망막을 마운트하고 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 기록 된 세포를 관찰합니다. 참고 : 휘발성과 독성이 파라 포름 알데히드를 포함하는 절차는 안전을위한 초안 챔버에서 수행되어야한다.

Representative Results

ON-와 deafferentated 마우스 망막에서 OFF 형 주머니의 대표적인 녹음은 그림 1에 나타내었다. GCL 및 INL 모두 콜린성 세포를 안정적으로 tdTomato 형광에 의해 식별 및 DIC에서 전체 셀 패치 클램프 녹음 대상이 될 수 있습니다 (그림 1A) 그들의 막 전위 (상단 트레이스) 및 (하단 흔적, 그림 1B)를 구동 시냅스 전류의 진동을 공개합니다. 억제 및 ?…

Discussion

많은 실험실이 준비 15-18을 마운트 평평에서 GCL 신경 세포에서 기록했지만, 우리의 절차는 INL 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 우리는 이에 성공 일상적인 레코딩을위한 중요한 몇 가지 단계를 강조한다.

망막의 신선도 및 평탄성 기록 피펫을 관통 중요하다. 이 점에있어서, 상기 천공 된 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 확고한 부착 최우선 적시 재수 (단계 3.4-3.6)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Joung Jang and Xin Guan for technical assistance. We thank Dr. Rory McQuiston of Virginia Commonwealth University for setting up our first patch clamp rig and advices on experimental procedures. We thank Dr. Samuel Wu for suggestions on voltage clamp recording. The work is supported by NIH grants EY013811, EY022228 and a vision core grant EY002520. C-KC is the Alice R. McPherson Retina Research Foundation Endowed Chair at the Baylor College of Medicine.

Materials

Fixed-stage fluorescent microscope with DIC Olympus BX51-WI
Micromanipulators Sutter MP-225
Patch clamp amplifier A-M System AM2400
AD converter National Instrument NI-USB-6221
Heater controller Warner Instrument TC-324B
Inline heater Warner Instrument SC-20
Peristaltic pump Rainin Dynamax
pipette puller Sutter Instrument P-1000
Glass tube with filament King Precision Glass Customized
Stimulator A.M.P.I. Master-8
Biocytin Sigma B4261
NaCl Sigma S6191
KCl Sigma P5405
NaHCO3 Fisher BP328-1
Na2HPO4 Sigma S0876
NaH2PO4 Sigma S5011
CaCl2 Sigma C5670
MgSO4 Sigma M1880
D-glucose Sigma G6152
K-gluconate Sigma G4500
ATP-Mg Sigma A9187
Li-GTP Sigma G5884
EGTA Sigma E0396
HEPES Sigma H4034
KOH Sigma P5958
Cs-methanesulfonate Sigma C1426
CsOH Sigma 232041
Syringer filter Nalgene 171
1 ml syring Rainin 17013002
10 ul pipette tip Genesee Scientific 24-130RL
Streptavidin-488 ThermoFisher S-11223
10X PBS Lonza 17-517Q

References

  1. Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
  2. Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
  3. Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
  4. Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
  5. Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  6. Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
  7. Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513 (2015).
  8. Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
  9. Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
  10. Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
  11. Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277 (2015).
  12. Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
  13. Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
  14. O’Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
  15. Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
  16. Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
  17. Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253 (2014).
  18. Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  19. Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390 (2015).
  20. Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
  21. Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
  22. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).

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Cite This Article
Tu, H., Hsu, C., Chen, Y., Chen, C. Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina. J. Vis. Exp. (116), e54608, doi:10.3791/54608 (2016).

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