방법 논문

3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여

DOI:

10.3791/54625

⸱

2016년 11월 21일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 쥐 배아의 3차원(3D) 이미지를 획득하기 위해 고해상도 에피스코픽 현미경을 사용하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 개선된 프로토콜은 변형된 조직 준비 방법을 사용하여 형광 염료의 침투를 향상시켜 소형 및 대형 표본 모두에 대한 형태 분석을 가능하게 합니다.

초록

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HREM(High-Resolution episcopic Microscopic) 기술을 사용하면 고해상도 디지털 체적 및 3차원(3D) 형태 데이터를 빠르게 수집할 수 있습니다. 여기에서는 전체 마우스 배아를 이미지화하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜은 시료 준비, 임베딩, 이미지 획득 및 마지막으로 3D 시각화의 네 가지 주요 섹션으로 구성됩니다. 이 기술은 표본을 형광 염료로 염색하도록 요구하는데, 이는 크거나 밀도가 높은 표본에 문제가 될 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 기존 프로토콜을 개선하여 요소와 도데실황산나트륨을 함유한 용액으로 검체를 전처리하여 염료의 조직 침투를 향상시켰습니다. 이 프로토콜은 표준 실험실 환경에서 쉽게 조정할 수 있도록 일상적인 실험실 장비와 시약만 사용합니다. 우리는 그 결과로 생성된 고해상도 3D 이미지가 마우스 배아 내부 장기의 상세한 형태학적 특징을 충실하게 요약하여 형태 분석을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 우리는 함께 표준 실험실 장비를 사용하여 소형 및 대형 표본의 고해상도 3D 이미지를 획득하는 상세하고 개선된 프로토콜을 제시합니다.

서론

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3D 이미징 기술의 출현은 태아 발달 중 상세한 형태학적 특징에 대한 체계적인 분석의 가능성을 열었습니다. 현재 마이크로 자기 공명 영상(마이크로 MRI), 마이크로 컴퓨터 단층 촬영, 고주파 초음파, 광 간섭 단층 촬영, 광학 프로젝트 단층 촬영 및 주교 현미경1-4를 포함한 다양한 3D 이미징 방식을 사용할 수 있습니다. 각 양식에는 해상도, 대비, 속도, 비용, 자궁 용량 및 가용성에 대한 고유한 기능이 있습니다.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) 및 high-resolution episcopic microscopy (HREM)는 episcopic 현미경 이미징 방법입니다4. 여기에서 고해상도 연속 이미지는 조직 절편 대신 블록 면에서 연속적으로 캡처됩니다. 결과 이미지는 조직 왜곡을 최소화하거나 전혀 없이 상세한 형태학적 특징을 충실하게 반영합니다. 획득한 체적 데이터는 정확한 형태 분석에 적합한 고해상도 3D 이미지로 쉽게 변환됩니다. 상대적으로 저렴한 비용과 높은 해상도로 인해 HREM과 EPIC는 인간 선천적 결함2,4-8의 마우스 모델의 전신 평가를 위한 우수한 대안이 되었습니다.

EFIC 및 HREM 방법 모두 표본이 적절한 매체에 삽입되어야 합니다. EFIC는 내장된 조직에서 방출되는 자가형광을 감지합니다. 이 때문에 높은 수준의 자가형광을 방출하는 표본으로 제한되지만 초기 단계의 배아와 같이 상대적으로 자가형광이 약한 표본은 제외됩니다9. 자가형광의 의존성을 극복하기 위해 HREM 이미징을 위해 검체를 eosin과 같은 형광 염료로 염색합니다. 염료 및 염색 방법의 선택은 또한 HREM이 조직 구조 및 형태학의 맥락에서 분자 신호를 감지하는 데 더 적합하게 만듭니다4,10.

이 기사에서는 말기 마우스 배아의 전신 평가에 적합한 개선된 HREM 프로토콜을 제시합니다. 염색을 용이하게 하기 위해 조직 침투를 증가시키는 전처리 단계를 포함하여 오래된 마우스 배아의 HREM 이미징을 가능하게 합니다.

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프로토콜

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모든 동물의 사용은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

1. 샘플 준비

  1. 시간 제한 짝짓기
    1. 같은 케이지에서 함께 C57BL6 야생 형 남성과 여성을 배치합니다.
    2. 상대 플러그의 형성 초기에 다음날 아침에 확인합니다. 결합 플러그 (일명, 질 또는 교미 플러그) 차단 질을 강화 된 젤라틴 증착이다.
    3. 배아 일 0.5 (E0.5)와 같은 플러그 날짜를 설정합니다.
  2. 마우스 배아의 분리
    1. CO 2 질식에 의해 임신 한 여성을 안락사.
    2. 흡수 패드 부정사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부를 스프레이.
    3. 피부를 들어 올려 수술 가위를 사용하여 꼬리 복부에서 초기 5mm 절개를합니다. 잘라 완전히 내부 장기를 노출 복부 피부를 제거
    4. 버지니아 근처 잘라GINA는 전체 자궁을 제거합니다.
    5. 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 잘라. 각 세그먼트 또는 수태 안에 하나의 배아를해야한다.
    6. 1 배 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)에서 자궁 세그먼트를 유지합니다.
  3. 배아 해부
    1. 입체경 아래에 얼음처럼 차가운 PBS와 별도의 접시에 각각의 수태를 놓습니다.
    2. 순차적으로 미세 해부 집게를 사용하여 자궁 조직, 태반 후 태아의 세포막을 제거합니다.
    3. 1 배 얼음 차가운 PBS 큰 전송 피펫을 사용하여 함께 50 ML 튜브에 해부 배아를 전송합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해 집게와 직접 배를 따기 마십시오.
  4. 정착
    1. 정착액의 10 샘플 볼륨보다 24 시간 동안 4 ° C에서 10 % 중성 완충 포르말린 용액의 해부 배아를 수정합니다.
  5. 전처리
    1. 어음 솔루션을 준비 : 4M 우레아, 증류수 10 % 글리세롤 4 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS).
    2. 어음 솔루션과 정착액을 교체합니다.
    3. 이주 - 조심스럽게 1 시간 동안 실온에서 로커에 시료를 회전한다. 두 번째와 세 번째 날에 한 번 클리어 솔루션을 교환한다. 시편 천천히 명확하고 반투명하게된다.
    4. 10 % 포르말린으로 지우기 솔루션을 교체하고 2 일 동안 로커에 둡니다.
  6. 탈수
    1. 5 분마다 1X PBS로 3 회 전처리 샘플을 씻으십시오.
    2. 부드러운 로커에 실온에서 상승 에탄올 시리즈 샘플 탈수. E15.5 태아를 들어, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 및 100 % 에탄올, 2 시간의 각 단계를 포함하는 상승 에탄올 시리즈를 사용한다. 이전 배아, 배양 시간을 증가시킬 필요가있다.
  7. 더럽히는 것
    1. 에오신 Y 품목 소금과 0.02 0.1375 g을 추가 염색 용액을 제조아 크리 딘 오렌지 헤미 (아연 클로라이드) 100 % 에탄올 50ml로 소금 75g. 2 시간 동안 교반한다. 필터 종이 필터. 실온에서 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오.
    2. 1 시간 동안 염색 용액에 시료를 전송합니다.
    3. 신선한 염색 솔루션 및 얼룩 하룻밤로 교체하십시오.
  8. 침투
    1. 침투 솔루션을 준비 : JB-4 삽입 키트의 해결 방법 100 ㎖, 촉매 C 1.25 g, 에오신 Y 품목 소금의 0.275 g 및 아 크리 딘 오렌지 헤미 (염화 아연) 염 0.055 g을 결합한다. 2 시간 동안 얼음 버킷 (200 RPM) 혼합 교반 한 후 여과지로 걸러.
    2. 4 ° C에서 침투 솔루션을 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오.
    3. (1 : 1) 염색 솔루션 : 솔루션을 침투하기 위해 배아를 전송, 4 ° C에서 로커에 적어도 3 시간 동안 배양한다.
    4. 솔루션을 침투하기 위해 배아 전송하고 3 시간 동안 배양추운 방에 로커에 대한 연구.
    5. 한 번 매일 침투 솔루션을 대체, 3 일 이상 부드러운 로커에 추운 방에 둡니다.

2. 퍼가기

  1. 얼음에 해결 B 및 침투 솔루션을 유지합니다.
  2. 바로 삽입하기 전에 (용액 B 및 침투 솔루션 1:25) 임베딩 솔루션을합니다.
  3. 포함 금형 동양 시편은, 부드럽게 삽입 금형에 차가운 임베딩 솔루션을 붓는다. 다시 방향 필요한 경우 핀.
  4. 퍼가기 솔루션이 응고되어 있는지 여부를 조사하기 위해 핀을 사용합니다. 시편 블록을 밀어하고, 필요한 경우 트림.
  5. 교차 방향을 얻기 위하여 별도의 금형을 사용하여 시험편 블록의 방향.
  6. 매립 금형의 상단에 블록 홀더를 넣습니다. 금형 및 블록 홀더 솔루션을 포함하기로 침수 될 때까지 조심스럽게 금형에 임베딩 솔루션을 붓는다.
  7. 보조 용기에 시료를 유지하고 맡겨흄 후드에서 4 시간 - 3 얼음.
  8. 4 °의 C에서 응고 표본을 저장합니다.
  9. 매입 형을 벗겨. 블록의 시험편의 위치를 ​​검사하도록 경사 조명하여 실체 현미경 블록을 넣는다. 시편 주변 블록의 얼굴에, 마크 그리드 선.
  10. 참조로 표시된 눈금 선을 이용하여 물질을 매립 접근 양을 제거 할 수있는 블록을 낸다.

3. 이미지 인식

  1. 마이크로톰에 시편 블록을 고정하고 신선한 잘라 표면을 구하십시오. 설정 섹션 두께 (예를 들어, e9.5-10.5, 1.5 μm의, e11.5-12.5, 2.0 μm의, e13.5-15.5, 2.5 μm의, E16.5-이전, 3 μm의). 마이크로톰의 홈 위치에서 시료 / 블록을 유지합니다.
  2. 수평 시편의 블록 표면에 직면 스테레오 줌 현미경을 탑재합니다.
  3. 컴퓨터와 현미경 켜고 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다.
  4. 시각화 및 블록면에 광학 초점이미징 소프트웨어의 '라이브 뷰'모드에서.
  5. 블록 얼굴이 뷰 파인더의 중심에 있도록 필요한 경우 현미경 마이크로톰을 맞 춥니 다.
  6. 전체 블록 얼굴이 뷰 파인더 안에 들어 오도록 줌을 조정합니다.
  7. 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 (여자 470 ± 20 nm의, 다이크로 익 495 nm의, 방출 525 ± 25 nm의)를 선택하고 필요한 경우 집중할.
  8. 수동 측정하고 노출 시간을 설정 (예를 들면, 80-400 미니 초).
  9. 각 신선한 잘라 후 블록 얼굴의 이미지를 획득하고 가능하면 자동으로 이미지를 저장합니다.
  10. 해상도, 단면 두께 및 줌을 포함하여 기록 중요한 매개 변수.
  11. 전체 표본, 수출을 마무리하고 필요한 경우 JPEG 형식으로 모든 이미지 파일을 변환 한 후.
  12. 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 원본 이미지를 반전하고, 밝기 및 대비를 조정합니다.
  13. 별도의 폴더에있는 모든 처리 된 이미지를 저장합니다.

4. 3D심상

  1. 지침에 따라 3 차원 시각화 소프트웨어에 대한 모든 처리 된 이미지를 업로드합니다.
  2. 입력 해상도와 부분 두께는 체적 데이터 (즉, 복셀 크기)의 모든 이미지를 변환 및 3D 파일을 저장합니다.
  3. 자동 모드를 사용하여 모든 이미지를 맞 춥니 다. 필요한 경우 수동으로 개별 이미지를 조정합니다.
  4. 새 파일 이름으로 정렬 된 이미지를 저장합니다.
  5. 3 차원 시각화 소프트웨어를 사용하여 시험편의 형태 학적 특징을 분석한다.

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결과

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우리는 E9.5과 E13.5 8 사이의 마우스 배아의 높은 품질의 HREM 이미지를보고했다. 후반 개최 배아의 이미지 품질은, 그러나, 크게 때문에 형광 염료 에오신의 제한된 조직 침투의 손상. 염색 효율을 높이기 위해, 형광 영상 (11)에 호환되는 여러 전처리 방법을 시험 하였다. 특히, E15.5 마우스 배아는 무서 / 전자 A2 (12) 또는 전신 13 CUBIC 중 하나를 처리 하였다. 또한 단순화 화학식 상기 반제 용액 (4 M 우레아, 10 % 글리세롤 및 4 % 도데 실 황산나트륨)을 테스트했다. 모든 전처리 방법은 염색 효율을 증가했다. 배아는 지우기 솔루션 치료 1 주 이후 반투명되었다. 명백한 조직 손상은 치료 후 검출되지 않았다. 예비 처리 된 배아는 embedde되기 전에 탈수, 염색 및 침투를 포함하는 단계를 통해 처리 된플라스틱 매립 매체 (D). (3) (이미지 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 급격한 차원 시각화 및 복잡한 구조의 형태 학적 분석을 위해 호환되는 직렬 HREM 화상 취득 루틴 실험실 장비를 사용하여 변형 된 프로토콜을 제시한다. 고해상도 이미지 대신 개별 섹션의 블록 표면에서 직접 수행되기 때문에, 미세한 형태 적 특징은 유지하고 신속 차원 시각화 프로그램에서 디지털로 복원된다.

3D 영상을 시각화하고 복잡한 형태 적 특징을 이해하는데 상당한 장점을 제공한다. 대부분의 3D 영상 기술은 특수 장비 1-4에 따라 달라집니다. 반대로 EFIC 및 HREM 촬상는 디지털 카메라 및 마이크로톰 (14)를 구비 한 입체 현미경을 포함한 표준 실험실 장비를 이용한다. 현미경 마이크로톰 간의 기능적 결합 화상 취득의 자동화 전체 이미지 획득 프로세스의 자동화를 실현 가능하게한다. 그러나, 우리는 것을 보여 주었다기능 커플 링은 8 의무적이 아니다. 그것은 휴식 정지 위치에서 표준 마이크로톰의 블...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기술 지원에 대해 Yichen Huang, Chunming Guo 및 Zhenfang Zhou 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH/NIDDK(1R01DK091645-01A1, XL) 및 미국심장협회(AHA, 13GRNT16950006, XL)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생쥐The Jackson LaboratoryC57BL6
에틸 알코올Pharmco-Aaper111000200200 프루프, 절대, ACS/USP/코셔 등급
포르말린시그마HT501128-4L
우레아시그마U5128클리어링 솔루션
글리세롤Fisher ScientificG33-4클리어링 솔루션
나트륨 도데 실 설페이Invitrogen15525-017클리어링 용액
Eosin Y Disodium SaltFisher scientificBP241925침투 용액
Acridine Orange hemi (염화 아연) 소금SigmaA6014침투 용액
Whatman 종이GE3030-153
JB-4 임베딩 키트 - Solution APolysciences, Inc.0226A-800침투 솔루션
JB-4 임베딩 키트 - Solution BPolysciences, Inc.0226B-30임베딩 솔루션
JB-4  임베딩 키트 - CatalystPolysciences, Inc.02618-12침투 용액
임베딩 금형Polysciences, Inc.23185-116 x 8mm
Peel-A-Way 샤프 임베딩 금형Polysciences, Inc.18986-122 mm x 22 mm 정사각형, 12 mm x 12 mm로 잘림
JB-4  플라스틱 블록 홀더Polysciences, Inc.15899
일회용 졸업 전송 파이프VWR414004-014
Petrl DishVWR25384-088배아 해부
펜치 Inox 팁  ROBOZRS-5015배아 해부
Graefe 조직 집게  ROBOZRS-5153배아 해부
섬세한 수술용 가위  ROBOZRS-6700배아 해부
14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브Falcon352059
50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브Falcon352098
Ice BucketMagic Touch Iceware International Corp.R19-343
100ml(3.4온스) 정전기 방지 폴리스티렌 계량 보트VWR89106-766
330 ml (11.2 oz.) 정전기 방지 폴리스티렌 계량 보트VWR89106-770
염화나트륨MP 생물 의학102892PBS 용액
염화칼시그마P0662PBS 용액
인산칼륨 일염기성 시그마P5405PBS 용액
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트시그마-알드리치S9390PBS 솔루션
디지털 카메라Hamamatsu PhotonicsC11440-10C
MicrotomeLeicaRM2265
IlluminatorCarl ZeissHXP 200C
형광 스테레오 줌 현미경Carl ZeissAxio Zoom.V16
스테레오 현미경OlympusSZX16
광섬유 광원LeicaKL 1500 LCD
일회용 마이크로톰 블레이드VWR95057-832
단일 에지 디스펜서Personna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D 소프트웨어Visage 이미징5.4
컴퓨터Dell T7600, 2x900GB SAS 하드 드라이브 및 64GB DDR3 RDIMM 메모리
잠금 플랫폼 쉐이커VWR40000-304
표준 핫 플레이트 교반기VWR12365-382
분석 저울Mettler ToledoAB54-S
트 륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

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