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방법 논문

준비 및

9.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54652

⸱

2016년 11월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

이 논문에서

요약

여기서는 활동 기반 프로브의 제조 및 사용을 설명 (ARN14686, 운데 10 ynyl- N - [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트)의 검출 및 정량화를 허용 염증성 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다 아제의 활성 형태 (NAAA), 모두 생체 외 및 생체있다.

초록

활동 기반 단백질 프로파일 (ABPP)는 효소의 활성 부위를 타겟팅하는 화학 프로브의 사용을 통해 복잡한 프로테옴 관심 효소의 동정하는 방법이다. 프로브에 도입 된 리포터 태그의 겔 형광 검사, 단백질 오, 형광 현미경, 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 효소 표지의 검출을 허용한다. 여기, 우리는 준비 및 복합 ARN14686의 사용, 선택적으로 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다제 (NAAA)를 인식하는 클릭 화학의 활동 기반 프로브 (CC-ABP)을 설명합니다. NAAA는 팔미 토일 (PEA)과 oleoylethanolamide (OEA)과 같은 내인성 페 록시 솜 증식 제 - 활성화 수용체 (PPAR) - 알파 작용제를 비활성화하여 염증을 촉진 시스테인 가수 분해 효소이다. NAAA은 리소좀의 산성 pH에서 autoproteolysis에 의해 활성화되는 비활성 전체 길이 proenzyme으로 합성된다. 현지화 연구 시간NAAA은 주로 B 림프구뿐만 아니라, 대 식세포 및 다른 단핵구 유래 된 세포에서 발현되는 것으로 나타 집결지. 우리는 ARN14686 감지하고 단백질 얼룩과 형광 현미경으로 설치류 조직에서 활동 NAAA 생체을 정량화 할 수있는 방법의 예를 제공합니다.

서론

일반적 산탄 분석 1,2- 효모 용 액체 크로마토 그래피 질량 분석 플랫폼을 포함하는 발현 패턴의 상호 작용 및 기능 단백질을 조사하는 방법을 사용하는 두 개의 하이브리드 방법 3,4 및 시험 관내 분석에서 그들이 것을 한정 그 나라의 상태에서 단백질의 활성을 평가할 수 없습니다. 활동 기반 단백질 프로파일 (ABPP)이 갭을 채우기 위해 사용될 수있다. 이 방식에서, 작은 분자에 공유 표적 탐지 가능 리포터 그룹에 결합되는 관심있는 효소의 활성 부위에 결합 할 수있는 프로브. 클릭 화학 (CC)를 사용하여 리포터 프로브에 통합 될 수 있거나 또는 표적 결합이 5,6 발생한 후에 도입 될 수있다. 후자의 방법은 SUC 바이오 직교 반응을 통해 리포터 시약 다수 개질 될 수있는 단자 알킨 또는 아 지드와 같은 적합한 화학 그룹을 포함하는 프로브를 사용해야구리 (I)와 같은 시간 [3 + 2] 사이클로 7-9 또는 슈타 우 딩거 결찰 10, 11 Huisgen을 촉매 반응.

최근에는 체외위한 제 ABP와 같은 시스테인 가수 분해 효소, NAAA (12)의 생체 검출의 화합물 ARN14686 개시된. NAAA는 항 염증 핵 수용체 PPAR 알파 13 ~ 15의 내인성 작용제이다 oleoylethanolamide (OEA) 및 팔미 토일 (PEA)을 포함하여 포화 및 불포화 FAES,의 가수 분해 비활성화를 촉매한다. NAAA 주로 선천성 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 시사뿐만 B 림프구 (14,16)와 같이, 대 식세포 및 다른 단핵구 유래 된 세포에서 발현된다. 효소는 비활성 형태로 거친 소포체에서 합성 및 autoproteolytic기구 (17)에 의해 세포의 산성 구획에 활성화됩니다. autoproteolytic 분열은 (C13를 새 N 말단 시스테인을 생성마우스 및 쥐에서 1, 인간의 C126), 즉 FAE의 친핵체 책임은 (18, 19)을 가수 분해한다. NAAA 활동의 약리 억제는 FAES 16,20,21 증가 세포 수준에 찬성 FAE 합성 / 분해의 균형을 변경합니다. 여러 β-락톤 및 β - 락탐 유도체는 높은 효능 및 선택성 16,22-26와 NAAA 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 억제제는 촉매 시스테인 16,27,28의 S의 -acylation을 통해 작용한다.

(- [(S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트 4- cyclohexylbutyl- N) 16 화합물 ARN14686은 전신적 활성 세린 유래 β 락탐 NAAA 억제제의 화학 구조, ARN726에 기초하여 설계되었다. ARN726의 4 부틸 사이클로 헥실 그룹은 아 지드 베어링 기자 태그 이후 CC의 접합을위한 터미널 알킨 태그를 베어링 C9 포화 지방족 체인으로 대체되었다. 우리 minimall하는 두 단계 ABP 디자인을 선택따라서 Y NAAA 용 프로브의 친화력을 유지하면서 원래의 지지체의 구조를 변화. 또한, 부피가 태그의 도입을 피하는 등의 프로브가 직접 ABP보다 생체 내 치료에 적합 할 수있다. ARN14686 높은 효능으로 NAAA 억제 효소 촉매 (12)의 시스테인과 공유 부가 물을 형성함으로써 (hNAAA IC 50 = 6 nM의, rNAAA IC 50 = 13 ㎚). 살아있는 쥐의 실험 프로브가 NAAA가 폐에 표현 캡처 선택적 있음을 보여 주었다. 높은 프로브 농도 (시험 관내에서 10 μM, 10 밀리그램 / 정맥 주사, 정맥 ㎖) (12)를 사용할 때 산성 세라 미다, NAAA와 33~34% ID를 공유하는 다른 시스테인 아미 다제는 또한 낮은 친 화성 대상으로 확인되었다. 우리는 또한 완전한 프로 인트 보조제 (CFA) (29)의 투여 후 염증이 쥐의 조직에서 활동 NAAA의 존재를 연구하는 ARN14686을 사용했다.

여기에서는 preparati위한 프로토콜 개요ARN14686 (그림 1)과 NAAA 활성화 생체의 조사에의 응용의에. 예를 들어, 우리는 CFA 투여 후 쥐의 발에 NAAA을 시각화하는 실험 절차를 설명합니다. 이 실험에서, 단백질은 프로브의 IV 주입 후 발 조직으로부터 추출되고, ABP 표지 프로테옴 비오틴 지드와 CC 받는다. 비오틴 샘플을 스트렙 타비 딘 비드를 사용하여 농축하고, 단백질 블롯 행한다. 다른 응용 프로그램에서, 우리는 프로브 처리 된 마우스에서 마우스의 폐에서 형광 현미경으로 활성화 NAAA의 현지화를 설명합니다. 이 경우, 조직을 절단하고, 절편을 로다 민 첨가 CC 실시된다. 워크 플로 방식은도 2에 도시되어있다.

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프로토콜

주의 : 모든 화학 반응이 환기 흄 후드 및 실험실 코트, 장갑 및 보호 고글의 사용으로 수행되어야한다. 반응은 질소 환경에서 수행되어야한다.

윤리 문 : 동물을 포함하는 우리의 절차는 실험과 기타 과학적 목적 (DM 116192), 유럽 경제 공동체 규정에 사용되는 동물의 보호에 이탈리아의 규정에 따라 수행된다 (OJ EC의 L 1분의 358 1986년 12월 18일 ).

참고 합성 [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 아세트산 암모늄 대규모 수율에 대해 설명하지만, 쉽게 축소 될 수있다 (N -Cbz-L 세린이 50 g)을 얻었다.

1. 합성

참고 : 합성 반응식 그림 1을 참조하십시오.

  1. 2- 피리 딜 운데 10 인일 카보네이트의 제조 및 운데 10 인일 -2- oxopyridine -1- 카르 복실 레이트
    1. 50㎖의 둥근 바닥 플라스크에서, 운덱 350 mg을 용해건조 디클로로 메탄 3.5 ml의 10는 틴 1 올.
    2. 1.1.1의 용액에 4- 디메틸 아미노 피리딘 (DMAP) 및 2- dipyridylcarbonate (DPC) 530 mg을 25 mg의 추가. 16 시간 동안 실온 (RT)에서 혼합물을 교반한다.
    3. 디클로로 메탄 20 ㎖를 추가합니다.
    4. 분액 깔때기로 혼합물을 전송합니다. , 물 15 ㎖의 추가 흔들어, 두 단계는 분리 할 수 ​​있습니다.
    5. , 꼭지를 열고 유기 상 (아래)를 수집 한 다음 꼭지를 닫습니다. 포화의 NaHCO3 용액 15 ML을 추가합니다. 분리 깔때기를 흔들어 두 단계는 분리 할 수 ​​있습니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
    6. (NA) 2 SO 4로 건조시키고, 유기 층을 둥근 바닥 플라스크 (테어 제)로면을 통해 여과하고, 감압 (회전 증발기)하에 건고 증발시켰다.
    7. 플라스크의 무게 및 2- 운데 딜 10 인일 탄산 운데 10 인일 1.7의 비율로 2 oxopyridine -1- 카르 복실 레이트의 혼합물 인 오일 600 mg을 얻었다 : 1.
      1 H NMR (400 MHz의 DMSO- d를 6) 주성분 δ = 8.39 (DD, J = 5.0, 2.0, 1H), 7.98 (TD, J = 7.9, 2.0, 1H), 7.40 (DDD, J = 7.2, 4.9, 0.9, 1H), 7.30 (d, J = 8.2, 1H), 4.22 (t, J = 6.6, 2H), 2.73 (t, J = 2.4Hz, 1H), 2.18-2.11 (m, 2H), 1.76 - 1.62 (m, 2H), 1.50-1.23 (m, 12H).
      1 H NMR (400 MHz의 DMSO- d를 6) 부성분 δ = 7.74 (DD, J = 7.2, 1.9, 1H), 7.47 (DD, J = 6.7, 2.3, 1H), 6.44 (d, J = 9.4, 1H), 6.30-6.25 (m, 1H), 4.35 (t, J = 6.5, 2H), 2.72 (t, J = 2.4Hz, 1H), 2.18-2.11 (m, 2H), 1.77-1.60 (m, 2H ), 1.52-1.20 (m, 12H).
    8. 더 이상 분리하거나 정제하지 않고 오일을 사용합니다.
  2. [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 암모늄 아세테이트의 제조
    1. 벤질 제조 N - [(S) -1- (히드 록시 메틸) -2 - [(4- 메 톡시 페닐) 아미노] -2- oxoeth일] 카르 바 메이트.
      1. 4-L 둥근 바닥 플라스크에 테트라 히드로 푸란 1.5 L와 0.5 L의 디클로로 메탄에 피의 -anisidine의 141.5 g을 용해.
      2. 빙욕에서 0 ℃로 용액을 냉각.
      3. N -Cbz-L-세린의 50.0 g을 추가하고 N의 43.9 g - (3- 디메틸 아미노 프로필) - N '다이이 미드 하이드로 클로라이드.
      4. 30 분 동안 0 ° C에서 자기 바 혼합물을 저어.
      5. 얼음 욕조에서 솔루션을 제거하고 16 시간 동안 실온에서 자석 막대와 교반한다.
      6. 감압 (회전 증발기) 하에서 용매를 증발시켰다.
      7. 주걱으로 저어, 1 사이클로 헥산 / 에틸 아세테이트 및 가만히 따르다 : 1의 400 ML을 추가합니다.
      8. 단계를 반복 1.2.1.7 두 번 더.
      9. 아세트산 에틸 500ml에 고무질 잔류 물을 용해시키고, (2 회), 포화 된 NaHCO3 용액을 400 ml의 0.1 M HCl 용액 (10 배) 400 ㎖로 세척하고, 염수 400 mL로.
      10. 유기 층을 건조SO 4 나 2 (제 용기) 둥근 바닥 플라스크에면을 통해 상기 용액을 여과하고, 감압 (회전 증발기)하에 증발 건고.
      11. 플라스크의 무게를 측정하고, 백색 고체 61.4 g을 얻었다.
        의 1H NMR (400MHz, DMSO- d를 6) δ = 9.86 (BS, 1H), 7.52 (d, 2H, J = 9.0 Hz에서), 7.42-7.25 (m, 6H), 6.91-6.85 (m, 2H) , 5.06 (d, 1H, J = 12.9 Hz에서), 5.02 (d, 1H, J = 12.9 Hz에서), 4.98 (t, 1H, J = 5.6 Hz에서), 4.24-4.15 (m, 1H), 3.72 (S, 3H), 3.70-3.57 (m, 2H).
    2. 벤질 제조 N - [(S) -1- (4- 메 톡시 페닐) -2- 옥소 - 아제 티딘 -3- 일] 카바 메이트.
      1. N 58.6 g을 용해 - [(S) -1- (히드 록시 메틸) -2 - [(4- 메 톡시 페닐) 아미노] -2- 옥소 - 에틸] 카르 바 메이트 N, N- 디메틸 포름 아미드 1.6 L이다.
      2. 빙욕으로 0 ℃로 용액을 냉각.
      3. 1,1'- sulfonyldiimidazole의 50.6 g을 추가하고 30 분 동안 자기 바 저어.
      4. 솔루션을 쿨부 - 방향 -20 얼음 / 염화나트륨 욕조 C 수소화 나트륨 (광유 중 60 %) 10.2 g을 추가한다.
      5. 1 시간 동안 -20 ℃에서 상기 혼합물을 교반 한 후, 메탄올 2 mL 및 물 1 L로 켄 칭한다.
      6. 진공, 침전물을 필터링 물 200 ㎖로 세척하고, 진공하에 건조.
      7. 흰색 고체의 42.2 g을 얻었다.
        의 1H NMR (400MHz, DMSO- d를 6) δ = 8.08 (d, 1H, J = 8.5 Hz에서), 7.42-7.28 (m, 5H), 7.30 (d, 2H, J = 8.9 Hz로), 6.95 (d , 2H, J = 8.9 Hz로), 5.06 (S, 2H), 4.86 (DDD, 1H, J = 8.5, 5.6, 2.6 Hz에서), 3.90 (t, 1H, J = 5.6 Hz로), 3.73 (S, 3H) , 3.55 (일, 1H, J = 5.6, 2.6 Hz에서).
    3. 벤질 제조 N - [(S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카바 메이트.
      1. 벤질 N 9.0 g을 일시 - [(S) -1- (4- 메 톡시 페닐) -2- oxoazetidin -3- 일] 카바 메이트 아세토 니트릴 500 mL 및 물 400 mL로한다.
      2. 빙욕에서 0 ℃로 용액을 냉각.
      3. ceri의 45.4 g을 추가C 질산 암모늄 부 와이즈 45 분 이상 및 15 분 동안 0 ℃에서 자기 교반 바.
      4. 조심스럽게 포화의 NaHCO3 용액 500 mL를 넣고 에틸 아세테이트 500 ml에 추가 할 수 있습니다.
      5. 침전물을 여과하고, 에틸 아세테이트 200 ㎖로 세척 하였다.
      6. 이상성 (biphasic) 용액을 분리하고 200 mL의 에틸 아세테이트 (3 회) 수성 층을 세척한다.
      7. (NA) 2 SO 4로 유기층을 건조 규조토, 실리카 패드를 통해 활성탄 5 g을, 필터를 추가하고, 감압 (회전 증발기)하에 건고 증발시켰다.
      8. 디 에틸 에테르를 추가하고 주걱으로 저어.
      9. 고체를 여과하고, 회백색 고체 4.85 g을 얻었다.
        의 1H NMR (400MHz, DMSO- d를 6) δ = 7.97 (d, 1H, J = 8.7 Hz로), 7.94 (BS, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5.05 (S, 2H), 4.67 (DDD, 1H, J = 8.7, 5.4, 2.7 Hz에서), 3.40 (t, 1H, J = 5.4 Hz에서), 3.09 (일, 1H, J = 5.4, 2.7 Hz에서).
    4. [(S) -2- oxoazetidin -3- 일] - 암모늄 아세테이트의 제조.
      1. 에틸 아세테이트 245 ml의 아세트산 0.93 ml에 녹인다. 로이 표시 "솔루션을 트래핑."
      2. 에탄올 298 ㎖에 [(R) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트 - 벤질 - N 3.28 g을 녹인다.
      3. 시클로 헥사 디엔의 14.1 mL 및 탄소 10 % 팔라듐의 3.27 g을 추가합니다.
      4. 12 시간 동안 실온에서 현탁액을 교반하고 규조토의 짧은 패드를 통해 필터링합니다. 포집 용액에 직접 용리액을 붓는다.
      5. 35 ° C 이하의 온도를 유지하면서 감압 (회전 증발기)하에 용매를 증발시켰다.
      6. 테트라 히드로 푸란이 고체를 연화 처리하여 백색 고체 1.72 g을 얻었다.
        1 H NMR (400 MHz의 DMSO- d를 6) δ = 7.68 (BS, 1H), 3.99 (DDD, 1H, J = 5.2, 2.4, 1.2 Hz에서), 3.32 (t, 1H, J = 5.2 Hz에서) 2.79 (일, 1H, J = 5.2, 2.4 Hz에서), 1.90 (S, 3H).
  3. 제조 운덱 ynyl- 10 N - [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트
    1. 10 mL의 둥근 바닥 플라스크에서 건조 디클로로 메탄 2 ㎖에 [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 아세트산 암모늄 60 mg을 용해.
    2. 빙욕에서 0 ℃로 용액을 냉각시키고, N 81 μL를, N 디 이소 프로필 에틸 아민 적가 추가한다.
    3. 건조 디클로로 메탄 2 ㎖에 운덱 10 인일 -2- oxopyridine -1- 카르 복실 레이트를 함유하는 조 질의 혼합물을 350 mg을 녹인 용액에 추가하고, 15 시간 동안 실온에서 교반 하였다. 감압 (회전 증발기) 하에서 건조 될 때까지 용매를 증발시켰다.
    4. 칼럼 크로마토 그래피 (실리카겔) 자동 컬럼 크로마토 그래피 장치를 이용하여 정제 :
      1. 실리카 겔상에서 샘플을 흡수 헥산으로 컬럼을 평형화하고 카트리지에 샘플을 로딩.
      2. 0 0 : 100에서 사이클로 헥산 / 에틸 아세테이트로 용출 (100) 및 테스트 튜브에 피크를 수집합니다.
      3. 감압 (회전 증발기) 하에서 건조하기 위하여 화합물에 상응하는 분획의 용매를 증발시키고, 백색 고체 40 mg을 얻었다.

CC 시약 2. 준비

  1. 태그 지드 분자의 5 mM의 스톡 용액의 조제
    1. 디메틸 설폭 시드 0.5 ㎖ (DMSO)에 아 지드 - PEG3 - 플 루어 545 1.5 mg을 녹이고. -20 ° C에서 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 분취하고 저장합니다.
    2. DMSO 0.5 ml의 아 지드 - PEG3 - 비오틴 1.1 mg을 녹이고. -20 ° C에서 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 분취하고 저장합니다.
  2. 트리스 50 mM의 원액의 제조 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)
    1. 물 1 ㎖에 TCEP의 14.3 mg을 녹이고, 신선한마다 그것을 확인합니다.
  3. CuSO 4의 50 mM의 용액의 제조 · 5H 2 O
    1. 유리 바이알 (12)을 용해물 1 ㎖에 CuSO 4 · 5H 2 O의 0.48 mg을. 최대 한 달 동안 실온에서 보관하십시오.
  4. 트리스 83.5 mM의 스톡 용액의 제조 (1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA)
    1. 유리 바이알에, DMSO 200 μL에 TBTA의 8.85 mg을 용해. 최대 한 달 동안 실온에서 보관하십시오.
  5. (즉시 사용 전) TBTA의 제조 1.7 mM의 작업의 솔루션
    1. 유리 바이알에 83.5 밀리미터 TBTA의 20 μl를 추가하고 DMSO 180 ㎖로 희석.
    2. 급의 부탄올과 소용돌이의 800 μl를 추가합니다.

CFA 처리 된 쥐의 발 조직 3. NAAA 식 분석

참고 : 사용 수컷 흰쥐는 175-200g 무게, 동물의 윤리적 사용을위한 지침에 따라 모든 절차를 수행합니다. 주택의 12 시간 빛 / 어둠 사이클에 환기 케이지에 쥐와 그들에게 음식과 물을 무료로 액세스 할 수 있습니다. CF의 프로토콜에 대한치료는 7 일 CFA 투여 후 Bonezzi 등. (29)를 사용하여 동물에서 발행 한 문서를 참조하십시오.

  1. ARN14686의 정맥 관리
    1. 비히클 (15 % PEG 및 15 % 트윈 식염수)에 ARN14686을 녹인다. 쥐의 무게 (투여 3 밀리그램 / kg, 주입 부피 5 ㎖ / kg)에 의한 용액의 농도를 계산한다.
    2. 세 순진 세 CFA 처리 된 쥐의 정맥 주사를 진행합니다. 적절한 플라스틱 구속 장치의 각 쥐를 놓습니다. 그런 다음, 혈관 확장 할 수 있도록 2-4 분 동안 따뜻한 물에 쥐의 꼬리를 배치하고, 꼬리 정맥을 통해 화합물 IV 주입.
    3. 전용 차량 세 쥐 (순진하고 CFA는 처리) 정맥 주입한다.
  2. 발 수집 및 해부
    1. 프로브 또는 차량 투여 후 CO 2 흡입 4 시간으로 쥐를 희생하고 메스를 사용하여 무릎 관절 이상 그들에게 0.5 cm를 절단하여 자신의 발을 수집합니다.
    2. 조심스럽게 가위를 이용한 절개하여 피부를 제거하고 뼈를 긁어하여 연부 조직을 해부하다. 뼈를 무시하고 발의 부드러운 조직을 수집합니다. -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 스냅 동결 샘플.
  3. 발 균질화와 리소좀 단백질 준비
    참고 : 그들이 CC 반응을 억제 할 수있는, 세제 및 아민 함유 버퍼를 사용하지 마십시오.
    1. 인산염 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4) 및 프로테아제 억제제 칵테일 (소재 / 시약 표 참조) 4 ml의 320 mM의 자당에서 그들을 (섹션 3.2.1에 기술 된 바와 같이 획득) 3 쥐에서 발 조직을 결합하고 균질화; 고성능 분산 장비를 사용하여 (재 / 시약 표 참조).
    2. 4 ° C에서 1,000 XG에 20 분의 조직 균질 액을 원심 분리기; 뜨는을 저장합니다.
    3. 추가 2 PBS 320 mM의 자당 ml의 조직 펠릿을, 프로테아제 억제제 칵테일한 번 더 균질화.
    4. 4 ° C에서 1,000 XG에 20 분 동안 원심 분리하고, 단계 3.3.2에서 하나에 뜨는을 추가합니다.
    5. 4 ℃에서 12,000 XG에서 30 분 동안 수집 된 상층 액을 원심 분리기.
    6. PBS의 두 볼륨에서 펠렛과에 resuspend 무게 (즉, 펠렛 각각 100 mg을 200 μL). 1.5 ml의 포집 관에 전송하고 1 시간 동안 -80 ° C에서 동결.
    7. 샘플을 해동 및 -80 ° C에서 1 시간 동안 다시 동결.
    8. 동결 / 해동 사이클을 두 번 더 반복합니다.
      참고 :이 단계는 단백질을 용해하기위한 것입니다. 필요한 경우 하룻밤 동결.
    9. 4 ° C에서 10 만 XG에 1 시간 동안 원심 분리기. 수용성 리소좀 단백질을 포함하는 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다. -80 ° C에서 저장하거나 바로 단백질 정량를 진행합니다.
    10. BCA 단백질 분석 30 상업용 키트를 사용하여 단백질 함량을 정량 (참조 소재 / 시약 도표 ), 제조업체의 지침에 따라.
    11. 사용할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다.
  4. 아 지드 - PEG3 - 비오틴과 CC
    참고 : CC와 스트렙 타비 딘 비드 농축 (3.4-3.6 단계)의 프로토콜은 약간 Speers와 Cravatt (31)에 의해 출판 프로토콜에서 수정됩니다.
    1. 프로브 - 차량 - 처리 된 래트 (나이브 및 CFA 투여군)에서 리소좀 단백질 500 μL (PBS에서 1 ㎎ / ㎖ 등)를 준비한다.
    2. 스트렙 아가의 50 % 슬러리 40 μL와 Preclear 샘플을 4 ° C에서 1 시간 동안 (사용 전에 PBS 1 ㎖로 3 회 세척). 4 ° C에서 1,000 XG에서 4 분 동안 원심 분리하고 상층 액을.
    3. 아 지드 - PEG3 - 비오틴과 소용돌이의 5 mM의 주식의 11.3 μl를 추가합니다.
    4. 갓 준비 TCEP와 소용돌이의 50 mM의 주식의 11.3 μl를 추가합니다.
    5. 50 mM의 CuSO 4의 11.3 μL와 1.7 mM의 TBTA의 갓 준비 작업 솔루션의 프리믹스 34 μL · 5H 2 O 재고.
    6. 예 혼합 TBTA / CuSO 4 · 5H 2 O 용액 소용돌이의 45.3 ML을 추가합니다.
    7. 2 시간 동안 25 ° C에서 반응 부화 (장기간 배양 시간은 반응에 영향을 미치지 않는다). 이 단계에서 단백질 침전을 준수하십시오. 배양 시간 후에 제 섞는다.
  5. 초과 CC 시약의 제거
    1. 4 ° C에서 6,500 XG에 4 분 동안 원심 분리기 샘플 및 뜨는을 제거합니다.
    2. 초음파 (프로브 초음파 처리기 5 초)에 의해 냉 메탄올에 resuspend의 750 μl를 추가합니다.
    3. 4 ° C에서 6,500 XG에서 4 분의 샘플을 원심 분리기 및 주사기와 바늘을 사용하여 상층 액을 제거합니다.
    4. (초음파가 필요하지 않은) 두 번 단계를 반복 3.5.2.
    5. 마지막 세척 후에, 5 초간 단백질 펠렛 및 초음파 처리를 3 배 PBS로 도데 실 황산나트륨 (SDS) 2.5 % 325 μL를 추가한다.
    6. 65 ° C에서 5 분 동안 샘플을 가열하고 초음파 처리이득.
    7. RT에서 6,500 XG에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층 액을 저장합니다.
    8. 0.5 %로 SDS 농도를 희석하기 위해 PBS의 1.4 ML을 추가합니다. -20 ° C에서 보관 또는 스트렙 타비 딘 농축을 계속합니다.
  6. 스트렙 타비 딘 심화
    1. PBS로 4.2 ㎖의 단계 3.5.8로 얻어진 시료의 체적을 가지고. 커트 선단을 사용하여 스트렙 타비 아가의 50 % 슬러리 40 ㎕를 추가 (사용 전에 PBS 1 ㎖로 3 회 세척).
    2. 회전 RT에서 2 시간 동안 배양 한 후 1,400 x g에서 2 분간 원심 분리.
    3. 구슬이 펠렛과 열을 회전 ㎖로 1에 구슬을 전송하는 잔류 뜨는를 사용하여 건조하지 않고 뜨는을 제거 (소재 / 시약 표 참조).
    4. 1 % (PBS)에서 SDS의 3 배 1ml를, (PBS)에 6 M 요소의 3 배 1ml를하고, PBS의 4 배 1 ml의 중력에 의해 씻으십시오.
    5. PBS를 사용하는 배 500 ㎕를 실온에서 1,400 XG에 2 분 동안 1.5 ML 튜브와 원심 분리기에 구슬을 전송하는. 조심스럽게 주사기와 바늘로 뜨는을 대기음.
    6. 95 ° C (32)에서 15 분이어서 RT에서 15 분 동안 용출 완충액 25 μL (6 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 2 % SDS 및 6 mM의 비오틴, PBS 모두)을 첨가하여 수지 - 결합 된 단백질을 용출시킨다.
  7. 단백질 얼룩
    1. (9 ml의 최대 0.5 ml의 1 M 트리스 - 염산의 pH가 6.8, 5 ml의 20 % SDS, 5 mg의 브로 모 페놀 블루, 3 ㎖ 글리세롤, 및 H 2 O 9 ml의 경우) 및 추가 6 배 램 믈리 버퍼의 5 μl를 추가 사용하기 전에 즉시 5 % β-머 캅토 에탄올. 간단히 4-12 %의 폴리 아크릴 아미드 겔로 얻어진 상층 액의 수지 및로드 25 μl를 펠렛 2,000 XG에서 샘플을 원심 분리기.
    2. 제조자의 지시 (33)에 따른 막에 블 롯팅 겔 전기 영동, 단백질의 전달을 수행한다.
    3. 블로킹 완충액 10 mL로 1 시간 블로 팅 막을 포화 0.1 % 트윈 -20을 함유하는 (소재 / 시약 표 참조).이 배경을 증가시킬 수로, 우유를 사용하지 마십시오.
    4. 0.05 % 트윈 -20 PBS에서 10 mL로 막 세척 형광 스트렙 타비 딘 10 μL를 추가 RT에서 버퍼 플러스 0.1 % 트윈 20 1 시간 차단 10ml에 용해 된 (소재 / 시약 표 참조).
    5. 한 번 PBS 혼자 (10 분마다) PBS에 0.05 % 트윈 20 4 회 반복합니다.
    6. 이미지 스캐너를 사용하여 (소재 / 시약 표 참조). 악기와 연결된 컴퓨터를 켭니다. 준비가 될 때까지 기다립니다.
    7. 취득 프로그램을 시작하고 형광 모드를 선택합니다. 막 영역을 선택하고 저장된 파일의 대상 폴더를 선택합니다.
    8. 다음 획득 파라미터를 설정 : 680 nm의 여기 길이 BPFR700 필터 (채널 2) 및 25 ㎛의 화소 크기 1,000 V 광전자 증 배관 (PMT) 값. 이미지를 획득.

형광 극소로 마우스 폐에서 촉매 활성 NAAA 4. 현지화부

참고 : 사용 8 ~ 10 주령의 마우스 남성과 동물의 윤리적 사용을위한 지침에 따라 모든 절차를 수행합니다. 주택의 12 시간 빛 / 어둠 사이클에 환기 케이지에서 마우스와 그들에게 음식과 물을 무료로 액세스 할 수 있습니다.

  1. 마우스의 ARN14686의 정맥 관리
    1. 차량 ARN14686 녹이고 15 % PEG 및 15 % 트윈 -20 식염수. 마우스 체중 (투여 3 밀리그램 / kg, 주입 부피 5 ㎖ / kg)에 의한 용액의 농도를 계산한다.
    2. 3 쥐의 정맥 주입을 진행합니다. 적절한 플라스틱 구속 장치에서 각 마우스를 놓습니다. 그런 다음, 혈관 확장을 허용하고 꼬리 정맥을 통해 화합물 IV를 주입하는 2-4 분 동안 따뜻한 물에 마우스 꼬리를 놓습니다.
    3. 전용 차량 3 쥐의 정맥 주입한다.
  2. 폐 수집 및 슬라이스 준비
    경고 : 흄 후드에주의 파라 포름 알데히드를 처리하고, 장갑을 착용!
    1. chlo와 마우스를 마취RAL 수화물 (/ kg 400 mg)을 얻었다. 발가락 핀치와 마취를 확인합니다. 다음과 같이 transcardial 관류를 수행합니다 :
      1. 표면적으로 가위로 복부 피부를 잘라 흉부 및 복막 막 표면을 노출.
      2. 피상적으로 만 xyphoid 과정 아래, 가위로 복막을 절감하고, 조리개 및 내장 장기를 노출합니다. 어떤 중요한 혈관을 가르기하지 않도록주의하십시오.
      3. 한 측면 측면에서 다른 다이어프램을 절단하여 흉강을 엽니 다.
      4. 자동 주사기 펌프에 연결된 25 G 바늘을 삽입하고 인산 완충액 60ml를 4 % PFA (0.1 M, pH 7.4의) 다음에 0.9 % 식염수 20 ㎖를 주입.
    2. 재관류가 완료되면, 집게를 사용하여 마음을 당겨 조심스럽게 그것을 해부. 집게로기도를 잡고 가위를 사용하여 그것을 통해 완전히 잘라. 부드럽게 위쪽으로 기관을 예인선과 흉곽에서 폐를 제거합니다. 에 조직을 해부하다왼쪽에서 오른쪽 폐를 분리합니다.
    3. 후위 차가운 2- 메틸 부탄에서 1 시간, 동결 샘플 파라 포름 알데히드 4 %의 조직 및 -80 ° C에 저장합니다.
    4. , 그라 이오 스탯을 사용하여 40 μm의 섹션을 수집 슬라이드에 즉시 마운트 (한 모든 다섯 번째), 아래에 설명 된대로 면역 조직 화학 염색을 위해 그들을 처리합니다.
  3. 조직 조각 Permeabilization 및 차단
    1. PBS (5 분 2 배)로 세척하고 실온에서 15 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100 PBS로 Permeabilize 하시려면.
    2. PBS (5 분 동안 2X)로 세척하고 실온에서 30 분 동안 PBS 중의 3 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단.
    3. PBS (5 분 2 배)로 세척하고 CC를 진행합니다.
  4. 조직 조각에 아 지드 - PEG3 - 플 루어 (545)와 CC
    1. 1 ml의 솔루션의 섹션 2에서 설명 된 바와 같이 제조 된 CC 시약을 혼합하여 용액을 제조, 추가 : 아 지드 - PEG3 - 플 루어 545 (5 밀리미터 주)의 2 μL, TCEP의 20 μl를 (갓 50 MM의 STOC 준비k)는, TBTA의 58.8 μL은 (갓) CuSO 4 · PBS의 2 O (50 mM의 주식) 5H, 900 μl를 20 μl를 1.7 mM의 작업 솔루션을 준비했다.
    2. 4.2 절에 따라 제조 된 조직 조각에 CC 믹스의 약 400 μl를 추가합니다. CC 믹스의 선택 볼륨이 조각을 커버하기에 충분하다고주의를 기울이십시오. 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안 품어.
    3. PBS (5 분 1X), 냉 메탄올 (5 분 1X), PBS 중 1 % 트윈 20, 0.5 mM의 EDTA (2 분 3X)의 용액, 및 PBS (5 분 1X)로 세척 하였다.
    4. 공기 건조는 DAPI와 antifade mountant 한 방울을 추가합니다 (소재 / 시약 표) 커버 슬립 (거품 형성을 방지)와 가까이하고, 폴란드어로 밀봉. 분석 할 때까지 4 ° C에서 보관.
  5. 이미지 획득
    1. 546 nm 내지 450 nm의 여기 용 레이저를 구비 한 공 초점 현미경을 사용하여 이하의 (소재 / 시약 표 참조)사용자 설명서.
    2. , NA = 1.40와 60X 대물 렌즈를 선택 접안 렌즈를 통해 슬라이드를 미리 확인하고 관심의 영역에 초점을.
    3. 샘플 및 장비 기능에 따라 인수 매개 변수를 확인합니다.

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결과

ARN14686는 NAAA 억제제 ARN726의 발판을 기반으로 설계되었다. ARN726의 4-tert- 부틸 시클로 헥 실기가 C9 포화 지방족 쇄 말단 알킨 태그 (도 1) 방위로 치환 하였다. 알킨 태그는 형광 또는 CC 통해 비오틴 분자를 추가하는 두 단계의 표시 절차의 이용을 허용하기 위해 도입되었다. 이 특징은 생체 외 및 생체 내 NAAA을 프로빙 매우 다용도 공구 ARN14686 렌더링한다.

여기, 우리는이 분자의 잠재력을 대표하는 ARN14686의 두 가지 응용 프로그램을 보여줍니다.이 여기에보고 된 실험 절차의 방식이다 그림. 프로브의 정맥 투여 후, 두 개의 서로 다른 검출 방법을 사용할 수 있습니다 단백질 얼룩으로 활...

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토론

효소 활성은 미세 RNA 전사, 단백질 합성, 단백질 전좌, 번역 후 변형 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 포함하여 다양한 수준에서 조절된다. 종종, 효소의 발현 혼자의 활동을 설명하지 않습니다. ABPP는 천연 상태의 단백질의 활성을 연구하기 위해 개발되었다. 두 가지 기능이 요구된다 : 공유 관심 효소 리포터 태그의 활성 부위에 결합하는 화학 프로브는 프로브 - 표지 효소를 검출.

프로브 설계 및 합성 과정의 중요한 포인트입니다. 프로브는 대상에 대한 충분한 친화력 및 선택성이 있어야합니다. 또한, 기자 태그의 존재는 참여 대상에 영향을주지해야합니다. 이 문제는 주로 대상이 잡힌 후에 리포터 태그를 도입 한 두 단계 ABP의 디자인에 의해 극복된다. 태그없는 프로브, 생체 내 연구에 특히 적합하다하는 단백질 활성최소한의 변경으로 외부 살아있는 세포 또는 유기체에 평가 될 수있다. NAAA 프로브 ARN14686은 위에서 설명한 요구 사항을 충족하도록 설계...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 이탈리아 제노바에 있는 Istituto Italiano di Tecnologia의 Nikon 이미징 센터(NIC@IIT)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,1'-설포닐디미다졸 Sigma Aldrich367818유해한
2-dipyridylcarbonateFluorochem11331유해한
2-methylbutanSigma AldrichM32631가연성, 독성, 수중 환경에 유해
4-(Dimethylamino)pyridineSigma Aldrich107700독성
아세트산Sigma Aldrich695092가연성, 부식성
아세토니트릴 Sigma Aldrich34998인화성, 독성
활성탄Sigma Aldrich161551
염화암모늄Sigma AldrichA9434유해한
아지드-PEG3-비오틴Jena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23227
Bio-spin columnsBiorad732-6204
BiotinSigma AldrichB4501
Blocking bufferLi-Cor Biosciences927-40000
β-mercaptoethanolSigma AldrichM6250Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA)Sigma AldrichA7030
Bromophenol 블루시그마 AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
Celite시그마 Aldrich419931건강 위험
Ceric 암모늄 나이트레이트 Sigma Aldrich22249산화, 유해한
클로랄 수화물Sigma AldrichC8383독성이 매우 강한
CuSO4.5H2O Sigma Aldrich209198독성
시클로헥사디엔시그마 알드리치125415가연성, 건강 위험
시클로헥산시그마 알드리치34855가연성, 유해한, 건강 위험, 환경 위험
디클로로메탄시그마 알드리치34856유해한, 건강 위험
디에틸 에테르시그마 알드리치296082가연성, 유해한
디메틸 설폭사이드(DMSO)아크로스 유기물348441000
디메틸 설폭사이드d6(DMSO-d6)시그마 알드리치175943
에탄올시그마 알드리치2860가연성, 유해한
에틸 아세테이트시그마 알드리치34858가연성, 유해한
글리세롤시그마 알드리치G5516
Irdye 680-LT 스트렙타비딘Li-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT 스트렙타비딘 Licor925-68031단백질 복합체를 침전시키기 위해 사용하기 전에 간단히 원심분리
메탄올Sigma Aldrich34966고독성
메탄올Sigma Aldrich34860가연성, 독성, 건강 위험
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′ -ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma AldrichE7750유해
<부식성>N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806가연성, 부식성, 독성
N,N-dimethylformamideSigma Aldrich227056가연성, 유해
N-Cbz-L-SerineFluorochemM03053유해한
Nikon A1 컨포칼 현미경 Nikon사용 설명서 읽기
NuPAGE 4-12% 비스트리스 젤Thermo Fisher ScientificNP0335BOX
팔라듐 온 카본Sigma Aldrich330108
p-anisidineSigma AldrichA88255독성, 건강 위험, 환경 위험
파라포름알데히드시그마 알드리치441244독성, 호흡기 유해, 부식성, 위조 가능
폴리(에틸렌 글리콜) Sigma AldrichP3265
ProLong Gold 안티페이드 마운턴트와 DAPI Thermo Fisher ScientificP36931기포 형성을 피하십시오
프로테아제 억제제 칵테일Sigma AldrichP8340
중탄산나트륨Sigma AldrichS6014
도데실황산나트륨 (SDS) Sigma AldrichL3771독성, 부식성, 위조 가능한
소듐 하이드라이드 Sigma Aldrich452912가연성
황산나트륨Sigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 이미지 스캐너FUJIFILM사용자 매뉴얼
Streptavidin agaroseThermo Fisher Scientific20349
설탕시그마 AldrichS7903
Tert-부탄올Sigma Aldrich360538독성, 인화성
TetrahydrofuranSigma Aldrich186562가연성, 유해, 건강 위험
ThioureaAcros Organics424542500독성, 50°C에서 따뜻함; C, 트리스를 용해시키다
: 시그마 알드리치RDD008
트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)시그마 알드리치C4706
트리스 [(1- 벤질 -1H-1,2,3- 트리아졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA)시그마 알드리치678937
트리톤 -x100시그마 알드리치x100독성
트윈 -20시그마 알드리치P9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 염기성 조직 균질화 장치IKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739유해한
요소Sigma AldrichU5378독성, 50°C에서 따뜻함; C를 용해시킵니다.

참고문헌

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