방법 논문

생물학적 설정에서 생성 및 관측 화학 발광위한 새로운 기술

DOI:

10.3791/54694

⸱

2017년 3월 9일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2KAUST Catalysis Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Department of Chemistry, Hunter College, and PhD Program in Chemistry, Graduate Center of City University of New York, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 루테늄 복합체를 화학발광 발광원으로 사용하여 생체 내 이미징 중에 높은 신호 대 잡음비를 생성하는 새로운 수술 중 이미징 기술을 설명합니다. 수술 중 영상은 수술 절차가 수행되는 방식에 혁명을 일으킬 수 있는 확장 분야입니다.

초록

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수술 중 영상 기법은 외과적 개입을 보다 안전하고 효과적으로 만들 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 이유로 이러한 기법은 수술실로 빠르게 도입되고 있습니다. 여기에서는 수술 중 이미징에 대해 아직 연구되지 않은 기술인 화학발광 이미징을 활용하는 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 방법은 맞춤형 분무 시스템과 함께 루테늄 기반 화학발광 리포터를 사용하여 높은 신호 대 잡음비로 생체 외 또는 생체 내 이미지를 생성합니다. 루테늄 기반 리포터는 수성 산화 용액에 노출되고 주변 조직 내에서 재환원된 후 빛을 생성합니다. 이 방법을 통해 6.9 pmol/cm2의 낮은 리포터 농도를 감지할 수 있었습니다. 이 연구에서는 마우스의 피하 및 정맥 주사와 관련된 개념 증명 in vivo 연구에 대한 시각적 가이드를 제시합니다. 결과는 이 기술이 향후 전임상 연구를 위한 유망한 후보이며 궁극적으로 수술실에서 유용한 도구가 될 수 있음을 시사합니다.

서론

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최근 수십 년 동안, 이미징 기술은 의사들이 질병을 진단하고 모니터하는 방식을 혁명을 일으켰다. 이러한 영상 기술은, 그러나, 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 전산화 단층 촬영 (SPECT), 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI) 등의 전신 이미징 시스템에 크게 제한되어왔다. 특별한주의를 암에 지불 된, 기술 이미징 혁신은 크게이 질병 진단 및 치료하는 방식을 개선했습니다. 수술실 이러한 발전에도 불구하고, 이러한 영상 기술 단지에 맞지 않는 한 곳이있다. 전신 이미징 기술 수술 계획에 도움을 줄 수 있지만, 그들은 일반적으로 종양 조직을 모두 제거되었거나 잔류 종양 조직을 절제 한 숨겨져 남아 있는지 의사 실시간으로 판별 할 충분히 높은 공간 해상도가 부족하다. 더 침윤성는 것을 확인종양 마진이 남긴 가장 중요한 수술의 목표 중 하나이며, 외과 의사는 엄격하고 신중 조직 절제술 사이에 꽉 밧줄을 걸어 가야한다. 지나치게 제거하면, 환자에게 부작용이 악화된다; 너무 작은이 제거 된 경우, 재발률은 3이 증가한다. 따라서, 정확한 종양 마진을 묘사하는 것이 중요하며, 우리는 화학 발광 수술 촬상 다르게 설정 기술에 들키지 않고 남아 있었다 악성 조직의 시각화 외과 도와서 종양 마진의 확인의 정확성을 개선하는 데 도움이 될 수 있다고 믿는다.

현재 수술 이미징 시스템으로서의 가능한 유틸리티 조사되고 많은 영상 기술이있다. 이러한 β- 및 γ 방사선 방출 프로브 침 (4), 광 형광 5, 6 라만 분광법을 포함 >, 7, Cherenkov 발광 8,9. 그러나 현재까지 이들 중 어느 것도 표준 임상 도구로 설정되지되고있다. 광 형광 이미징 지금까지 이들 기술 중 가장 유망한 것으로 입증 가장 탐구 그러므로있다. 이미 많은 애플리케이션을위한 유용한 도구로 도시되었지만, 한계가없는 것은 아니다. 실제로, 그 주요한 결점은 본질적 autofluorescent 생체 조직에 의해 생성되는 배경 형광이다. 이 배경 autofluorescent 신호는 형광 신호의 발생을 위해 필요한 외부 광원에 의해 상기 형광 물질 외에, 주변 조직의 여기의 산물이다. 실용적인 관점에서 볼 때,이 형광도 잠재적으로 수술실에서이 기술의 유용성을 제한 할 수있는 낮은 신호 대 잡음비를 초래할 수있다.

교장형광 이미징 위에 화학 발광 이미징의 장점은 여기 광이 필요 없다는 것이다. 그 결과, 배경 형광도 없다. 화학 발광 이미지에서, 여기 에너지 대신에 화학적으로 생성된다. 이 프로세스는 높은 신호대 잡음비가 발생할 수 있으므로 의도하지 않은 배경 신호를 생성하지 않고. 이것은 궁극적으로 절제의보다 정밀하고 정확한 검출 될 수 있습니다. 다소 놀랍게도, 수술 중 영상 기술로이 방법의 유용성은 10 미개척 남아있다. 사실,이 기술에 가장 가까운 예는 마우스 (11), (12, 13)에 마이 엘 로퍼 옥시 다제에 의한 루미놀의 산화이다. 하이와 로우 백그라운드 신호 발생 (1) 최소 자기 형광 : 화학 발광 바이오 메디컬 이미징은 다음과 같은 장점을 제공 할 수있는 연구 오히려 비경 영역 그러므로gher 신호대 잡음비; (2) 표시 상태에서 근적외선 범위 화학 발광 배출량 가변 파장; 및 (3), 링커 기술과 함께 이미 존재하는 생체 분자를 표적으로하는 경우 표적 분자 이미징 프로브 (14)의 전체 라이브러리에 대한 액세스를 제공 functionalizable 화학 발광 착체.

이 원리 증명 연구는 루테늄 계 조영제를 이용한 생의학 속에서 화학 발광 이미징의 전위 유틸리티를 나타낸다. 이 화합물의 화학 발광 특성은 물론 1960 년대 중반 15 거슬러 올라가는 조사와 연구한다. 화학 활성화되면, 에이전트는 의료 촬상 목적에 적합 약 600 nm의 빛 (16)을 생성한다. 활성화 에너지는 여기 상태 물 17 -foll 650 NS의 수명이 리드 산화 환원 반응에 의해 제공된다이 여기 상태의 완화에 광자의 생성에 의해 빚진. 특수하게 설계된 원격 분무기를 사용하여, 우리는 두 화합물이 생체 외 및 생체 내에서 검출 할 수 있었다. 초기 실험 결과는이 기술의 추가 조사를 제안 매우 유망하다.

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프로토콜

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윤리 문 : 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터 (MSK) 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 된 기술 된 생체 내 동물 실험의 모든.

Nebulizing 장치 1. 건설

  1. 두 개의 나사 (X 25mm 2 ~ 4)를 사용하여 파트 B (12.7 X 10.7 X 1.8 cm 3)의 중앙에 수직으로 나무 부 A (12.5 X 2.5 X 1.8 cm 3)를 연결합니다. 나무 부품 C를 연결합니다 (11 × 2.5 × 1.8 cm 3) 파트 C (11 X 2.5 × 1.8 cm 3) 여전히 이동 될 수 있도록 하나의 나사를 사용하여 부품 A (12.5 X 2.5 X 1.8 cm 3)의 중간에. 그림 1을 참조하십시오.
  2. 두 개의 루프, 하나에 하나를 형성하기를 통해 두 개의 구멍 플라스틱 3온스 미니 스프레이 (D)의 스프레이 병 트리거의 하단 끝을 통해 드릴 및 스테인레스 스틸 막대를 밀어 (1/16 "강 10cm) (E) 트리거의 측면.
  3. 오프 미끄러지는 케이블 타이를 방지하기 위해 덕트 테이프 (F)와 분 무병의 저면 부분을 감싸. 두 개의 플라스틱 케이블 타이를 이용하여 나무 파트 C (11 X 2.5 × 1.8 cm 3) (28cm) (G)에 스프레이 병을 연결합니다.
  4. 011 서보 모터 (I)를 잘라 및 서보 제어 (H)의 느슨한 케이블을 다시 연결합니다. 그런 다음, 덕트 테이프를 사용하여 나무의 부품 A (12.5 X 2.5 X 1.8 cm 3)의 정상에 서보 모터를 연결합니다.
  5. 종이 클립 (K)를 사용하여 서보 모터 레버 연필 (J)를 부착. 단단히 플라스틱 피복 꼬임 선 (L)를 사용하여 강철 막대의 연필 루프의 가장 바깥 쪽 부분을 연결 덕트 테이프로 연필 단부를 고정.
  6. 서보 모터 제어부의 자기 케이블 커넥터 (M)을 절단하고, 스피커 케이블 (N)으로 다시 연결. 이어서, 목재 부 B (12.7 X 10.7 X 1.8 cm 3)에 서보 모터 제어부 테이프. 반 자기 커넥터가있는 W1 케이블을 잘라 구리의의 느슨한 끝으로 한 부분을 첨부peaker 케이블 (1m). 사용 가능한 W1 케이블과 9V 배터리의 (자기) I2 토글 스위치 및 P1 전원을 연결합니다.

[방법] 2. 감도 결정

  1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 260 μg의 (347 nmol의), 52 μg의 (69 nmol의), 26 μg의 (34 nmol의)의 양 역삼 투 물 (100 μL)의 [Ru로 (BPY) 3] CL 2의 솔루션을 준비 5 μg의 (6.9 nmol의) 3 μg의 (3.5 nmol의) 520 NG (694 pmol의) 260 NG (347 pmol의) 52 NG (69 pmol의) 26 NG (34 pmol의) 5 NG (6.9 pmol의) 3 NG (3.5 pmol의).
  2. 각 100 μL 믹스 [(RU BPY)을 3] CL 암모늄 세륨 질산염 수용액 100 μL 2 용액 ((NH 4)이 세륨 (NO 3) 6) 현미경 슬라이드에 물 (25 mM)을한다.
  3. 이미징 소프트웨어를 초기화하여 생물 발광 리더의 인수를 설정합니다.
    1. 사용자 프로필에 로그인하고 아퀴를 찾습니다sition 제어판. "초기화"악기가 준비가 될 때까지 기다려야을 클릭합니다.
    2. 선택 해제 "영상 모드"를 찾아 "발광"과 "사진"이 선택되어 있는지 확인하고 "형광".
    3. 변경 "노출 시간"20 초에 "발광"에 대한 설정. "비닝을"다음과 같이 "발광"에 대한 나머지 설정을 중간; "F / 정지": 1; 그리고 "배출 필터"를 엽니 다.
      주 : 노출 시간은 계측 및 사용 실험 설정에 따라 적용해야 할 수 있습니다, 제시된 설정 다른 경우.
    4. "노출 시간":은 "사진,"다음 설정을 사용하여 자동; "비닝": 중간; 및 "F / 정지"8. "필드보기의"드롭 다운 메뉴에 대한 target.Look 이미징에 따라 "제목 높이"를 조정합니다. 초기 설정은 "C."입니다 는 C 사이의 "B"로 변경 (14cm 거리amera 및 샘플 단계).
  4. 산화제로부터 보호하기 위해 상기 촬상 챔버의 바닥에 검은 건설 용지에 현미경 슬라이드를 배치하여 분무기를 설정한다. 의 100 μLdroplet 믹스 [Ru로 (BPY)을 3] CL 2 -solution 수용액 100 μL (NH 4) 2 세륨과 (NO 3) 6. 녹색 상자의 십자선을 준수하십시오.
    1. 흑색 도화지에 촬상 대상을 배치, 관심 영역은 녹색광 박스 십자선의 중심이되도록 시료 스테이지 상에 디스플레이. 나무 지원에서 플라스틱 스프레이 병을 분리하여 분무기를 준비합니다. 그 플라스틱 저장 용기에 (물 / 에탄올 (3) 1)과 나무 지원에 다시 연결 트리 에틸 아민 용액을 채 웁니다.
    2. 생물 발광 리더 내부의 분무기를 놓고 전원 코드가 분무기 코드에서 분리되어 있는지 확인하십시오. 확인이 전원 스위치에이고, 토글 스위치가 꺼져 있고 빨간색 LED가 켜집니다 분무 노즐 헤드에 의해 촬상 대상을 향해 카메라 뷰 방해를 최소화하면서 분무 흐름 촬상 주제에 관심의 영역을 향해 가리키는되도록 분무기를 놓는다.
    3. 스프레이에서 그들을 보호하기 위해 (현미경 슬라이드 또는 주사 부위에 예를 들어, 흰색 마크) 잠재적 인 핫스팟을 통해 건설 용지의 작은 검은 조각을 놓습니다. 장소는 촬상 피사체 분무기 또는 자성 도어 래치를 방해하지 않도록, 촬상 챔버 내부 분무기 리모컨 코드의 적어도 40cm. 이미징 시스템 덮개를 닫습니다.
      참고 : 십자선에서 설정 "보기의 필드"에 따라 크기를 변경할 것 "이미지 생활;" 이것은 "B"로 설정되어 있는지 확인합니다.
  5. 상기 영상 시퀀스를 시작하여 화상을 취득. 에서 "획득"을 클릭 "취득 제어판." 제 1 이미징에 sequ줬어, 원하는 (권장) 경우 자동 저장을 활성화하고 데이터 폴더를 선택합니다. 순서가 끝날 때까지 "편집 영상 레이블"대화 상자를 무시합니다.
    주 : 제어 소프트웨어는 기기의 동작을 단계별로 실시간으로 표시됩니다. 측정 준비 및 오른쪽 위치에 시료 스테이지를 이동 한 후에는 카메라 셔터를 열고, 측정 시간을 카운트한다. 셔터 개구는 기계에 의해 생성되는 클릭 소리로 들릴 수있다.
  6. 화학 발광을 생성하는 전환 스위치를 세 번 전환 : 셔터가 열리면, 트리 에틸 아민의 용액을 세 버스트 (물 / 에탄올 (3) 스프레이 버스트 당 0.24 ± 0.04 mL의 1)을 스프레이.
    참고 : 샘플 단계는 측정하는 동안 이동합니다. 이 수 있도록 기기 내부에 충분한 (최소 40cm) 케이블을 둡니다. 이 솔루션은 상승 관에 의해 열망 할 수있는 분무기로 살포 할 것을 파이프에 기포가 없는지 확인합니다. 몇 가지 예비 BATTERIE이필요한 경우 준비 분무기에 대한의.

생체 이미징 3. 전신 정맥 주입 후

  1. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에서 [Ru로 (BPY) 3] 2 nmol의 CL 8 내지 33를 함유하는 인산 완충 식염수 (PBS) 용액을 100 μL를 준비한다. 수용액 (NH 4)이 준비 세륨 (NO 3)과 동시에 물 (25 mM)을 6.
  2. 정맥 건강한 마우스의 꼬리 정맥에 100 μL [(RU BPY) 3] Cl2를 주입 (N = 5).
  3. CO 2 질식 통해 주사 후, 마우스를 안락사 10 분.
    1. 다음 심장과 폐를 노출하는 U 자형의 늑골 아치를 제거, 몸통에서 Y 컷과 피부를 제거합니다. 좌심실 (18)에 24 게이지 바늘을 통해 PBS 20 mL로 우심방에 배출구를 절단 주사하여 마우스를 관류. 조심스럽게 배를 잘라피부와 신장과 간을 노출. 눈에 보이는 컷을 만드는 기관을 통해 길이 방향으로 잘라.
  4. 다음과 같이 변경하여, 단계 2.3-2.6에 설명 된대로 인수를 설정합니다.
    1. 철저하게 분무기 플라스틱 저장 용기를 세척 한 후, 대신에 트리 에틸 아민의 물 (NH 4) 2 용액 세륨 (NO 3) (6) (25 밀리미터)로 채운다.
      참고 : 그것은 철저하게 결정화 때문에, 모든 사용 후 분무기 노즐을 세척하는 것이 중요하다 (NH 4) 2 세륨 (NO 3) 6 여러 사용 후 스프레이 노즐을 파괴 할 수있다.
  5. 이미지에 대한 전체 동물 또는 기관 샘플을 사용합니다.
    1. 전체 복부 이미징 카메라와 악기의이면 가리키는 헤드 대향 개방 복부와 마우스 커스 위치. 기관을 중심으로하는 녹색 빛 상자 십자선에 (예를 들어, 간 또는 신장)을 이미지화한다.
    2. 에프또는 기관 이미징 및 정량 각각의 촬상 기기에서 마우스를 제거하고 아래에 핀. 이미 개방 체강부터 내부 기관 (예, 신장, 간, 폐, 근육, 비장, 뇌 및 심장)을 절제. 근육 조직을 절제하기 위해 뒷다리 피부를 잘라. 조심스럽게 뇌를 절제하기 위해 메스로 두개골을 엽니 다.
      1. 관심있는 기관은 간, 신장, 비장 인 경우, 길이 방향으로 절반의 모든 장기를 잘라 배양 접시 또는 검은 건설 용지의 조각에 각 기관을 배치합니다.
    3. 단일 기관에 대한 화학 발광 추적의 상대적 방출을 설정하는 단계 2.3-2.6에 설명 된 절차를 따르십시오.

림프절 4. 생체 내 이미징

  1. [(RU BPY) 3] Cl2를 80 nmol의 PBS를 함유하는 용액 10 μL를 준비한다. 의 수용액 (NH 4) 2 세륨을 준비 (NO 3) 6 워싱턴에서동시에 터 (25 mm)이다.
  2. subdermally 건강한 쥐의 뒷발에 용액 10 μL를 주입 (N = 5). 음성 대조군으로, 순수한 PBS 10 μL와 반대쪽의 발을 주입. 주입 후 CO 2 질식을 통해 15 분 생쥐를 희생. 오금 림프절까지 림프 운하를 노출 모두 뒷 다리에 피부를 제거합니다.
  3. 단계 3.4에 설명 된대로 인수를 설정합니다.
  4. 양쪽 뒷다리에서 오금 림프절을 제거 절반을 절단하고 정량화하기위한 목적으로, (단계 3.5.3) 이전에 설명한 바와 같이, 페트리 접시에서 산화제로 스프레이.

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결과

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프로토콜 제 1 절에서 설명 된 분무기 시스템을 저비용으로 용이하게 이용 가능한 재료로 구성 될 수있다. 원격 트리거 생물 발광 판독기 내부에 환원 / 산화제의 분사 (그림 1)에 대한 삽입 될 것입니다. 우리의 디자인은 렌즈로부터 14cm 거리에서 생물 발광 리더 내에서 분무기의 안전한 작동 할 수 있습니다. 렌즈의 김서림이나 흐려짐이 작동 동안 관찰되지 않았다. 우리는 시판 화학 발광 에이전트 [Ru로 (BPY) 3] 낮은 가격을 기준으로 우리의 방법의 개발을위한 CL 2, 수용액 잘 설명 산화 환원 행동 및 화학 발광 특성의 안정성 (그림 2) (19)를 선택했다. [(RU BPY) 3] (CL)이 (100 μL 한 방울을 산화하여 프로토콜 (2)에 기재된 바와 같이 최소한의 검출 신...

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토론

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여기서는 광학적 화학 발광 리포터에 의해 생성 된 광자의 방출을 통해 조직을 서술 할 수있는 기술을 제안 하였다. 다른 대조적으로, 더 많은 화학 발광이 리포터 시스템은 비 방사성 매우 높은 민감도 수준에서 검출을 용이하게하는 이미징 프로브를 이용하는, 기술, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 설립. 아마도 더 중요한 것은, 화학 발광 이미징 (광 형광 이미징처럼) 입사 광원 (20), 형광도를 최소화 대폭 배경 신호를 감소시키는 특성을 요구하지 않는다.

루테늄 기자 [Ru로 (BPY)...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 도움이 되는 토론을 해준 Jan Grimm 교수와 Travis Shaffer, 그리고 원고를 편집해 준 David Gregory에게 감사를 표합니다. NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48의 일부 지원을 받는 MSK Animal Imaging Core Facility에서 제공하는 기술 서비스에 감사의 뜻을 전합니다. 저자는 NIH(K25 EB016673 및 R21 CA191679, T.R. 및 4R00CA178205-02, B.M.Z.), MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology(T.R.), Tow Foundation(B.C.), National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship(IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. 및 T.M.S.)의 아낌없는 지원에 감사를 표합니다. 이 간행물에 보고된 연구는 King Abdullah University of Science and Technology의 자금 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
목재 부분 A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm)  3/4" x 24" x 30" 자작나무 합판 시트에서 잘라낸131404
나무 부분 B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)/4" x 24" x 30" 자작나무 합판 시트에서 잘라낸Woodcraft131404
C 부분 (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404 르쿼; 자작나무 합판
시트 나사 (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz 미니 스프레이어침대, 목욕 및 그 너머
스테인레스 스틸 막대 (1/16" 스틸 10cm)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
페이퍼 클립Office Depot221720
스피커 케이블RCA Inc.
에너자이저 9V 알카라인 배터리에너자이저 홀딩스 Inc.EN22
Hitech HS-82MG 마이크로 서보 모터, 3.4kg/cm 출력 토크 @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
이름회사카탈로그 번호 코멘트
28cm 플라스틱 케이블 타이General Electric Inc.50725
덕트 테이프3M Inc.3939
littleBits w1 와이어littleBits Inc.w1 와이어
littleBits p1 파워littleBits Inc.p1 파워
littleBits i2 토글 스위치littleBits Inc.i2 토글 스위치
littleBits 011 서보littleBits Inc.011 서보
20cm 플라스틱 커버 와이어 트위스트 타이Four Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.
224758 암모늄 세륨 (IV) 질산염시그마 - Aldrich Inc.22249
이소플루오란박스터 헬스케어1001936060
PBS시그마-알드리치PBS1
에탄올시그마-알드리치2854
트리에틸아민시그마-알드리치 Inc.T0886
수질은 Milipore Mili-Q(R≥ 18 MΩ)를 사용하여 정제했습니다.
여성 누드 (근친 교배) 생쥐Jackson Laboratories1929나이 5 - 6 주
균주 C57BL/6J   
NU/J 수컷 마우스 at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 주
IVIS 200 생물 발광 리더캘리퍼 라이브 사이언
라이브 이미지 4.2 소프트웨어Perkin-Elmer128165
현미경 슬라이드ThermoScientific4951PLUS4
Woodcraft 33/4" x 24" x 30&에서 잘라낸 AH1650SN스

참고문헌

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