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방법 논문

LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합

8.2K 조회수

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DOI:

10.3791/54707

⸱

2016년 12월 30일

 ,  ,  , 
1Max-Planck Institute for Immunobiology und Epigenetics, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM), University of Freiburg, 3Centre for Biological Signaling Studies, BIOSS, University of Freiburg, 4Albert-Ludwigs-Universität, 5Institute for Biology III (Mol. Immunology), Albert-Ludwigs-Universität

이 논문에서

요약

광학적으로 제어되는 물질은 신호 경로를 연구하는 강력한 도구입니다. 가능한 실험의 범위를 확장하기 위해 유세포 분석을 사용하여 광학 제어 물질을 실시간으로 연구할 수 있는 장치인 LED Thermo Flow를 개발했습니다.

초록

광유전학 도구를 사용하면 복잡한 신호 경로 내에서 거의 모든 신호 분자에 대한 고립된 기능적 조사를 수행할 수 있습니다. 주요 장애물은 세포 샘플에 대한 빛의 제어된 전달이므로 광유전학 연구에 가장 널리 사용되는 도구는 현미경 기반 세포 분석 및 체외 실험입니다. 유세포 분석기는 단일 세포 분해능에서 수천 개의 세포를 신속하게 측정할 수 있는 기능을 포함하여 현미경에 비해 주요 장점이 있습니다. 그러나 아직 광유전학에서는 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 광유전학과 유세포 분석의 힘을 결합한 장치인 LED Thermo Flow를 소개합니다. 이 장치는 유세포 분석 측정 중에 특정 파장, 광도 및 온도에서 세포를 비춥니다. 저렴한 비용으로 구축할 수 있으며 가장 일반적인 유세포 분석기와 함께 사용할 수 있습니다. 그 유용성을 입증하기 위해 우리는 생체 내에서 실시간으로 Dronpa 단백질의 광스위칭 역학을 특성화했습니다. 이 프로토콜은 거의 모든 광학 제어 물질에 적용할 수 있으며 가능한 실험 세트를 크게 확장할 수 있습니다. 더 중요한 것은 새로운 광유전학 도구의 발견 및 개발을 크게 단순화할 것이라는 것입니다.

서론

그들은 1-4 경로 신호의 배선를 해독하는데 사용할 수 있기 때문에 Optogenetic 도구 부분에서 인기를 얻어왔다. 이들은 광이 조명 될 때 그 형태 및 결합 친화도를 변경하는 광활성 단백질의 능력에 기초한다. 신호 요소에이 단백질을 융합하는 복잡한 세포 내 신호 전달 경로 5-12 내에서 단일 플레이어의 특정 규제 수 있습니다. 결과적으로, 신호 전달은 높은 공간적 해상도를 연구 할 수있다.

대부분의 셀 기반 optogenetic 연구 생화학 분석 11,12 뒤에 빛의 존재하에 배양 결합 현미경 기반 방법을 사용한다. 대조적으로, 플로우 사이토 모세관 따라 세포 단수형 셀 크기, 입도 및 형광 강도를 측정한다. 이 방법은 thousan 분석 할 수있는 기능을 포함하여 현미경 또는 생화학 적 방법에 비해 큰 장점을 가지고 있습니다매우 짧은 시간에 단일 셀 해상도에서 살아있는 세포의 DS. 그러므로, 유동 세포 계측법에 optogenetics을 결합하는 것이 바람직하다.

우리의 지식에, optogenetic 유동 세포 계측법에 대한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 광범위하게 허용 절차는 수동 플래쉬 장치 반응 관 외부로부터 셀을 조명하기위한 것이다. 그러나, 유동의 수동 조명 사이토 생균 촬상 원통형 가열 수조를 들어, 반응 관을 통과하는 광을 필요로한다. 이것은 상당한 광 산란 빛의 손실이 발생합니다. 또한, 수동에 의해 제공된 조명의 광 강도 (등 각도 간격) 실험 간 재현성이없는 한 실험에서 파장의 수에는 실제적인 한계가있다.

LED가 열 유량 장치를 구성함으로써, 이러한 한계를 극복 할 수 있었다. 이 장치로, 세포는 임시의 특정 파장으로 조명 될 수있다erature 제어 유세포 측정 중에 방식. 이것은 내 실험 사이의 빛의 정확하고 재현성있는 양의 수 있습니다.

생체 내에서 우리의 장치의 유틸리티를 설명하기 위해, 우리는 photoswitching 동안 라모스 B 세포에서 Dronpa의 형광 신호를 기록했다. 라모스 B 세포는 인간 버킷 림프종으로부터 유도된다. Dronpa는 단량체, 이량 체 또는 사량 체로서 존재 형광 단백질이다. 그 단량체 형태에서, 비 형광이다. 400 nm의 빛 조명은 이량 및 테트라을 유도하고 Dronpa 단백질의 형광을 렌더링합니다. 이 프로세스는 500 nm의 광을 조사하여 반전 될 수있다. Dronpa 단백질은 단백질 4,13 시그널링의 기능과 위치를 제어하는 데 사용되어왔다.

여기, 우리는 사이토의 흐름에 Dronpa의 photoswitching을 연구하는 라모스의 B 세포에서 Dronpa-링커 Dronpa 단백질을 표현했다. 우리의 장치를 사용하여, 우리가 할 수 있었다 효율적이고실시간으로 그 형광 강도를 기록하는 동안 재현 Dronpa을 포토 스위치. 이 방법은 수동 조명 현재 조명 프로토콜을 통해 상당한 이점을 제공하고 크게 optogenetic 도구와 케이지 화합물에 대한 실험적인 레퍼토리를 넓혀. 크게 간소화 및 신규 optogenetic 도구의 발견과 개발을 촉진 할 우리의 장치를 사용.

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프로토콜

1. 디자인 및 장치 구축

  1. 파일럿 실험
    참고 : 특정 optogenetic 도구 및 세포 유형에 필요한 빛의 강도는 상당히 다를 수 있습니다. 프로토 타입 파일럿 실험에 필요한 최소 광량을 측정하는 데 유용하다. 이하의 실험에 사용되는 툴은 optogenetic Dronpa - 링커 Dronpa 융합 작 제물이다. Dronpa 순서는 상업적으로 (자료 목록을 참조)를 얻었다. 긴 링커 발현 구조는 분자 (및 분자간) 이량 체를 형성 할 수 있도록 두 Dronpa 서열 사이에 클로닝 하였다. 이하의 단계는 많은 다른 optogenetic 도구 나 광 제어 물질로 구성 될 수있다.
    1. 포장 세포에서 레트로 바이러스 함유 뜨는을 사용하여 전달하기위한 제조업체의 지침을 따르는 Dronpa-링커 Dronpa 포함하는 구조로 라모스 B 림프구를 형질 도입. 사전에 따라 수확 및 카운트 세포viously 프로토콜 13을 발표했다.
    2. 의 농도로 재현 탁 된 세포를 1 × 106 매질 / ㎖ (1640 RPMI, 10 %의 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) 및 유리 FACS 튜브로 전송.
    3. 사이토 흐름에 튜브를 삽입하고 Dronpa (GFP 채널) 14, 15의 형광 강도를 측정한다.
    4. 아마도 손상 파장으로부터 눈을 보호하기위한 모든 추가 단계에 대한 보호 안경을 착용 할 것.
    5. 수동으로 튜브의 외측에 500 nm의 LED 광을두고 Dronpa의 형광 강도를 측정 계속한다.
    6. Dronpa의 형광 강도가 감소 할 때까지 LED 조명의 수 및 / 또는 강도를 높입니다.
    7. 수동으로 튜브의 외부에 400 nm의 LED 조명을 배치하고 Dronpa의 형광 강도를 측정 계속합니다.
    8. Dronpa의 FLUO 때까지 LED 조명의 수 및 / 또는 강도를 증가강도 증가 rescence.
    9. 단계 1.1.5과 1.1.7에서 photoswitching에서 필요하다고 예측으로 장치를 구축하기위한 최소한 많은 LED 조명을 사용합니다.
  2. 장치 구축
    주 : 장치 전문 가공 숍, 프라이 부르크 대학에서 Arbeitsgruppe Technik에 의해 지어졌다. 대부분의 부품은 맞춤 제작 한 상업적으로 사용할 수 없습니다. 각 부분의 정확한 치수는도 1 및도 2에 도시된다. 이 장치의 조립을 명확히하기 위해, 부가 비디오 1은 제공되고, 가장 중요한 단계는 아래에 설명된다.
    1. 도 1a에 도시 된 정확한 측정을 폴리 비닐 클로라이드 (PVC)로부터 밀 피스를했다.
    2. 조각 (A)의 드릴 구멍에 LED 조명을 삽입하고 누수를 방지하기 위해 PVC 접착제와 각 구멍을 밀봉.
    3. 멀티 채널 변압기에 LED를 연결하면 (각각의 파장은 별도의 chann를 차지한다0-29mA에서 조정 가능한 출력 전력과 엘).
    4. 물리적 손상으로부터 LED를 보호하는 도시 된 부분 (A)에 3 개의 나사를 외장 시스 (B)를 부착.
    5. 부분 (A)의 천공 구멍에 튜브 클립 (C)에 물 펌프, 접착제에 장치를 연결할 수 있도록 (도 1a에 도시 된 바와 같이, 단면 Y : 9 mm와 61.5 mm) PVC 접착제를 사용.
    6. 58.5 mm 긴 플렉시 글라스 튜브 (D1)를 잘라.
    7. 그림 2에 도시 된 바와 같이 유기 유리로 만들어진 조각 D2와 D3를 생산하고 있습니다.
    8. 플렉시 유리 접착제와 D1의 바닥에 접착제 조각 D3.
    9. 조각 D2에 고무 O 링을 부착하고 플렉시 유리 접착제와 D1의 상단에 접착제.
      참고 : 조각 D1, D2와 D3가 함께 조각 D.을 형성
    10. 3 나사 부분 (A) 내로 조각 D를 삽입합니다.
    11. 변압기에 전원을 공급하기 전에 누수에 대한 장치를 테스트합니다.

2. Optogenetic 도구의 속도론을 측정

  1. 세포를 준비
    1. RPMI-배지에서 배양 라모스 B 세포 (RPMI 1640, 10 % 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) -3-의 밀도 10 × 106 세포 / ㎖, 37 ℃에서 5 % CO 2.
    2. 350 XG에 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 수확 라모스 B 세포.
    3. 제조업체의 지침에 따라 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 600 μL 매체에 1-5 × 10 6 세포를 재현 탁.
    4. 유리 FACS 튜브에 세포 이동을 측정 할 때까지 빛으로부터 얼음에 넣어 그들을 보호한다.
  2. 유동 세포 계수기와 장치를 준비합니다.
    1. 가열 된 물 펌프에 장치를 연결하고 37 ° C의 온도를 조절합니다.
    2. 유리 FACS 튜브를 사용할 때, 사이토 고무 O 링으로 유동 검정 O 링을 교환하고 별도로 실리콘 GR 적용용이함.
  3. 측정
    1. 조심스럽게 장치에 유리 FACS 튜브를 삽입하고 (그림 3) 흐름 cytometer에 연결합니다.
    2. 측정을 시작하고 Dronpa 형광 강도 (GFP 채널)를 기록.
    3. 각각 400 내지 500 nm의 빛으로 세포 샘플을 조명하고 Dronpa 형광 강도 (GFP 채널)를 기록한다.
  4. 데이터 분석
    1. 소프트웨어 사이토 적합한 흐름 실험 데이터를 분석 할 수 있습니다. 측방 산란 및 게이트 살아있는 세포에 대한 플롯 앞으로 산란. 시간 경과 Dronpa 형광 강도를 플롯.

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결과

플로우 사이토와 LED 열 흐름을 사용하여

장치의 기능은 코어 등이 내측 가리키는 원형 방식으로 배열 된 LED 된 원통형 챔버이다. 이 챔버는 LED의 온도뿐만 아니라, 세포 샘플을 제어 가능하게하는 급수 펌프에 연결될 수있다. LED는 변압기에 연결되어 있으며, 따라서 각각의 파장에 대한 광 세기가 개별적으로 제어 될 수있다. 장치의 중심은 가장 표준적인 유동 세포 계측기에 접속 될 수있는 표준 크기 FACS 튜브 수용한다 (도 4 및도 5). 세포의 바람직하지 않은 가열로 이어질하지 않는 우리의 장치에 그 조명을 표시하려면, 우리는 세 가지 다른 파장에 대해 시간에 조명 PBS의 온도 (그림 6)를 측정 하였다. 360 나노 미터, 400 나노 미터 또는 500 나노 ...

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토론

LED가 열 흐름은 흐름 세포 계수기에 optogenetic 도구를 연구하는 혁신적인 장치입니다.

지금까지 optogenetic 샘플은 현미경 레이저 또는 플래시 장치 (11, 12)으로 조사되었다. 샘플을 플래쉬의 각 거리에 따라 조도의 양의 상당한 변화는 실험간에 예상된다. 또한, 한 사람이 실험에서 동작 할 수 손전등의 개수에는 제한이있다. 이 실험 레퍼토리와 재현성을 제한합니다. 이러한 제한은 살아있는 세포에서 실시간 photoswitching 동력학을 특성화하는데 사용될 수있는 우리의 장치의 개발 동안 해결 하였다. 우리의 지식에 더 유사한 장치가 없습니다.

현재 구성에서 최대 30 개의 LED는 하나의 열 유량 용기에 내장 될 수있다. 따라서, 각각의 파장에 필요한 빛의 강도에 따라, 하나의 장치는 우리가 될 수 있습니다optogenetic 도구의 광범위한 에드. 설정된 photoswitchin...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

장치를 제작해 준 프라이부르크 대학의 J. Schmidt에게 감사드립니다. 이 원고에 대한 지원과 비판적 읽기에 대해 P. Nielsen과 D. Medgyesi에게 감사드립니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft를 통한 SFB746과 독일 연구 재단의 Excellence Initiative(GSC-4, Spemann 대학원)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유리 FACS 튜브Thermo Fisher Scientific; Waltham, 미국14-961-26붕규산 유리관 12x75 mm
유세포 분석기BD Bioscienceg; 독일 하이델베르크포르테사 II특별 주문
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-NAddgene; 미국 케임브리지41645
PolyJetSignaGen, Rockville, USASL100688
LED 505nmAvago Technologies; 독일 뵈블링겐HLMP-CE34-Y1CDD
LED 400nm아바고 테크놀로지스; Boeblingen, 독일UV5TZ-400-15
플렉시 유리 튜브 15mmMaertin; 독일 프라이부르크76999
플렉시글라스 3mm메르틴; 독일 프라이부르크692230
플렉시글라스 2.5mmMaertin; 독일 프라이부르크692225
플렉시글라스 1.5mmMaertin; 프라이부르크, 독일692215
PVC 타일 5mmMaertin; 프라이부르크, 독일690020.005
PVC 타일 6mmMaertin; 프라이부르크, 독일690020.006
PVC 블록 50mmMaertin; 프라이부르크, 독일690020.050
RPMIInvitrogen, Life Technologies; 다름슈타트, 독일61870-010
2-메르캅토에탄올EMD; 독일805740
FCSPAN 생명공학; Aidenbach, GermanyP30-3302
페니실린/스트르프토마이신(10,000 U/mL)Invitrogen, Life Technologies; 다름슈타트, 독일15140-122
Acrifix 플렉시글라스 접착제Evonic industries, Essen, Germany1R0192
Tangit PVC-U 접착제Henkel, Dü sseldorf, 독일

참고문헌

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  14. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  15. Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
  16. Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).

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