광학적으로 제어되는 물질은 신호 경로를 연구하는 강력한 도구입니다. 가능한 실험의 범위를 확장하기 위해 유세포 분석을 사용하여 광학 제어 물질을 실시간으로 연구할 수 있는 장치인 LED Thermo Flow를 개발했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
광유전학 도구를 사용하면 복잡한 신호 경로 내에서 거의 모든 신호 분자에 대한 고립된 기능적 조사를 수행할 수 있습니다. 주요 장애물은 세포 샘플에 대한 빛의 제어된 전달이므로 광유전학 연구에 가장 널리 사용되는 도구는 현미경 기반 세포 분석 및 체외 실험입니다. 유세포 분석기는 단일 세포 분해능에서 수천 개의 세포를 신속하게 측정할 수 있는 기능을 포함하여 현미경에 비해 주요 장점이 있습니다. 그러나 아직 광유전학에서는 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 광유전학과 유세포 분석의 힘을 결합한 장치인 LED Thermo Flow를 소개합니다. 이 장치는 유세포 분석 측정 중에 특정 파장, 광도 및 온도에서 세포를 비춥니다. 저렴한 비용으로 구축할 수 있으며 가장 일반적인 유세포 분석기와 함께 사용할 수 있습니다. 그 유용성을 입증하기 위해 우리는 생체 내에서 실시간으로 Dronpa 단백질의 광스위칭 역학을 특성화했습니다. 이 프로토콜은 거의 모든 광학 제어 물질에 적용할 수 있으며 가능한 실험 세트를 크게 확장할 수 있습니다. 더 중요한 것은 새로운 광유전학 도구의 발견 및 개발을 크게 단순화할 것이라는 것입니다.
서론
그들은 1-4 경로 신호의 배선를 해독하는데 사용할 수 있기 때문에 Optogenetic 도구 부분에서 인기를 얻어왔다. 이들은 광이 조명 될 때 그 형태 및 결합 친화도를 변경하는 광활성 단백질의 능력에 기초한다. 신호 요소에이 단백질을 융합하는 복잡한 세포 내 신호 전달 경로 5-12 내에서 단일 플레이어의 특정 규제 수 있습니다. 결과적으로, 신호 전달은 높은 공간적 해상도를 연구 할 수있다.
대부분의 셀 기반 optogenetic 연구 생화학 분석 11,12 뒤에 빛의 존재하에 배양 결합 현미경 기반 방법을 사용한다. 대조적으로, 플로우 사이토 모세관 따라 세포 단수형 셀 크기, 입도 및 형광 강도를 측정한다. 이 방법은 thousan 분석 할 수있는 기능을 포함하여 현미경 또는 생화학 적 방법에 비해 큰 장점을 가지고 있습니다매우 짧은 시간에 단일 셀 해상도에서 살아있는 세포의 DS. 그러므로, 유동 세포 계측법에 optogenetics을 결합하는 것이 바람직하다.
우리의 지식에, optogenetic 유동 세포 계측법에 대한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 광범위하게 허용 절차는 수동 플래쉬 장치 반응....
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프로토콜
1. 디자인 및 장치 구축
- 파일럿 실험
참고 : 특정 optogenetic 도구 및 세포 유형에 필요한 빛의 강도는 상당히 다를 수 있습니다. 프로토 타입 파일럿 실험에 필요한 최소 광량을 측정하는 데 유용하다. 이하의 실험에 사용되는 툴은 optogenetic Dronpa - 링커 Dronpa 융합 작 제물이다. Dronpa 순서는 상업적으로 (자료 목록을 참조)를 얻었다. 긴 링커 발현 구조는 분자 (및 분자간) 이량 체를 형성 할 수 있도록 두 Dronpa 서열 사이에 클로닝 하였다. 이하의 단계는 많은 다른 optogenetic 도구 나 광 제어 물질로 구성 될 수있다.- 포장 세포에서 레트로 바이러스 함유 뜨는을 사용하여 전달하기위한 제조업체의 지침을 따르는 Dronpa-링커 Dronpa 포함하는 구조로 라모스 B 림프구를 형질 도입. 사전에 따라 수확 및 카운트 세포viously 프로토콜 13을 발표했다.
- 의 농도로 재현 탁 된 세포를 1 × 106 매질 / ㎖ (1640 RPMI, 10 %의 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) 및 유....
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결과
플로우 사이토와 LED 열 흐름을 사용하여
장치의 기능은 코어 등이 내측 가리키는 원형 방식으로 배열 된 LED 된 원통형 챔버이다. 이 챔버는 LED의 온도뿐만 아니라, 세포 샘플을 제어 가능하게하는 급수 펌프에 연결될 수있다. LED는 변압기에 연결되어 있으며, 따라서 각각의 파장에 대한 광 세기가 개별적으로 제어 될 수있다. 장치의 중심은 가장 표준적인 유동 세포 계측기에 접속 될 수있는 표준 크기 FACS 튜브 수용한다 (도 4 및도 5). 세포의 바람직하지 않은 가열로 이어질하지 않는 우리의 장치에 그 조명을 표시하려면, 우리는 세 가지 다른 파장에 대해 시간에 조명 PBS의 온도 (그림 6)를 측정 하였다. 360 나노 미터, 400 나노 미터 또는 500 나노 .......
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토론
LED가 열 흐름은 흐름 세포 계수기에 optogenetic 도구를 연구하는 혁신적인 장치입니다.
지금까지 optogenetic 샘플은 현미경 레이저 또는 플래시 장치 (11, 12)으로 조사되었다. 샘플을 플래쉬의 각 거리에 따라 조도의 양의 상당한 변화는 실험간에 예상된다. 또한, 한 사람이 실험에서 동작 할 수 손전등의 개수에는 제한이있다. 이 실험 레퍼토리와 재현성을 제한합니다. 이러한 제한은 살아있는 세포에서 실시간 photoswitching 동력학을 특성화하는데 사용될 수있는 우리의 장치의 개발 동안 해결 하였다. 우리의 지식에 더 유사한 장치가 없습니다.
현재 구성에서 최대 30 개의 LED는 하나의 열 유량 용기에 내장 될 수있다. 따라서, 각각의 파장에 필요한 빛의 강도에 따라, 하나의 장치는 우리가 될 수 있습니다optogenetic 도구의 광범위한 에드. 설정된 photoswitchin.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
장치를 제작해 준 프라이부르크 대학의 J. Schmidt에게 감사드립니다. 이 원고에 대한 지원과 비판적 읽기에 대해 P. Nielsen과 D. Medgyesi에게 감사드립니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft를 통한 SFB746과 독일 연구 재단의 Excellence Initiative(GSC-4, Spemann 대학원)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 유리 FACS 튜브 | Thermo Fisher Scientific; Waltham, 미국 | 14-961-26 | 붕규산 유리관 12x75 mm |
| 유세포 분석기 | BD Bioscienceg; 독일 하이델베르크 | 포르테사 II | 특별 주문 |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; 미국 케임브리지 | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505nm | Avago Technologies; 독일 뵈블링겐 | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400nm | 아바고 테크놀로지스; Boeblingen, 독일 | UV5TZ-400-15 | |
| 플렉시 유리 튜브 15mm | Maertin; 독일 프라이부르크 | 76999 | |
| 플렉시글라스 3mm | 메르틴; 독일 프라이부르크 | 692230 | |
| 플렉시글라스 2.5mm | Maertin; 독일 프라이부르크 | 692225 | |
| 플렉시글라스 1.5mm | Maertin; 프라이부르크, 독일 | 692215 | |
| PVC 타일 5mm | Maertin; 프라이부르크, 독일 | 690020.005 | |
| PVC 타일 6mm | Maertin; 프라이부르크, 독일 | 690020.006 | |
| PVC 블록 50mm | Maertin; 프라이부르크, 독일 | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; 다름슈타트, 독일 | 61870-010 | |
| 2-메르캅토에탄올 | EMD; 독일 | 805740 | |
| FCS | PAN 생명공학; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| 페니실린/스트르프토마이신(10,000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; 다름슈타트, 독일 | 15140-122 | |
| Acrifix 플렉시글라스 접착제 | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U 접착제 | Henkel, Dü sseldorf, 독일 |
참고문헌
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Wein....
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재인쇄 및 허가
