방법 논문

마우스입니다 관류 신장 기법

DOI:

10.3791/54712

⸱

2016년 11월 17일

 ,  , 
1Institute of Anatomy, Swiss National Centre of Competence in Research Kidney, University of Zürich, 2Department of Physiology, University of Regensburg

이 논문에서

요약

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마우스 절연 신장 관류 (MIPK)를 관류하고 1 시간 동안 기능성 생체 조건 마우스 신장을 유지하기위한 기술이다. 버퍼 수술 기법은 상세하게 설명된다.

초록

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마우스 절연 신장 관류 (MIPK)를 관류하고 1 시간 동안 기능성 생체 조건 마우스 신장을 유지하기위한 기술이다. 이 분리 된 기관 및 관류 신장 생명 공학에 대한 탈세 포화 또는 항 거부 또는 소수 신장에 고용량의 게놈 편집 약물의 투여를 포함한 미래에 가능할 수있다 많은 혁신적인 애플리케이션에 대한 생리 연구를위한 전제 조건입니다 이식. 재관류 시간 동안 신장은 신장 기능이 평가 될 수 있고, 조작, 및 다양한 제약으로 투여 될 수있다. 절차 후 신장 이식 될 수있다 또는 분자 생물학, 생화학 분석, 또는 현미경에 대한 처리.

본 논문은 관류 및 마우스 신장의 생체 외 관류에 필요한 수술 기법에 대해 설명합니다. 관류 장치의 상세에 주어진 데이터는 V를 도시 제시신장의 제조 iability : 형태소 판독 및 분자 판독 상이한 네프론 세그먼트 수송 단백질의 웨스턴 블랏 상이한 네프론 세그먼트 기능, 투과 전자 현미경과 같은 신장 혈류, 혈관 저항 및 소변 데이터.

서론

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기관의 고립 된 관류는 수십 년 1 생리 학자들 사이에서 지속적인 노력의 대상이되고있다. 기술은 혈압, 호르몬 또는 신경 조직 등의 영향없이, 기관의 기능을 가능하게 검토한다. 칼 에두아르 Loebell는 1849 2, 고립 된 신장의 성공적인 재관류을 설명했습니다 첫 번째로 간주됩니다. 그 이후로, 관류 장치에 상당한 정련을 실시하고있다. 프레이와 그루버는 지속적인 관류 2 산소와 타악기 펌프 용 인공 폐를 소개했다. 초기 연구는 주로 큰 포유 동물 - 즉, 돼지 2 개 3 쥐 신장의 사용 - 첫번째 보고서, 와이즈 등으로의 신장을 공부하는 동안. , 작은 포유 동물 기관 관류 (4)의 연구에서 획기적인 사건이었다. Schurek 등. 충분한 신 세뇨관 경우 관류에 포유류의 적혈구를 추가의 필요성을보고산소는 5를 달성 할 수 있었다. 장기간 실험 긴급 동일한 연구 그룹 (6)에 의해 버퍼의 연속 투석의 도입이었다. 2003 년 SCHWEDA 등. 나중에 Rahgozar 등에 의해 정제 기능 마우스 고립 관류 신장 (MIPK) 7을보고 처음이었다. 18 Lindell 등의 알. 14.

절연 신장 관류 래트보다 ​​기술적으로 어려운 반면, MIPK의 사용은 유전자 변형 마우스의 다양한 배열의 사용을 가능하게하는 장점을 맺는다. 이 논문은 1 시간 동안 고립 된 마우스 신장 관류에 대한 저자의 방법의 세부 사항을 제공합니다. 상기 방법은 신장 유량 혈관 저항 호르몬 방출 혈액 가스 분석, 소변 분석, 약물의 애플리케이션의 지속적인 평가를 허용한다. 절차에 따라, 신장은, 분자 및 생화학 분석을 위해 처리 할 수있는 현미경에 대한 고정, 또는받는 사람 마우스에 이식 (그림 1).

figure-introduction-1
그림 1 : 절연 관류 신장에 가능한 입 / 출력의 개요. BGA : 혈액 가스 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

많은 혁신적인 응용 프로그램 (또는 항 거부 또는 게놈 편집 약물의 응용 프로그램없이) 8, 9, 이전 이식에 장기간 정상 체온 신장 관류의 새벽 논의되는 바와 같이이 기술은 가능성, 10, 향후 몇 년에 걸쳐 관심을 증가 받게됩니다 11, decellularized 발판 (12)의 전체 신장의 생명 공학 및 광자 이미징 13 형광 염료의 고용량의 적용 (14) 중 특정 유전자의 역할을 연구와 이상적인 모델이다.

단계별 프로토콜은 다른 실험실에서 성공적으로 격리 된 마우스 신장 재관류를 수행 할 수 있도록 설명한다. 첫째, 조성물 및 완충액의 제조 지정된다. 그리고, 수술 상세히 설명되며 중요한 단계가 도시되어있다. 셋째, 데이터가 성공적으로 제조 나타내는 것을 제시되어 신장 혈류, 혈관 저항, 사구체 여과율 및 분수 전해질 배설 모두 관류 신장 다른 네프론 세그먼트 형태의 생존 및 투과형 전자 현미경의 기능적 측정 관류의 1 시간 후 고정.

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프로토콜

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이 논문에 기술 된 동물과 관련된 모든 절차는 스위스 법률에 따라 취리히, 스위스의 캔톤의 동물 관리의 승인을 실시 하였다.

1. 버퍼 준비

  1. (4)과 항 이뇨 호르몬 (ADH) 용액 (표 1) - 솔루션 (1)을 준비합니다.
  2. 투석 완충액 (표 1)을 준비한다.
    주 : 이것은 재관류 동안 투석 버퍼로서 사용되는 버퍼이다. 나중에, 적혈구 최종 관류 액을 형성하는 버퍼에 희석한다.
  3. 적혈구 준비.
    1. 인간의 적혈구 농축액 투석 버퍼 500 ml의 (지역 혈액 은행에서 얻은 시험 물질) 250 ml에 희석. 8 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 어떤 적혈구를 제거하지 않도록주의, 버퍼를 제거합니다. 배를 반복합니다.
  4. 완충액, 알부민 (BSA 소 혈청 알부민)를 준비한다.
    1. dialysi 200 ㎖에서의 버퍼는 교반 막대를 사용하여 BSA의 44g을 녹인다. 필터 종이와 솔루션을 필터링합니다.
  5. 관류를 준비합니다.
    1. BSA에 버퍼에 여과지를 통해 단계 1.3.1에서 적혈구를 필터링합니다. 투석 버퍼 800 ML의 총 부피까지 입력합니다.
      주 :이 최종 관류이다. 헤마토크릿 이제 8과 12 % 사이 여야합니다. 관류 12 시간까지 4 ℃에서 저장할 수 있습니다.

2. 시작 투석 및 산소화

  1. 더 큰 버퍼 저수지, 작은 버퍼 저장하고 촉촉한 챔버를 37 ° C로 (작은, 이중벽 챔버 나중에 신장을 유지하기 위해 37 ° C와 100 % 습도하게) 주변의 물을 욕조를 켜십시오 (그림 2) .
  2. 투석 버퍼로 큰 버퍼 저수지와 관류와 작은 저수지를 입력합니다.
  3. 투석 버퍼에 5 % CO에 2 / 95 % O 2 가스 유입을 돌립니다.
  4. 투석 버퍼에 대한 관류의 연속 투석 전환합니다. 저 유량 투석 튜브를 사용하도록주의하십시오. 3 단계로 진행합니다.

figure-protocol-1
그림 2 : 관류 회로의 개략도. 반응식은 관류 회로의 주요 구성 요소와 버퍼 흐름의 방향을 나타낸다. 진한 파란색에 둘러싸여 모든 구성 요소는 물 목욕 / 온도 37 ° C로 유지된다. 1 : 재관류 버퍼의 적어도 3 배의 용적의 투석 버퍼 연속 95 % O 2 / 5 % CO 2로 버블 링된다. 2 : 투석 완충액 관류 완충액 연속적 롤러 펌프에 의해 투석 튜브에서 서로에 대해 투석한다. 3 :이 투석, 관류 완충액 9 % O 풍부 인해 2 / 5 % CO 2 및 전해질 농도가 일정하게 유지된다 througho유타 관류. 4 : 롤러 펌프는 신장 방향으로 관류 완충액 추진. 5 : windkessel가 연동 파도를 제거하고 버블 트랩 역할을합니다. 6 : 압력 변환기 (자유롭게 교류의 흐름을 허용하면서 4 (롤러 펌프에 연결)은 지속적인 압력을 유지하기 위해). 7 : 관류 전반에 걸쳐, 신장은 100 % 공기 습도 및 37 ° C의 신장 온도 촉촉한 챔버에 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 수술 1 부 (모든 합자의도를 들어, 그림 3 참조)

참고 : 5-0 수술 스레드를 사용하여 모든 합자를 수행합니다.

  1. 복강 내 주사하여 마우스 (0.9 % 염화나트륨에 용해 체중, 20 ㎎ / ㎖ 케타민 및 1 ㎎ / ㎖의 자일 라진 10 μL / g)를 마취. anesth의 충분한 깊이를 확인후방 발 반사의 유무를 테스트하여 ESIA.
  2. 습한 챔버에서 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 수의사 연고와 눈을 보호합니다. 요추 혈관을 상승 척추 아래 1 ML의 주사기를 놓습니다.
  3. 가위로 먼저 흉골 개방 피부, 후 복부 근육에 음모 문장에서 중간 개복술을 수행합니다.
  4. 장을 제거하고 복부에서 마우스 측면의 왼쪽에 놓습니다.
  5. 결합 조직에서 방광을 확보하고 요관 및 요도 모두를 탐구한다.
  6. 왼쪽 요관 (합자 I)의 주위에 끈을 놓으십시오. 닫습니다.
  7. 요도 (합자 II) 주위에 끈을 놓으십시오. 닫습니다.
  8. 전체 방광 (합자 III)의 주위에 "올가미"합자를 놓습니다.
  9. 블래 1 mm의 절개.
  10. 2cm PE (50) 튜브와 개방을 Cannulate.
  11. 튜브 주위 닫기 합자 III.
  12. 합자에서 왼쪽 요관 및 요도의 말단을 잘라. BLAD데르는 이제 자유롭게 이동 오른쪽 요관에 연결되어 있습니다.
  13. 결합 조직과 지방의 복부 대동맥을 취소합니다.
  14. 복부 중간 대동맥 결찰 (합자 IV)를 놓습니다.
  15. 장간막 동맥과 복강 트렁크 (합자 V) 사이의 다이아 프램 아래의 대동맥 주위 합자를 놓습니다.
  16. 장간막 동맥 (합자 VI)의 주위에 끈을 놓으십시오.
  17. 직접 오른쪽 아래 왼쪽 신장 동맥 (합자 VII) 위의 대동맥 결찰를 놓습니다.
  18. 꼬리 정맥 패키지 (맥) (합자 VIII)의 주위에 끈을 놓으십시오. 4 단계로 진행합니다.

figure-protocol-2
그림 3 : 수술 중에 배치 된 합자의 개략도. 개복술 후 오픈 복부보기. 소장은 왼쪽 밖으로 이동합니다. L 및 R이 좌측 및 우측 신장을 나타낸다. 그만큼검은 색 선은 각각의 봉합사의 면적을 나타낸다. 합자이 먼저 배치하고 텍스트에 주어진 순서에 폐쇄된다. X는 동맥 삽관에 대한 절개의 위치를 표시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

관류 회로 4. 프라이밍

  1. 로터리 펌프를 시작하고 관류와 튜브를 입력합니다. 그것에서 모든 공기 방울을 비우주의하십시오.
  2. 관류 대략 중간 수준에 windkessel 장치를 채 웁니다.
  3. 모든 튜브가 작성 흐름이 시간 동안 신장 수준에서 관류 바늘을 유지하다 0 0 mmHg로에 압력 변환기 보정.
  4. 일정한 최소 수준 (0.6 ml / 분)에서 흐름을 유지하고 5 단계로 진행합니다.

5. 수술 2 부

  1. 합자 IV와 왼쪽 레나의 분기 사이에 클램프를 놓습니다리터 동맥.
  2. 지느러미 벽을 절단하지 않도록주의하면서 합자 IV의 대동맥 꼬리에 작은 절개를합니다.
  3. 용기와 확장기 대동맥의 팽창 개구.
  4. 바늘로 대동맥을 Cannulate 단지 클램프로 끝을 밀어 (2cm 길이, PE 50 당겨).
  5. 클램프를 엽니 다.
  6. 이 오른쪽 신장 동맥 및 대동맥의 교차점에 도달 할 때까지 바늘 두개쪽으로의 끝을 밀어 넣습니다.
  7. 닫기 합자 VII.
  8. 닫기 합자 IV.
  9. 다이어프램을 해부하여 가위로 가슴을 엽니 다. 하나의 컷으로, 대동맥, 대정맥, 마음과 식물 신경을 분리합니다. 이 단계로, 동물 연속 깊은 마취 빠른 방혈로 희생된다.
  10. 관류 펌프의 압력 제어를 시작합니다. 80 ~ 100 mmHg의 사이의 평균 압력을 유지한다.
  11. 닫기 합자 V.
  12. 닫기 합자 VI.
  13. 닫기 합자 VIII.
  14. 결합 tissu 무료 오른쪽 신장전자와 가위로 지방 캡슐로의 삽입.
  15. V.를 합자하는 근위 대동맥을 잘라
  16. VI를 합자하기 위해 원심 장간막 동맥을 잘라.
  17. 혈관 자체로 절단하지 않도록주의하면서 신장지지 용기 번들을 잘라.
  18. 신장에 대한 연결에 간을 잘라. 신장을 확보하는데주의를 기울여야하지만, 대정맥이 그것에 의해 개방 유지되도록, 그것에 간 접착의 작은 부분을 둡니다.
  19. 마우스에서 신장 번들을 가져 가라. 습한 챔버에서 마우스를 제거합니다.
  20. 간 및 신장 (합자 IX)의 연결 주위에 "올가미"합자를 놓습니다.
  21. 정맥 라인 (2cm의 PE 50)와 대정 맥을 Cannulate.
  22. 닫기 합자 IX. 정맥 라인을 통해 정맥 유출을 즉시 시작해야합니다.
  23. 촉촉한 챔버를 닫습니다.

6. 다운 스트림 분석

  1. 다음 시간 동안 연속적으로 혈류 intravascul 모니터링아칸소 압력 15. 예를 들면 분석을 위해 사용할 수있는 정맥 유출, 신장 레닌 방출 7 수집. 전해질 농도와 사구체 여과율 (14)의 분석을 위해 소변을 수집합니다. 관류 1 시간 후, 신장 서부 블로 팅에 대한 스냅인을 동결 할 수 있습니다 또는 이미지에 대한 고정 (16)에 접근한다.

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결과

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방법 설명과 함께, 고립 된 마우스 신장은 적어도 1 시간 동안 가능한 남아있을 수 있습니다. 우리는 기능 (신장 혈류 및 혈관 저항 정맥 유출 사구체 여과율 비뇨기 분수 나 + 및 K + 배설 혈액 가스 분석, 소변 삼투압) 및 형태학 (투과형 전자 연속 재관류 1 시간 후 조직 생존력을 시험 야생형 C57BL / 6 마우스의 네 신장 현미경, TEM) 방법. 또한 다른 세관 세그먼트 정점 마커 단백질의 웨스턴 블랏은 동일한 동물 unperfused 신장 관류 절연 신장을 비교 하였다. 모든 실험에서, 정압 관류 ~ 100 mmHg로 (도 4) 관류 압력을 유지 하였다. 이러한 신장, 관류 흐름 및 혈관 저항 신장 중량 3 15.6 ± 0.4 ㎖ / 분 * g에서 55 분의 시간 동안 안정적으로 유지5 ± 1.0 mmHg로 * 분 / ㎖, 각각 (그림 4...

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토론

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관류 신장 절연 마우스 수많은 전신 요인의 영향에 의해 결함이 될 수있다 손상 동물 생체 실험 간의 격차를 1 시간 동안 제어 된 환경 생체 신장 기능을 연구하기위한 도구이고, 시험 관내 실험에서 격리 된 네프론 세그먼트 또는 반드시 기능에 손상 장기 구조의 영향을 무시 배양 된 세포. , 저자의 지식과 대안 기술이 특정 작업을이 수행하지 않는 것입니다. 신장 조직의 생화학 적 연구는, 그러나, 신장 조각 (17)을 이용하여보다 간단한 형태로 수행 될 수있다. 제시된 기술은 현재 신장 생리학을 연구하기 위해 주로 사용되는 동안, 많은 새로운 응용 프로그램이 논의되고있다. 예를 들면, 관류 탈세 포화 및 recellularization 12시 신장 생명 공학에 사용될 수 있습니다. 또한, 이전에 신장의 장기간 정상 체온 관류는 그럴 필요합니다ansplantation, 안티 거부 또는 게놈 편집 관류에 약물이 연구되고있다 고용량의 관리와; 심지...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없으며 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 귀중한 과학적 조언을 해준 한스-요아힘 슈렉(Hans-Joachim Schurek)에게 감사를 표한다. 저자들은 훌륭한 기술 지원을 해준 Monique Carrel과 Michèle Heidemeyer, 원고를 비판적으로 읽어준 David Penton Ribas와 Nourdine Faresse, NaPi-2a 항체를 제공한 Carsten Wagner와 Jürg Biber에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 스위스 국립 연구 역량 센터(Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH")와 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation)의 프로젝트 보조금(310030_143929/1)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2901
바구니와 사이드 포트가 있는 캐뉼러Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2947
Thermostat TC120-ST5 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-4544
ISM 827/230V 롤러 펌프 Reglo 아날로그Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-0114
버퍼 용액용 저류층 재킷 1 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3438
완충 용액용 저류층 재킷 0.5 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3436
압력 트랜스듀서 APT300 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3862
TAM-D Plugsys 변환기Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-1793
SCP Plugsys 서보 컨트롤러Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2806
Windkessel Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3717
HSE-USB 데이터 수집Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3330
저플럭스 투석기 Diacap PolysulfoneB.Braun 7203525
대동맥 캐뉼레이션용 PE 튜빙 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D.과학 상품 Inc.BB31695-PE/8
NameCompany카탈로그 번호Comments
>완충 시약:
Aminoplasmal 10%B.Braun134518064
피루브산 나트륨시그마 AldrichP2256-25G
L-글루탐산 일나트륨염 수화물시그마-알드리치G1626-100G
L-(-)-말릭애씨드 나트륨염시그마-알드리치M1125-25G
나트륨-L-젖산염시그마-알드리치L7022-10G
알파-케토글루타르산 나트륨염시그마-알드리치K1875-25G
NaCl시그마-알드리치31434-1KG-R
NaHCO3시그마-알드리치S5761-5KG
KCl시그마-알드리치60130-1KG
요소시그마-알드리치U5378-500G
크레아티닌시그마-알드리치C4255-10G
암피실린로슈10835242001
MgCl2 * 6H2O시그마-알드리치M2393-500G
D-글루코스시그마-알드리치G8270-1KG
CaCl2 * 6H2O 리델 드 하(Riedel-de-Haë); n12074
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-500G
Na2HPO4Sigma-AldrichS0876-500G
항이뇨 호르몬 dDAVPSigma-AldrichV2013-1MG
FITC-이눌린시그마-Aldrich
필터 적혈구 여과에 사용Macherey-NagelMN 615
BGA 분석 :
ABL 80 플렉스복사계 의료 ApS
전자 현미경 :
Philips CM100 TEMFEI

참고문헌

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