방법 논문

셀 모양 변경 허가 및 세포 운동에서의 영상 초파리 낭배 사용 DE-cadherin의 기자 형질 전환의 파리

DOI:

10.3791/54764

⸱

2016년 12월 29일

 ,  ,  ,  , 
1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 초파리 위장 형성의 실시간 이미지를 캡처하는 절차를 설명합니다. 이를 통해 초기 발달과 관련된 정점 수축을 더 잘 이해하고 조직 구조 변형 중 세포 움직임을 제어하는 메커니즘을 더 자세히 분석할 수 있었습니다.

초록

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낭 배기는 초파리와 같은 다세포 동물의 배아 개발하는 동안 발생하는 형태 학적으로 동적 이벤트의 첫 번째 집합입니다. 이 형태 학적 변화는 중간 엽 전이 (EMT)로 상피로 인식되고 있습니다. EMT의 조절 곤란이 섬유화와 암 전이와 관련된다. EMT 분자 메커니즘들에 의해 제어된다 신흥 증거가있다. 혀끝의 수축을 제어 등, 많은 주요 유전자도 알려진 바와 같이 암 전이에서 관찰 된 EMT 중요한 요소가 될 수 있습니다. 초파리 낭배 동안 EMT와 마찬가지로, 상피 세포는 그 모양을 변경하도록 유도 될 수 있으며, 다양한 세포 유형으로 세포의 운명을 리디렉션 재 프로그램 될 수있다. 여기에서 우리는 배아 발달의이 단계에서 형태 형성 세포 이동 및 세포 운명 식별의 개시를 분석하기 위해 초파리 낭 배기의 강력한 이미징 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 C를 식별엘의 낭배시의 재 배열 및 GFP를 이용 낭배 동안 정점 수축의 중요성을 입증은 DE-cadherin의 표지.

서론

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낭 배기는 초파리 1, 2 등의 다세포 동물의 배아 개발하는 동안 발생하는 형태 학적으로 동적 이벤트의 첫 번째 집합입니다. 흥미롭게도, 증거 신흥 것은이 과정이 기계 및 분자 메커니즘 (3) 사이의 상호 작용을 통해 조절되는 것이 좋습니다. 또한, 낭 배기에 중요한 과정입니다 중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 또한 암 전이 4-8로 인간의 질병 과정에 연루되어있다. 혀끝의 수축을 제어 등, 많은 유전자가 또한 알려진 바와 같이 암 전이 9에서 관찰 된 EMT의 핵심 요소가 될 수 있습니다. 따라서, 낭배시의 정점 수축은 전술 한 조절 메커니즘을 조사하는 암 전이에 대한 이해를 향상시키는 우수한 모델이다. 이 기술의 이점은 우리는 따라서 실시간에서 낭배시 세포의 움직임을 관찰 할 수 있다는 우리 것암 전이뿐만 아니라 낭 배기에 관여하는 유전자를 선별 할 수.

비교적 알려지지 않지만, 세포 간 접착 정점 수축 1에서 중심 역할을하는 것으로 생각된다. 초파리 유전학은 잘 규제 분자 메커니즘을 탐구 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 이 모델은 낭배 동안 혀끝의 수축의 중요성을 발견 할 수있게됩니다. 또한,이 방법은 암의 전이에 관여하는 유전자를 선별 할 수있다. 초파리의 낭배의 캡처 라이브 이미지는 더욱 더 상세하게 조직의 재 배열을 관리하는 분자 메커니즘을 이해 할 수있게했다. 여기서, 우리는이를 달성하기 위해 간단한 방법의 포괄적 인 설명을 제공한다.

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프로토콜

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참고 : DE-CAD :: GFP 10 : 본 연구에 사용 된 형질 전환 초파리는 다음과 같습니다.

애플 플레이트 1. 준비

  1. 마이크로파 12.5 g 한천, 125 mL의 100 % 시판 사과 주스, 12.5 g의 글루코스, 및 375 mL의 H 2 O 열 혼합물의 혼합물을 제조하고, 3cm 세포 배양 접시에 부어. 나중에 사용하기 위해 4 ° C에서 혼합물을 저장합니다.
  2. 사과 플레이트를 제조 한 후, 파리가 알을 배치 할 수 있도록 그 위에 반죽 효모 붙여 넣기의 얇은 층을 추가합니다.

2. 배아 준비 및 라이브 영상 프로토콜

  1. 짝이어서 반죽 효모에 덮여 사과 접시에 하룻밤 알을 낳기 위해 병에 약 50 파리 (25 명의 남성과 25 명의 여성)을 놓습니다. 병의 입에 사과 주스 플레이트를 설정합니다. 거꾸로 인큐베이터에서 병을 유지합니다. 제 프롬프트 알루미늄 호일 플라스틱 초파리 재고 병 포장전자는 더 많은 알을 낳기 위해 날아갑니다.
  2. 다음날 아침, 새와 오래된 사과 주스 플레이트를 교체합니다.
  3. 파리 알루미늄 호일로 병을 포장하여 3 ~ 4 시간 동안 알을 낳기 수 있습니다.
  4. 세 4 시간 후, 브러시 또는면 나쁜를 사용하여 사과 주스 플레이트에서 배아 체에서 배아를 수집하고 PBS로 씻는다. 12 웰 배양 접시에 배아를 PBS로 2 ~ 3 회 이상 세척 할 것.
  5. 12 웰 배양 접시에 5 분 동안 50 % 표백제와 배아를 Dechorionate.
  6. dechorionation 과정에 따라, PBS와 배아를 2 ~ 3 번 더 씻는다.
  7. PBS 선택 단계 그들의 경계에서의 투명도 수준에 기초하여 현미경 5 배아 함유 3cm 세포 배양 접시에 배아를 옮긴다. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 준비된 배아 피펫.
  8. 다음으로, 유리 커버 슬립에 선택한 두 배아를 배치하고 가늘게 꼰 티슈로 여분의 PBS를 제거합니다. 최대의 배아에게 지느러미 쪽의 방향미세 트위스트 티슈 페이퍼를 이용하여 커버 슬립. 그 후, 미세 바늘과 트위스트 티슈 페이퍼를 사용하여 실리콘 그리스와 유리 커버 슬립에 배아를 연결합니다.
  9. 슬라이드의 하단에 공간을두고, 배아에 할로 카본 오일 (700)의 작은 방울을 추가하고 거꾸로 들여 쓰기 슬라이드에서 배아를 포함 coverslip에 배치합니다.
  10. 공 초점 영상 시스템 아르곤 / 488 레이저 및 오일 액침 대물 (63X)를 이용하여 태아를 조사한다.
    주 : 해당 발달 단계에서 배아를 식별은 낭 배기 이벤트의 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. 이러한 조건에서, 거의 모든 배아는 배아 분석 성인 개발 배양 될 수있는 적어도 14 단계까지 정상적으로 발전 관찰한다.

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결과

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여기서, 우리는 초파리 배아의 낭배 이벤트 및 배아 준비 절차에 대한 일반적인 개요 (도 1)를 나타낸다. 세포막 DE 헤린 : GFP 및 세포 이동의 라이브 영상은 초파리 낭배시에 수행된다 (도 2)를 이용하여 라벨링된다. DE-cadherin의의 GFP 파리는 우리가 세포 부착 접합을 시각화 할 수 있기 때문에, 우리는 혀끝의 세포 모양이 시스템을 사용하여 움직임을 추적 할 수 있습니다. 더 중요한 것은,이 시스템은 우리가 내생 DE-cadherin의 발현 패턴을 추적 할 수 있습니다.

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그림 1 : 배아 준비 절차의 일반 개요.

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토론

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이전에 Drosophilla1에서 위장 형성 과정의 라이브 이미지를 캡처하는 유사한 절차를 보고했지만, 여기에 설명하는 방법은 상세하고 내인성 카드헤린 발현을 추적하기 쉽기 때문에 위장 형성과 관련된 주요 요인의 유전자 스크리닝에 매우 유용합니다. 이 이미징 절차의 성공을 극대화하려면 들여쓰기 슬라이드를 사용하는 것이 필수적입니다. 기계적 압력은 때때로 배아 사멸을 유발합니다. 따라서 기계적 스트레스가 배아 위장 형성 과정을 방해할 수 있으므로 배아를 가능한 한 부드럽게 다루는 것도 중요합니다. 배아 고정 중에 적절한 양의 그리스를 사용하면 라이브 이미징 절차의 결과가 더욱 향상됩니다.

배아의 탈융모와 선택이 모두 신속하게 수행되도록 하는 것이 이 프로토콜로 성공하는 핵심 요소입니다. 완전히 건조되기 전에 가는 바늘을 사용하여 배아를 붙이는 것도 이 절차의 결과를 극대화하는 데 중요합니다. 배아를 고정한 후 DE-cadherin으로 표지된 G...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders(HT), Takeda Science Foundation(HT) 및 사립 대학 전략 연구 재단(HT)을 위한 MEXT 지원 프로그램의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Halocarbon oil 700SigmaMKBH 5726
진공 그리스 실리콘Beckman 335148
유리 커버슬립 Matsunami 유리두께 No124-36 mm
배아 stariner코닝Corning3477
플라스틱 Drosophilla 재고 병HitecMKC-100
DE-Cadherin 넉 인 플라이REF (10)

참고문헌

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  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
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재인쇄 및 허가

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태그

GFP

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