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방법 논문

경색 지역의 중간 동맥 폐색 기술 및 시각화를 사용하여 마우스의 허혈성 뇌졸중 및 허혈 - 재관류 유도

16.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54805

⸱

2017년 2월 2일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Miller School of Medicine, University of Miami, 3Jerzy Kukuczka Academy of Physical Education

이 논문에서

요약

우리는 실리콘으로 코팅된 봉합사를 사용하여 중대뇌동맥의 폐색에 의해 유도된 뇌졸중의 마우스 모델을 설명합니다. 이 프로토콜은 영구적인 폐색 또는 일시적인 허혈을 유도한 후 재관류

를 유도하는 데 적용할 수 있습니다.

초록

뇌혈관 질환은 전 세계적으로 널리 퍼져 있으며 뇌졸중을 포함한 여러 유형의 질환을 포함합니다. 조직 손상에 대한 뇌졸중의 영향을 연구하고 치료 개입의 효과를 평가하기 위해 다양한 종에 대한 여러 실험 모델이 개발되었습니다. 여기에는 완전 전역 뇌허혈, 불완전 전체 허혈, 국소 뇌 허혈 및 다초점 대뇌 허혈이 포함됩니다. 이 프로토콜에 설명된 모델은 중대뇌동맥 폐색(MCAO)을 기반으로 하며 국소 허혈 범주와 관련이 있습니다. 이 기술은 엄격하게 정의된 반구 영역에서 일관된 국소 허혈을 일으키며 다른 방법보다 덜 침습적입니다. 설명된 절차는 여러 유전적 변이의 가용성과 행동 및 신경 결핍 평가를 돕기 위해 마우스에 대해 표준화된 많은 수의 테스트를 고려하여 마우스에서 수행됩니다.

서론

심혈관 질환의 연구, 뇌졸중과 같은 생체 내 모델의 사용에 의존한다. 허혈, 약물의 독성 및 / 또는 치료 가능한 의미를 이해하기 위해, 처리 군 사이의 비교 연구를 가능하게하는 질환의 적합한 표준화 된 신뢰성 및 재현성이 모델을 사용할 필요가있다. 이 논문에서는, 트랜스 제닉 마우스 표준화 평가 모델의 다수의 가용성 주어진 쥐를 사용한다. 실험 허혈성 뇌졸중과 같은 복구 다음 모터와 행동 적자를 평가하는 점수를 긁어하면, 2 1 개발되었다.

여러 허혈성 뇌졸중 모델은 전체 글로벌 대뇌 허혈, 불완전 글로벌 허혈, 다 초점 대뇌 허혈 및 국소 뇌허혈로 사용할 수 있습니다. 후자의 그룹은 또한 환자의 가장 일반적인 뇌졸중의 범주입니다. 이브의 대부분국세청은 또는 중간 대뇌 동맥 (MCA) 가까이에서 색전이나 혈전 성 폐색의 형성에 의해 시작됩니다. 이러한 매개 변수를 감안할 때, 밀접하게 제시된 모델은 인간의 뇌졸중 질환의 원인을 모방하고 관련성이 높은 3 얻어진 결과를 만든다. 그럼에도 불구하고, 인간의 질병 치료에 동물 모델에서 발견의 번역은 어려운 것으로 입증되었습니다. 지금까지 혈전 조직 플라스 미노 겐 활성제의 사용은 급성 허혈성 뇌졸중 (4)의 치료를 위해 승인되었다.

쥐에서 국소 뇌허혈 후방 대뇌 순환 뇌졸중 모델 및 대뇌 정맥 혈전증 모델의 모델마다 적용 가능성을 감소 및 분석을 수행 할 수의 범위를 제한하는 매우 침습적이다. 그러나, 예 색전증 모델 photothrombosis 모델 엔도 텔린 -1 유발 뇌졸중 모델 및 관내 봉합 중간 대뇌 동맥 폐쇄 (M 다른 기법CAO) 모델은 이러한 제한없이 사용할 수 있습니다. MCAO 모델이 프로토콜에 기재된 기술이다. 이것은 재관류 용이하고 높은 처리량 방법으로 수행 될 수있다 국소 뇌허혈을 유발하는 신뢰할 수있는 방법을 제공한다. 이 모델, 즉, ZEA - 롱가와 고이즈미 방법에 두 가지가 있습니다. 그들은 폐쇄 봉합이 혈관에 삽입하는 방식에 약간의 차이가 있습니다. ZEA-롱가 기술에서, 봉합 외부 경동맥 (5)을 통하여 삽입된다. 여기에 제시된 기술은 흡장 봉합사가 경동맥 (6)를 통해 삽입되는 고이즈미 방법에서 수정된다.

MCAO 모델이 성공적으로 허혈성 뇌졸중 동안 발생하는 다양한 이벤트를 평가하기 위해 적용되었다. 재관류 후, 뇌 부종은 혈액 - 뇌 장벽의 고장에 따라 관찰 될 수있다. 피크 신경 사망은 보통 24 시간에서 관찰되고; 그러나, 다시칠일 7 후 기준선 수준으로 변합니다. 인간에서, 성별과 연령이 스트로크의 결과를 결정할 때, 이것은 또한 마우스 및 래트도 8,도 9,도 10에서 관찰되는 중요한 변수이다. 몇몇 간행물은 처리 효율 11, 12, 13, 14을 설명하기 MCAO 모델을 사용했다.

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프로토콜

모든 절차는 건강 (NIH) 지침의 국립 연구소에 따라 마이애미 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인되었다. 멸균 장비 및 무균 기술의 사용이 필요합니다.

1. 폐색 봉합 준비

  1. 25g과 25 사이의 마우스에 대한 0.23 mm - - 체중 35g (20) 사이의 마우스에 대해 0.21 mm 직경의 봉합사를 사용합니다. MCAO 절차에 대한 봉합사의 종류의 선택은 동물의 체중에 따라 다르다.
  2. 실버 펜을 사용하여 실리콘 코팅 된 선단부터 9mm의 봉합사를 표시한다. 이 삽입 길이에 대한 지침을 제공합니다.

수술 2. 준비

  1. 실험실 마취 시스템을 이용하여, 산소와 혼합하여 이소 플루 란 마취 마우스. 상업 시스템에 2에서 5와 산소의 흐름을 설정에서 이소 플루 란을 사용 (재료 표 참조). surger에 동물 이동Y면과 코 콘을 사용하여 마취를 유지 (1.5 설정을 사용 이소 플루 란 - 2 2.5과 산소의 흐름을).
    1. 초당 2 호흡을 헐떡없이 - 마우스 호흡 속도가 약 1이 있는지 확인합니다. 또한, 동물 수염 자극 반응과 페달 반사 (발가락 핀치)를 발생하지 않는 것을 확인합니다. , 수술 동안 적어도 매 5 분 호흡 속도와 노력을 모니터링합니다.
  2. 절차 동안 건조되는 것을 방지하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 각각의 눈에 대한 안과 용 윤활제 방울을 넣어. 또한, 멸균 제약 튜브에서 눈에 안과 연고를 적용합니다.
  3. 그 뒷면에있는 동물 플립과 절개의 영역을 면도. 그 후, 충분히 70 % 클로르헥시딘 다음 에탄올, 70 % 에탄올로 최종 면봉을 사용하여 수술 영역 소독. 실체 현미경 아래에서 따뜻한 수술 표면에 동물을 배치합니다.

3. 경동맥의 해부 및 내부 / External 분기

  1. (- 4cm 약 3) 수술 가위와 집게를 사용하여 턱 아래에 가슴 뼈 위에서, 목에 얕은 중간 선 절개를 수행합니다. 외과 용 드레이프 비 멸균 표면과 접촉하는 수단을 방지하기 위해 수술 주변에 배치한다. 수술 드레이프가 촬영을 돕기 위해 현재 비디오 생략되었다.
  2. 집게 신중 별도 지방 및 결합 조직을 사용하여 기관을 노출시킨다. 조직 쉽고 자연스럽게 양쪽으로 분리해야합니다.
  3. 상기 수술 영역을 노출 네크를 확장 쥐의 목 뒤쪽에 베개 (원형 물체 직경 약 0.5 cm)을 놓는다.
  4. 조직 트랙터 또는 후크를 사용하여 절개를 엽니 다.
  5. 기관의 동물의 왼쪽에서 조심스럽게 왼쪽 경동맥 (CCA)를 노출하는 결합 조직을 분리 tweeze. CCA를 함께 번들로 신경 및 주요 혈관 손상되지 않도록주의하십시오.
  6. 기본 조직에서 분리주의하면서 CCA 노출 계속 내부 대뇌 동맥 (ICA) 및 외부 대뇌 동맥 (ECA)의 분기 최고 "Y"를 노출합니다. CCA에서 분리 돕기 위해, 결합 조직을 관통하는 CCA에서 곡선 집게를 삽입하고 천천히 열 수 있습니다.

MCAO 봉합 삽입을위한 CCA 4. 준비

  1. CCA를 아래 길이가 약 4cm의 나일론 봉합사의 3 세그먼트를 삽입합니다. 이 크게 봉합의 삽입을 복잡하게하는 것처럼 CCA는 트위스트하지 있는지 확인하십시오.
  2. 가장 낮은 지점 수에서 영구 매듭을 사용하여 바닥 봉합을 닫습니다.
  3. 단지 ICA 아래 상단 봉합을 묶어 / ECA는 이동식 슬립 매듭을 사용하여 분기.
  4. 이동식 슬립 매듭을 사용하여 중간 봉합을 묶어하지만 활짝 열려 보관하십시오. 봉합 삽입을 방해하지으로는 충분한 공간을두고하는 것이 중요하다.
  5. 미세 절제 봄 공상을 사용하여ssors, 하단 및 중앙 봉합 사이 CCA에 절개를 수행합니다. 하단 봉합에 가까운 0.2 mm 절개를 수행합니다.

5. 중간 대뇌 동맥 폐색

  1. 집게를 사용하여 정상에 그것을 안내는 CCA 절개로 MCAO 봉합사를 삽입합니다. CCA를 개방 응고 및 폐쇄를 방지하기 위해 4.5 단계 후 신속하게이 단계를 수행합니다. 봉합 삽입이 차단되는 경우에, 절개을 다시 포셉의 팁을 사용합니다.
  2. 조심스럽게 주위에 혈액의 흐름을 제한하는 슬립 매듭을 사용하여 MCAO 봉합 실리콘 부분에 중간 봉합을 묶어하지만 자유롭게 이동할 수 있도록 충분히 느슨한.
  3. 조심스럽게 MCAO 봉합 밖으로 빠져 있지 않은지 확인하고, 상단 봉합을 취소.
  4. 몇 mm하여 ICA의 MCAO 봉합사를 삽입하고, 단계 5.2에 기재된 바와 같이 후 동일한 방법으로, 가기 봉합사를 리 클로즈.
  5. 폐색 영역으로 MCAO 봉합을 안내합니다. 성공적으로 삽입의 표시이다실버 9mm의 마크 CCA 절개의 혈액 역류의 낮은만큼 그 증거는 CCA 절개와 ICA / ECA의 분기 사이에 위치해 있습니다. 성공적인 폐색 추가 확인은 레이저 도플러 혈류 모니터링 시스템 (15, 16)로 모니터링 방법을 사용하여 얻을 수있다.
    주 : 폐색 영역 측의 중간 뇌 영역으로 혈액 흐름의 90 %의 저하가 성공적으로 폐색을 나타낸다.
  6. 성공적인 폐쇄 후 단단히 중간과 상단 봉합을 묶어. 가짜 삽입을 수행하는 경우, 봉합 리 클로즈 대신 즉시 7.3 단계로 이동하지 않습니다.

6. 절개 결산 및 수술 후 케어

  1. 절개 영역으로 봉합에 정력.
  2. 트랙터 또는 조직 후크와 베개를 제거합니다.
  3. 멸균 생리 식염수와 면봉을 사용하여 청소 봉합 영역입니다.
  4. 나일론 봉합사 / 바늘과 집게를 사용하여 절개를 닫습니다.
    5. <리> 관리] 항 염증 (예를 들어, 카프로 펜 (10) ㎎ / ㎏, 사우스 캐롤라이나) 및 진통제 (예, 부 프레 놀핀 0.1 ㎎ / ㎏ 사우스 캐롤라이나, 하루에 두 번) 약물은 수술 후 불편 함을 완화한다. 저체온증을 방지하고 물과 연화 식품 광고 labium 액세스 권한을 부여하기 위해 가열 패드에 배치 새장에 마우스를 놓습니다.
  5. (- 10 분 5)과 뇌졸중의 징후 동물의 복구를 모니터링합니다. 그들은 가벼운 측면 마비에서 다양하고 반대쪽 측면 및 압연의 심한 수축에 돌고 있습니다. 여러 평가 점은 토론에 나열되어 있습니다. 호흡 곤란이나 심한 발작의 징후를 표시하는 동물은 안락사되어야한다.
  6. 허혈 재관류 프로토콜에 따라, 120 분 이상 30 분에서 장소에 MCAO 봉합을 둡니다. 폐쇄 시간을 줄이면 사망을 방지 할 수 있습니다.
  7. 영구적으로 폐색하지만 심각한 사망률 예상 할 수 24 시간 동안 제자리에 MCAO 봉합사를 떠난다. 이 시간 경과 후, 인트 진행페이지 7.
    1. 영구 폐쇄 모델을 사용하는 경우, 종점까지 새장에 마우스를 유지. 이 때, (7.8-7.1 단계) 봉합사를 제거합니다. 이 절차는 안락사 후에 수행 될 수있다.

7. 재관류

  1. (2.1 지침에 따라) 다시 동물을 마취하고 상처 폐쇄 봉합을 제거합니다.
  2. 집게 및 조직 분리, 절개를 다시 열고 CCA 노출을 사용.
  3. 조심스럽게 상단 봉합사를 제거하고 실리콘 코팅 된 부분이 중간 매듭에 위치 할 때까지 부드럽게 MCAO 봉합을 잡고 분리합니다.
  4. (이것은 슬립 매듭 일 필요는 없다) 봉합사를 통과 흐르는 혈액을 방지하기 위해 봉합 매듭의 최상위 재실행.
  5. 조심스럽게 중간 매듭을 취소하고 정상 매듭 과거 봉합사를 당겨하지만 CCA 내부에 보관하십시오.
  6. 단단히 동맥 혈류를 차단 가기 매듭을 닫는다.
  7. 완전히 MCAO 봉합을 당겨 단단히 중간 매듭을 닫습니다.
  8. MCAO 봉합이 될 수 있습니다여러 번 재사용. 사용 후, 멸균 거즈를 사용하여 오염 물질 (예를 들면, 혈액 또는 조직)를 제거하기 위해 70 % 에탄올에 조심스럽게 세척 봉합사. 그 후, 멸균기 파우치에 봉합을 배치하고 소독.
  9. 6.4 동물 복구를 모니터링 - 반복 6.1 단계를 반복합니다.

8. 조직 분석

  1. 뇌졸중 볼륨을 모니터링 뇌를 해부합니다.
    1. 두 단계 공정을 사용하여 마우스를 안락사. 첫째, 정지 호흡 할 때까지 이소 플루 란의 과다 복용으로 동물을 노출. TTC 염색의 경우, 즉시 마우스를 목을 벨 뇌 추출로 진행합니다. 절편 뇌 (면역 염색 분석 등을 위해)의 경우, 잘린 이전에 심장 천자를 통해 관류를 수행합니다.
    2. 두개골의 기지에서 머리를-잘라과 눈 사이까지 두개골의 상단에 목 구멍에서 두피를 잘라. 두개골을 노출하면, 두개골베이스 개도부터 양측을 따라 뼈 절단눈 소켓까지. 두개골의 넓은 부분을 따라이 상처를 확인합니다. 뇌의 손상을 방지하기 위해 가위로 너무 깊이에 도달하지 않도록주의하십시오.
    3. 그 후, 두 눈 소켓 사이의 뼈를 잘라.
  2. 집게를 사용하여 뇌를 노출 두개골 상부를 들어 올려. 단지 작은 저항이 있어야합니다. 쉽게 들지 않는 경우, 두개골 절개가 불완전 할 수 있습니다. 부드럽게 무딘 곡선 집게를 사용하여 뇌를 올립니다. 뇌는 여전히 여러 가지 신경에 의해 부착 될 수 있습니다. 길을 따라 첨부 파일을 제거, 천천히 진행합니다.
  3. , 1mm의 뇌 매트릭스에 신선한 뇌를 놓고 PBS 방울의 몇 가지를 추가하고, 면도날 또는 저온 유지 장치 블레이드를 사용하여 행렬을 따라 슬라이스.
  4. 100mm의 접시에 옮기고 뇌 접시의 저면을 덮도록 염색 용액 (2 % 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC)] PBS에 용해)을 추가한다. 두 개의 집게를 사용하여 별도의 모든 뇌 조각은 (앞면이 아래로 향하게)과 접시의 바닥에 순서대로 배치합니다.
    참고 : 염색이 아닌 살아있는 조직은 흰색, 나머지 빨간색 살아있는 조직을 켜집니다. 37 ° C에 대한 해결책을 따뜻하게하는 것은 염색을 가속화 할 것이다. 행정 영역 (흰색)의 징후는 90 분 후 스트로크 빨리 볼과 7 일 이상 계속 표시 할 수 있습니다. 영상은 뇌졸중 볼륨의 계산을 할 수 있도록 통치자와 함께 수행해야합니다.
  5. 단면 처리를위한 프로세스 해부 두뇌, 면역 염색, 단백질 분리, 또는 다른 절차 (17)의 다양한, 18, 19.

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결과

폐색 봉합의 삽입 경로는 그림 1에서 설명된다. MCAO 봉합사는 ICA 용 분기로, 폐색 영역으로 라우팅 될 것이다. MCA의 성공적인 폐쇄는 TTC 염색으로 표시 조직 손상으로 이어질 것입니다. 그림 2 (90 분 또는 24 시간 이후 폐쇄,도 2b에 염색) 가짜 치료 동물 (그림 2A) 및 60 분 MCAO 허혈 재관류 동물에서의 염색의 이미지를 제공합니다. 스트로크 량을 결정하기 위해, 먼저 반대측의 전체 영역에서 동측의 비 - 경색 영역을 감산함으로써, 눈금자 촬상 방법에 포함하여 각 섹션의 선 영역을 구한다. 이 계산은 상용 소프트웨어 또는 개방 소스 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. 그 후, 슬라이드 1 mm 두께의 것을 각각의 조각은 고려에 대한 행정 볼륨을 계산하고 fo를 스트로크 볼륨을 요약모든 조각을 r에. 이 과정은 다른 ...

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토론

상술 MCAO 방식의 성공적인 이용은 뇌 혈류 해부학의 이해에 크게 의존한다. 봉합의 정확한 위치 인한 직접적인 시각적 단서의 부족으로 분별하기 어려운 때문에 반복 연습 조사 연구에 사용하기 전에 절차를 습득하는 것이 중요하다. 스트로크 볼륨은 일관된 결과를 보장하기 위해 분석되어야한다. 레이저 도플러 시스템의 첨가는 혈류의 성공적인 폐색을 결정하는 데 도움이되고 절차가 정확하게 수행되도록 주기적으로 사용되어야한다. 폐색 영역으로 봉합 MCAO 라우팅하는 동맥을 조작함으로써 용이하게 될 수있다. 는 ECA / ICA가 / 아래 왼쪽에있는 봉합사를 안내하고 않도록 약간 집게와 분기 (2-3 ㎜) 위에있는 ICA에 대한 눌러 분기 통과 만되면, MCA에 봉합 안내에 도움 pterygopalatine 동맥으로가는. 또한, 베개 이동 단계 3.3 PU 배치lling 아래 위로 매듭 및 삽입을 쉽게하기 위해 동맥을 배향에 도움이 될 수 있습니다 오른쪽. 프로토콜의 나머지 단계는 실체 현미경 하에서 미세을 포함하고 매우 간단합니다. 90...

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공개 사항

저자에게는 경쟁이나 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

우리 실험실에서 이 모델을 처음 확립한 Dr. Lei Chen(뉴욕 마운트 시나이의 Icahn School of Medicine)에게 감사드립니다. HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 및 NSC 2015/17/B/NZ7/02985에서 부분적으로 지원됩니다. Luc Bertrand 박사는 미국심장협회(American Heart Association)의 박사후 연구원(16POST31170002)의 일부 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MCAO 봉합사 0.23 mmDoccol702345PK5Re
MCAO 봉합사 0.21 mmDoccol702145PK5Re
실버 펜스테이플503205
마취 기계Vetequip901806
외과 용 가위정밀 과학 도구14558-09
외과 겸자 스트레이트 팁파인 과학 도구00108-11
수술 겸자 각진 팁미세 과학 도구00109-11
스프링 가위미세 과학 도구15000-08
나일론 봉합Braintree scintificSUT-S 104
폐쇄 봉합사VWR95057-036
IsofluranePiramal
2,3,5- 트리 페닐 테트라 솔륨 클로라이드FisherSci50-121-8005
브레인 블록Braintree scintificBS-A 5000C
저온 유지 장치블레이드 VWR89202-606
옵션 :
Periflux 레이저 도플러 시스템PerimedPeriflux 5000
모니터링 장치PerimedPF 5010 - LDPM
사

참고문헌

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