셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

요약

세포 거동의 나노 지형학적 조절을 연구하기 위해 작은 나노 패턴 주형에서 넓은 면적의 나노 패턴 기판을 생산하는 프로토콜이 제시됩니다.

초록

기판 나노 지형은 세포 표현형과 기능의 강력한 조절자인 것으로 나타났습니다. 세포 행동의 나노 지형 조절을 해부하기 위해서는 후속 생화학 및 분자 생물학 분석을 위해 나노 지형에서 충분한 세포를 배양할 수 있도록 넓은 영역의 나노 패턴 기판이 바람직합니다. 그러나 현재의 나노 제조 기술은 넓은 면적에 걸쳐 고도로 정의된 나노 패턴을 생성하는 데 한계가 있습니다. 본 명세서에서는 스티치(stitch) 기법을 이용하여 나노패턴화된 기판을 작고 고도로 정의된 나노패턴에서 넓은 영역으로 확장하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 정의된 주형에서 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 주형을 복제하는 소프트 리소그래피, 여러 PDMS 주형을 하나의 대형 주형으로 조립하는 스티치 기술, 폴리스티렌(PS) 기판에 마스터 주형을 생성하는 나노임프린팅 등 여러 기술을 결합합니다. PS 마스터 몰드를 사용하여 PDMS 작업 기판을 생산하고 세포 확산의 나노 지형 변조를 시연합니다. 이 방법은 넓은 영역에 걸쳐 잘 정의된 나노 패턴을 생성할 수 있는 간단하고 저렴하면서도 다재다능한 방법을 제공하며, 하이브리드 구성 요소가 있는 마이크로/나노 스케일 장치를 만들기 위해 잠재적으로 확장될 수 있습니다.

서론

최근의 많은 연구 결과에 따르면 기질 나노 지형학은 세포 부착, 확산 및 이동에서 증식 및 분화에 이르기까지 세포 행동에 뚜렷한 영향을 미친다^1-6. 예를 들어, 깊은 나노그레이팅에서 배양된 세포에서 더 작은 세포 크기와 더 낮은 증식 속도가 관찰되었으며, 플랫 대조군^2,7-10에 비해 세포 정렬, 신장 및 이동이 향상되었음에도 불구하고 세포사멸로 이어지기도 했습니다. 또한, 나노 지형학은 줄기 세포를 뉴런^2,11,12, 근육¹³ 및 뼈^3,4와 같은 특정 계통으로 분화하는 것을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 또한, 엔지니어링 된 나노 물질^14,15의 독성에 대한 우려가 증가하기 때문에 나노 물질의 정확한 위험 평가를 위해 생리학적으로 관련된 시험관 내 모델에 나노 지형을 통합 할 필요가 있습니다. 생화학 및 분자 생물학 분석을 수행하려면 넓은 면적의 나노 패턴 기질에서 성장하기에 충분한 세포가 필요합니다. 그러나 기존의 나노 제조 기술은 넓은 면적에 걸쳐 고도로 정의된 나노 패턴을 생성하는 데 한계가 있습니다.

¹⁶ 및 고분자 디믹싱¹⁷을 포함한 > 자체 조립은 저렴한 비용으로 대면적 나노 구조를 쉽게 생성할 수 있습니다. 자기 조립은 콜로이드 입자와 거대분자와 같은 조립 요소 간의 상호 작용, 그리고 이러한 요소와 기판 간의 가능한 상호 작용에 의존하기 때문에 정확한 공간 위치와 임의의 모양을 가진 나노 구조를 생산하는 독립적인 방법이 될 수 없습니다¹⁸. 수반되는 높은 밀도의 결함도 단점입니다. 나노 패턴의 정밀한 공간 제어는 하향식 석판 인쇄 방식을 사용하여 조립 요소^19-21의 상향식 조립을 안내하는 지형 및/또는 화학적 템플릿을 제공하는 템플릿 자체 조립을 사용하여 달성할 수 있습니다. 스텝 앤 플래시 리소그래피⁽²²) 및 롤-투-롤(roll-to-roll) 나노임프린팅 리소그래피⁽²³)와 같은 대안적인 나노 제조 기술이 개발되었지만, 그들의 정교한 공정 또는 특수 장비의 요구로 인해 사용이 제한되어 있다. 그럼에도 불구하고, 정의된 나노 스케일 패턴을 가진 템플릿 또는 마스터 몰드는 템플릿 또는 대체 나노 제조 기술에 필요합니다.

이러한 템플릿과 마스터 몰드는 일반적으로 집속 전자, 이온 또는 광자 빔 리소그래피를 사용하여 생성됩니다. 예를 들어, 전자빔 리소그래피(EBL)²⁴ 및 집속 이온 빔 리소그래피⁽²⁵)는 5nm 미만의 분해능으로 정의된 패턴을 생성할 수 있습니다. 이광자 리소그래피는 30nm26의 작은 피처 크기를 보여주었습니다. 집속 빔 리소그래피 기술을 통해 잘 정의된 나노 단위 구조를 생성할 수 있지만 자본 투자와 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는 프로세스로 인해 학술 연구에서의 광범위한 사용이 제한됩니다²⁷. 그러므로, 높은 충실도를 가진 넓은 면적의 나노 패터닝 표면을 생산할 수 있으면서도 저렴한 기술을 개발하는 것이 매우 바람직합니다.

우리는 작고 잘 정의된 주형(²⁸)으로부터 넓은 면적의 나노패턴 표면을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적인 스티치 기술을 보고했다. 이 프로토콜은 EBL로 작성된 패턴을 사용하여 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 금형 복제부터 여러 PDMS 금형을 하나의 대형 금형으로 조립, 폴리스티렌(PS) 기판과 같은 고분자 기판에서 마스터 금형 생성, 작업 기판 생산에 이르기까지 단계별 절차를 제공합니다. 확장된 나노 패턴 기판을 사용하여 세포 확산의 나노 지형 조절을 입증했습니다.

프로토콜

EBL 금형에서 PDMS 금형 1. 복제

1. ⁽²⁹⁾ 실리콘 몰드를 제조
   1. 스핀 코팅은 200 ㎕의 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 1 분 동안 2,500 rpm에서 1 × 1cm의 실리콘 (Si) 기판 상에 용액의 박막을 형성한다.
   2. 2 분 동안 180 ° C에서 Si 기판의 PMMA 필름을 굽는다.
   3. 300 μC / ^㎠의 면적 도즈 집속 전자 빔을 이용하여 PMMA 필름의 설계 나노 패턴을 작성한다.
   4. 80 초 동안 개발자의 PMMA의 나노 패턴을 개발합니다.
   5. 10 kV로, 0.5 mA의 방출 전류는 0.5 Å / sec의 증착 속도의 출력 전압 전자빔 증착기를 이용하여 두께 50 nm의 니켈 층과 PMMA의 나노 패턴을 증착.
   6. 20 분 동안 80 ° C에서 20 ㎖ 제거제의 PMMA 부 리프트 오프.
   7. 반응성 이온 에칭 (RIE) Si 기판에 나노 패턴은 원하는 깊이의 실리콘 몰드 도착.
      참고 : tetr의 가스 혼합물afluoromethane (CF ₄₎ 150 W 400 W와 RIE 전력의 유도 결합 플라즈마 (ICP) 전원으로 / 산소 (O ₂₎ (90 % / 10 %)이 560 nm의 깊이까지 실리콘 기판을 에칭하기 위해 사용된다.
2. silanization합니다 실리콘 몰드
   1. 100mm의 PS 페트리 접시에서 유리 커버 슬립하고 실리콘 주형을 넣어 흄 후드에 위치한 유리 데시 케이 터 내에서 전송할.
   2. 커버 슬립에 10 μL의 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane을 삭제합니다.
      주의 : 1H는, 1H는, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane 피부 부식 및 눈에 심한 손상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것.
   3. 부분적으로 페트리 접시를 커버.
   4. Si를 몰드의 실란 화를 완료하는 흄 후드에서 5 시간 동안 진공하에 데시 케이 유지.
3. PDMS 예비 중합체를 준비
   1. 일회용 계량 보트 10 g의 PDMS 수지 1.05 g 경화제를 단다.
   2. 플라스틱 숟가락을 사용하여 철저하게 PDMS 예비 중합체를 섞는다.
   3. 맑은 혼합물이 관찰 될 때까지 약 20 분 동안 진공 하에서 플라스틱 건조기에서 PDMS의 예비 중합체를 탈기.
4. PDMS 몰드 복제
   1. 60mm 페트리 접시에 실란 화시 금형을 넣습니다.
   2. 페트리 접시의시 금형에 PDMS 예비 중합체를 따르십시오.
   3. 모든 거품이 사라질 때까지 약 10 분 동안 플라스틱 건조기 및 탈기의 페트리 접시를 놓습니다.
   4. 열판을 페트리 접시로 이동시켜, 4 시간 동안 70 ° C에서 PDMS의 예비 중합체를 경화.
   5. 신중 핀셋을 이용하여 Si를 몰드에서 PDMS 몰드를 떼어.
      참고 : PDMS 금형은 일주까지 주위 조건에서 저장 될 수있다. 경화 후, PDMS 몰드 ^(30)의 일부 미가 교 PDMS 수지 분자 잔류 경화제가있다. 저 분자량 분자들은 점차 확산 시간 동안 표면에 축적된다. 이 PDMS 표면 ^(31)의 지형 및 기계적 특성에 영향을 미친다. DIF융합 1 주일 내 중요하지 않습니다.

대형, 단일 금형에 PDMS 금형 2. 바느질

1. 단계 1.4을 반복하여 여러 PDMS 금형을 준비합니다.
   참고 : PDMS 혼합물의 동일한 금액을 동일한 두께의 PDMS 금형을 얻을 때마다 체중.
2. 이러한 광학 현미경으로 nanogratings 이방성 PDMS 나노 패턴의 방향을 결정하고, 마커 펜으로 PDMS 몰드의 뒷면에 마크.
   참고 : 이러한 나노 기둥으로 등방성 나노 형상의 방향을 표시 할 필요가 없습니다.
3. 흄 후드에서 에탄올 Si 기판을 청소하고 압축 공기로 건조.
4. 블레이드 각 PDMS 몰드의 패턴 화되지 않은 영역을 낸다.
   참고 : 스티치 금형의 둘레에 배치되는 PDMS 금형의 경우, 다른 사람과의 접촉 만이 패턴 화되지 않은 영역이 떨어져 손질해야한다.
5. 에 나노 패턴면이 아래로 트리밍 된 PDMS 몰드를 배치미러 Si 기판의면 다음은 가까이 있지만 주변 금형 (들)을 터치하지 다른 금형을 맞 춥니 다.
6. PDMS 접착층 준비
   1. 0.5 mm 두께의 층을 형성하기 위해 깨끗한 유리 슬라이드 (2.5 cm × 7.5 cm)에 1g는 PDMS 프리폴리머 (1.05 : 10 PDMS 수지와 경화제의 비) 탈기 전송.
   2. 3-5 분 동안 핫 플레이트상에서 100 ℃에서 PDMS 층 굽는다. 레이어를 터치 레이어가 부분적으로하지만 완치는 것을 보장하기 위해 바늘을 사용합니다.
      참고 : 부분적으로 경화 된 PDMS는 경화 PDMS 예비 중합체처럼 흐를 수 없지만 경화 PDMS에 비해 스티커입니다.
7. 정렬 PDMS 몰드의 뒷면에 PDMS 층을 배치하고 신속하게 조립이 반전하고, 핫 플레이트로 옮긴다.
8. PDMS의 접착제 층 및 PDMS 몰드의 배면 사이의 양호한 접촉을 보장하고, 1 시간 동안 100 ° C에서 PDMS를 접착제 층을 경화 조립체의 상부에 금속 블록을 사용 압축력 (5 kPa로)를 적용한다.
   주 : 조심 조립체의 경사를 방지하기 위해 상기 금속 블록의 위치를 ​​조정한다.
9. 금속 블록을 제거하고 실리콘 기판의 단일 스티치 PDMS 몰드를 떼어.

PS 기판에 마스터 몰드의 3 세대

주 : 유리 슬라이드에 고정화 스티칭 PDMS 몰드가 PS 판 또는 작동 나노 패턴 기판을 제조 할 수있는에서 PS 박막의 마스터 몰드를 생성하는데 사용될 수있다.

1. 이 PS 판에 마스터 몰드를 생성
   1. 이 PS 판을 준비
      1. 이틀 동안 80 ℃에서 진공 오븐에서 PS 펠렛을 건조.
      2. 230 ° C에서 프레스 기계를 예열.
      3. 아래에서 위로 순서대로 알루미늄 판, 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 시트와 알루미늄 스페이서를 조립한다.
      4. 3cm (L) × 3 cm (W) × 0.3 cm (H)의 사각형 구멍에 알루미늄 스페이서에서로드 3.5 g의 PS 펠릿.
         참고 : 스페이서는 약 0입니다.1 PDMS 몰드보다 두꺼운 cm, 따라서 최종 나노 패턴의 PS 기판은 약 0.1 cm의 두께이다.
      5. 알루미늄 스페이서의 다른 PTFE 시트 다음 다른 알루미늄 판을 놓습니다.
      6. 프레스 기계 어셈블리를 놓습니다.
      7. 30 분 동안 230 ° C에서 PS 펠렛을 예열.
      8. 5 분 동안 어셈블리에 압축 압력 (0.1 MPa의)를 적용합니다.
      9. 압력을 해제 한 후 조립 0.5 MPa의 압축 압력을 다시 적용합니다.
      10. 1.5 MPa의 압력의 바람직한까지, 0.5 MPa의 압력 증가 단계를 반복 3.1.1.9 진행한다.
      11. 프레스 기계의 히터를 끄고 1.5 MPa의 일정한 압력에서 70 ° C 이하로 냉각.
      12. 어셈블리를 타고 PS 판을 다시 들어가는 습기를 방지하기 위해 80 ℃의 진공 오븐에서 PS 판을 저장한다.
   2. PS 판에 나노 임프린트 스티칭 PDMS 몰드
      1. 알루미늄 스페이서의 PS 판을 놓고3 인치 실리콘 웨이퍼에 설정합니다.
         주 : 상기 스페이서의 내부 치수는 PS 판과 동일하다 그래서 PS 판 바로 스페이서 맞는다.
      2. 30 분 동안 250 ° C에서 열판에 PS 판을 가열한다.
      3. 용융 PS 판에 나노 패턴면이 아래로 스티치 PDMS 몰드를 넣습니다.
         주 : PDMS 몰드의 일측 먼저 PS 판의 표면과 접촉에 배치되고, 다른 쪽의 계면에 기포의 형성을 방지하기 위해 PS 표면과 접촉하여 서서히 저하된다.
         주의 : 핫 플레이트의 표면이 뜨겁습니다. 나노 임 프린팅 과정에서 thermogloves을 착용 할 것.
      4. 스티칭 PDMS 금형의 유리 슬라이드에 알루미늄 판을 놓습니다.
      5. 알루미늄 판에 금속 블록을 사용하여 압축 압력 (12.5 kPa의)을 적용하고 3 분 동안 기다립니다.
         주 : 알루미늄 플레이트가 기울어지지되어 있는지 확인합니다.
      6. 들어 올려 알루미늄 판에서 금속 블록을 교체하고 난25 kPa의에 압축 압력을 ncrease.
      7. 압력과 단계를 반복 3.1.2.6는 kPa의 50로 증가.
         주의 :이 단계는 PDMS 몰드와 PS 판 사이에 포획 된 공기를 제거하는 것이다.
      8. 15 분 동안 50 kPa로의 일관된 압력을 받고 240, 250 °의 C 사이의 열판의 온도를 유지한다.
      9. 열판의 전원을 끄고 전체 설치를 냉각.
         주 : 팬은 냉각 과정을 촉진하기 위해 사용될 수있다.
      10. 의 PS 판에서 스티치 PDMS 몰드 박리 신중 온도가 50 ° C 이하로 된 후, 금속 블록을 제거.
          주 : PS 기판 역방향 나노 패턴을 가지고 작업 PDMS 기판을 제조하여 마스터 몰드로서 사용될 수있다.
2. 이 PS 박막에 마스터 몰드를 생성
   1. 에 PS 박막을 준비
      1. 흄 후드에서 10 ml의 톨루엔에 1g의 PS를 녹여.
         주의 : 톨루엔은 피부 irritatio가 발생할 수 있습니다n 및 심각한 눈 손상, 그리고 장기간 또는 반복 노출되면 장기에 손상을 줄 수 있습니다. 적절한 개인 보호구를 착용 할 것.
      2. 1 분 동안 2,500 rpm에서 웨이퍼 2 인에 스핀 코트 1 ML의 PS 솔루션은 ~ 1 μm의 두께 PS 박막을 형성한다.
      3. 3 일간 흄 후드에서 Si 웨이퍼에 PS 필름을 설정하여, 필름으로부터 톨루엔을 증발시켰다.
      4. 밤새 80 ℃에서 진공 오븐에서 PS 박막을 어닐링.
   2. 나노 임프린트는 PS 박막의 PDMS 몰드
      1. 열판에 설정되어있는 PS 박막에 나노 형상면이 아래로 스티치 PDMS 몰드를 넣습니다.
      2. PDMS의 주형의 유리 측에 금속 블록을 사용하여 PDMS 몰드 12 kPa로의 압축 압력을 적용한다.
      3. 180 ° C에 열판의 온도를 높이고 15 분 정도 유지한다.
         주의 : 용융 PS 필름 윤활제로서 기능 할 수있다. 미끄러에서 금속 블록 않도록주의.
      4. 열판의 전원을 끄고전체 설치를 냉각.
         주 : 팬은 냉각 과정을 촉진하기 위해 사용될 수있다.
      5. 의 PS 필름으로부터 스티치 PDMS 몰드 박리 신중 온도가 50 ° C 이하로 떨어지면 후 금속 블록을 제거.
         참고 : 나노 패턴 PS 필름 작업 PDMS 기판을 생산하는 마스터 몰드 될 것입니다.

세포 행동 4. Nanotopographical 변조

참고 : 대표 nanotopographies 셀 확산의 nanotopographical 변조를 설명하기에 인간의 상피 세포가 배양.

1. 애플리케이션에 따라 3.1 또는 3.2 단계 중 하나에서 생성 된 마스터 주형으로부터 작업 PDMS 기판을 전송.
2. 중공 강철 아치 펀치를 이용하여, 특정 멀티 웰 플레이트 (예를 들면, 24- 웰 플레이트)의 구성에 맞도록 디스크에 나노 패턴 PDMS 기판을 절단.
3. 오 우물에 PDMS 디스크를 배치 핀셋을 사용하여FA 멀티 웰 플레이트.
4. 70 % 에탄올 다음 UV 노출 30 분 동안 각을 이용하여 PDMS 기판을 소독.
5. 1 배 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)를 세 번으로 PDMS 기판을 세척 할 것.
6. 코팅을 실온에서 30 분 동안 세포 외 기질 단백질 (즉, 20 μg의 / ml의 피브로넥틴)와 PDMS 기판.
7. 5 분 동안 PDMS 기판을 멸균 PBS로 3 회, 각 린스.
8. 10 % 소 태아 혈청 둘 베코 변형 이글 배지에 인간 폐암 세포 A549를 중단하고 혈구 세포를 사용하여 계산.
9. 하루 동안 5 % _{이산화탄소를} 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 PDMS 기판 및 배양을 2,000 세포 / ^㎠의 밀도로 시딩 세포 접시.
10. PBS로 3 회 세포를 씻으십시오.
11. 4 시간 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 및 2 % 글루 타르 알데히드의 혼합물에 세포를 고정 및 CO ₂ 임계 포를 사용하여 세포를 탈수전자 현미경 관찰 ^(29)를 스캔 INT 건조기.
    주의 : 파라 포름 알데히드와 글루 타르 알데히드는 피부에 심한 화상과 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 화학 후드에서 작동하고 적절한 PPE를 착용하십시오.

결과

스티치 기법은 높은 정확도와 나노 패턴 기판의 넓은 영역을 생성 할 수있다. 도 1a는 각각, Si 기판 상에 PS 판과 PS 박막 스티칭 PDMS 몰드로부터 전송 된 나노 패턴의 넓은 영역을 표시 1B. 원래 EBL-기록 금형 (그림 1C) 및 기판 (그림 1D)를 작업의 최종 PDMS 사이의 비교는 EBL-기록 된 나노 패턴이 충실하게 작업 기판에 전달 될 수 있음을 확인합니다. 다양한 형상 및 크기의 나노 토포 그래피는 셀의 동작을 조절하는데 사용될 수있다. A549과도 2에서 설명한 바와 같이, 모델 셀로서 adenocarcinomic 기저 상피 세포주 이방성 nanogratings는 A549 세포 등방성 나노 기둥에 표시 다극 형태에 비해 nanograting 방향으로 셀을 길게 할 수있다.

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토론

우리는 나노 패턴 기판의 넓은 영역을 생성하기 위해, 단순 저렴하면서도 다목적 방법을 제시한다. 충실하게 높은 정의 나노 패턴을 확장하려면 큰 관심은 몇 가지 중요한 단계에 지불해야한다. 첫 번째 다중 PDMS 금형을 트리밍하는 것이다. PDMS의 주형의 패터닝되지 않은 부분을 제거 할 필요가있다. 또한, 주형의 측벽 금형 사이의 갭을 최소화하기 위해 가능한 한 수직으로 완벽 절단한다. 총체적 최종 스티치 몰드에 비 패턴 영역의 일부가 감소 될 수있다. 둘째,이 PDMS 몰드의 나노 패턴 표면은 실리콘 기판 상에 변형이없는 정렬 될 필요가있다. PDMS의 나노 구조물을 변형하는 경향이 있기 때문에합니다 (PDMS 몰드와 실리콘 표면 사이의 공기를 포획하지 않도록) 부드럽고 균일하게 실리콘 기판의 거울면에 대하여 나노 패턴 표면을 배치하는 것이 중요하다. PDMS 몰드가 있지만 네이 닿지 않으면 서 최대한 가까이 정렬 될 것이다주형 ghboring하면 상기 최종 스티치 주형의 패터닝되지 않은 부분을 최소화한다. 그렇지 않으면, ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
JEOL 전계 방출 SEM	JEOL	JSM-7600F	EBL
E-빔 증발기	Kurt J. Lesker	모델: LAB 18 전자빔 증발기	니켈 증착
Trion Minilock III ICP/RIE	트리온 기술	모델: Minilock-phantom III
프레스 기계	PHI 유압 프레스	몰데: SQ-230H
스핀 코터	로렐 기술	모델 : WS-400A-6NPP-LITE
CO2< / sub> 임계 건조기	Tousimis	모델 : Autosamdri-815
실리콘 웨이퍼	대학 웨이퍼	1080
알루미늄 플레이트	McMaster-carr	9057K123
테프론 시트	McMaster-carr	8711K92
100 mm 페트리 접시	FALCON
60mm 페트리 접시	FALCON	353004
유리 커버 슬립	Fisher Scientific	12-542-B
유리 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-34
일회용 계량 보트	Fisher Scientific	13-735-743
유리 건조기	Fisher Scientific	02-913-360
플라스틱 건조제	Bel-Art Products	F42025-000
핫플레이트	Fisher Scientific	1110049SH
핀셋	Ted Pella, inc.	5726
블레이드	피셔 사이언티픽	S17302
금속 블록	McMaster-carr
펀치	Brettuns Village 가죽 공예 용품	아치 펀치
폴리(메틸 메타크릴레이트)	MicroChem	495 PMMA A4
PDMS	다우 코닝	실가드 184 키트
폴리스티렌	다우 케미컬	스티론 685D
1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸메틸디클로로실란	오크우드 케미컬	7142
개발자	MicroChem	MIBK/IPA 1:3 비율
리무버	MicroChem	리무버 PG
에탄올	피셔 사이언티픽	BP2818500
톨루엔	피셔 사이언티픽	T324-500
인산염 완충 식염수	Sigma Aldrich	D8537
Dulbecco' s 수정된 독수리 매체	시그마 알드리치	D5796
태아 소 세럼	애틀랜타 생물학적	S11550
파라포름알데히드	전자 마이크로소피 사이언	15712-S
글루타알데히드	피셔 케미컬	G151-1
피브로넥틴	코닝	356008
A549 세포	ATCC	ATCC CCL-185