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방법 논문

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

11.4K 조회수

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DOI:

10.3791/54944

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2016년 11월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

우리는 녹색 형광 단백질과 루시 페라 제 기자를 발현하는 렌티 바이러스 입자 환자 유래의 이종 이식 (PDXs)의 안정적인 표시하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주 사이트 PDXs의 성장을 추적뿐만 아니라, 생체 내 이미징 시스템에서 사용 자발 실험 전이 검출을 허용한다.

초록

종양 생물학 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위해 전임상 모델을 사용하는 것은 암 연구의 핵심입니다. 오랫동안 확립된 인간 세포주와 많은 형질전환 마우스 모델은 종종 인간 악성 종양의 주요 측면을 요약하지 못합니다. 따라서 환자의 종양과 전이의 이질성을 더 잘 나타내는 대체 모델이 개발되고 있습니다. 외과적으로 절제된 종양 샘플을 면역이 저하된 마우스에 이식하는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 여러 세대에 걸쳐 이식할 수 있고 인간 암 세포주에서 유래한 이종이식편보다 종양 이질성을 더 효율적으로 반영하기 때문에 매력적인 대안이 되었습니다. PDX 사용의 한계는 추적 가능한 리포터를 도입하거나 유전자 발현을 조작하기 위해 transfection하거나 transduction하기 어렵다는 것입니다. 현재 프로토콜은 높은 형질도입 효율로 PDX에서 해리된 종양 세포를 형질도입하는 방법과 유방암 전이의 실험적 모델에 표지된 PDX를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 전이성 연쇄 반응의 장기 집락화 과정을 연구하기 위해 실험적 전이 모델에서 표지된 PDX를 사용하는 것을 보여줍니다. 다른 장기로의 전이는 살아있는 동물의 생물 발광 이미징 또는 절제 및 절제 장기에서 절제 중 GFP 발현을 사용하여 쉽게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이러한 방법은 여러 유형의 PDX의 사용을 전이 연구로 확장할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

외과 적 절제 종양 샘플은 직접 면역 감염된 마우스에 접목되어 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDXs)의 개발, 표준 셀 라인 이종 이식 모델에 비해 여러 가지 장점을 제공하며, 암 연구 1,2-에서 큰 진보를 나타낸다. PDXs 유지하고 제 1 통로에서 성장한 종양의 유전 적 및 생물학적 특성에 최소한의 변경으로 연속적인 통로로 확장 될 수있다; 보다 정확하게 인간 암세포 유래의 이종 3-8보다 종양 이질성을 반영한다. 이 모델은 현재 광범위하게 신약 개발 6,11의 전임상 플랫폼으로 암 생물학 4,12 연구를위한 실험 도구로, 암 치료제 9,10 개인화을위한 플랫폼으로 사용된다.

대부분의 PDXs는 이식 및 실행 가능하게 캘리퍼스를 사용하여 시간이 지남에 따라 종양의 성장을 측정 할 수있는 피하 전파됩니다. 하나전이성 질환은 PDXs를 사용하여 모델링하는 것이 더 어렵다. 특히 유방암, 다른 장기로 전이 용량 이종는 3,5,13 설명되었지만, 전이성 사이트 자발 보급의 빈도는 매우 낮다. 보고 된 경우, 전이성 부담의 식별 및 정량은 사후 표적 기관의 힘든 조직 학적 검사에 의존하고있다. 생물 발광 (루시퍼 라제, 배낭) 또는 형광을 발현하는 암세포는 (녹색 형광 단백질 GFP) 유전자 리포터는 일반적으로 뇌, 폐, 뼈, 간 심내 후 꼬리 정맥 intrafemoral 비장 주입 유방암 전이 실험 모델에서 사용 14-16. 이 모델은 기본 종양에서 보급을 우회하는 동안, 그들은 장기 친 화성 및 전이성 식민지의 메커니즘을 연구 할 가치가있다. 그러나, 기본 환자 종양 및 PDXs에서 파생 된 세포는 낮은 형질 전환 또는 전달 속도 날기를 가질 수있다g 표준 절차. 하나의 대안은 종래의 조직 배양 프로토콜을 사용하여 표시 할 수 체외 (17)에 PDX 유래 세포주를 확립하는 것이다. 이 방법은 그러나, 세포주 유도가 어렵고, 세포의 표현형을 변경할 수있는 가장 PDXs를 라벨에 적합하지 않다. 여기에서 우리는 생체 내 이미징에 적합한 렌티 바이러스 벡터와 PDX-해리 종양 세포의 전달을위한 프로토콜을 제시한다. 또, 면역 쥐에서 해리 루크-GFP 표지 PDX 세포의 심장 내 주사를 사용하여 실험 전이를 설명한다.

리포터 유전자를 발현하는 렌티 바이러스 PDX-해리 organoids의 전달을위한 기본 프로토콜은 이전에 18을 설명 하였다. 현재의 프로토콜에서는 인간 종양 세포에 대한 농축 및 100 % 전달 효율 근처 얻을뿐만 아니라 실험 유방암 검출 용 표지 PDXs 사용하기위한 추가의 방법을 설명전이. 이 프로토콜은 여러 암 다양한 발광 및 형광 마커 PDXs의 종류뿐만 아니라 유전자 발현 (관심의 유전자 즉, shRNA를 최저)의 변조를 라벨에 대해 적용 할 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜에서 동물의 사용을 필요로하는 모든 단계는 콜로라도 동물 연구 윤리위원회의 대학 (IACUC)의 지침을 따릅니다.

악기, 문화 미디어 및 기타 시약 1. 준비

  1. (1 : 1), 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF를 20 NG / ㎖), 표피 성장 인자 (EGF, 10 NG / ㎖ 조제 100 ㎖의 둘 베코 변형 이글 매체 및 한의 F-12 배지 (DMEM / F12)를 포함하는 미디어 mammosphere ) 헤파린 (4 μg의 / ㎖), 1X B27, 페니실린 (100 U / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 μg의 / ㎖). 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 무균 조건에서 미디어와 저장소를 확인합니다.
  2. PBS pH를 7.2, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 2 mM의 EDTA를 함유하는 상피 농축 완충액 (EEB)을 준비한다. 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 필터 소독 및 저장.
  3. 달 동안 -20 ° C에서 멸균 15 ML 원뿔 튜브 및 저장소에 소화 버퍼 5 ml의 분취 량을 확인합니다. 종양 소화, 해동 소화 버퍼 전날 밤에 (500 밀리그램 당 5 ml의4 ° C에서 얼음에 종양). 사용하기 전에 1 배 항생제 항진균제 믹스를 추가합니다.
  4. 오토 클레이브 (121 ° C 30 분) PDXs의 해부에 대한 적어도 두 개의 집게, 메스와 가위.
  5. F12 5 % 소 태아 혈청 (FBS) 함유 DMEM 500 ml의 세척 완충액을 만든다. 달 동안 4 ° C에서 보관하십시오. 나누어지는 종양 당 10 ml의 종양 절제술의 날.
  6. 멸균 4 μg의 / μL에서 폴리 브렌 주식을 준비합니다. -20 ℃에서 100 μl를 각각의 저장을 포함하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 분취 필터.

추적 가능한 마커를 들고 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 2 세대

  1. 18, 19 (종양 성장의 생체 내 추적 즉., GFP와 루크)를 구입 또는 리포터 유전자를 운반하는 높은 역가 렌티 바이러스 입자를 생성합니다.
    참고 :의 렌티 바이러스 역가> 10 8 TU / ㎖ (밀리리터 당 전달 단위) PDXs 성공적으로 전달하는 것이 좋습니다. 렌티 바이러스 피기사는 포유 동물 세포의 다양한 형질 도입을 허용 소낭 구내염 바이러스 (VSV-G)에서 엔벨로프 당 단백질 G와 pseudotyped해야한다.
    참고 : 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 생성 및 적정 여기에 사용되는 프로토콜에서 확인할 수있다 www.kottonlab.com . 이 프로토콜에 사용되는 벡터는 pSIH1-H1-copGFP-T2A-순수하지 않아 및 듀얼 프로모터 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W입니다. 이 벡터는 파지 - EF1aL-을 DsRed-UBC-GFP-W 벡터 EF1aL 프로모터 하류의 루시퍼 라제 유전자, 대럴 Kotton, 보스턴 대학의 종류의 선물을 DsRed을 대체하여 생성되었습니다.

환자 유래의 이종 이식의 3 세대

  1. 면역 생쥐 3,4의 유방 지방 패드에 기본 또는 전이성 유방암 종양을 주입하여 유방암 환자 유래의 이종 이식 (PDX)를 생성합니다. 큰 종양이 난만큼 1cm 직경의 최대 권장 크기로 종양을 생성ikely 괴사 코어를 포함한다.
    참고 :. 이종 이식을 수립하고 이식에 대한 자세한 방법은 드로즈 등 18에 설명되어 있습니다. > 1cm 직경의 종양에 설립-이식 가능한 PDXs의 성장 면역 NOD에 주입 후 4, 24 주 정도 소요 / SCID / ILIIrg - / - (NSG), 고유 종양의 성장 속도에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 유방암 PDXs의 전달을 설명하지만, 이는 시험 관내 통로 단기에 적합한 모든 종양 바이러스 형질 도입을 위해 사용될 수있다. 단기에 PDXs의 민감도 - 체외 생존 (24 96 시간)은 각 종양에 고유하고 실험적으로 결정되어야한다.

PDX-유도 된 종양 세포의 4. 종양의 해부와 해리

  1. CO에게 자궁 경부 전위 다음 2 흡입을 사용하여 PDX를 들고 안락사 마우스 (동물 연구 윤리위원회의 제도적 지침을 따르십시오). 0.2 % 장에 쥐 잠수함1 분 lorhexidine 솔루션입니다. 해부 보드의 상단에 부정사 위치에 마우스를 설정하고 보드에 확장 된 상부 및 하부 사지를 해결하기 위해 핀을 사용합니다.
  2. 무균 기술을 사용하여, 종양 주변의 피부를 잘라 메스를 사용한다. 집게의 세트로 피부를 당겨 종양이 완전히 노출 될 때까지 깨끗한 메스를 사용하여 종양에서 분리. 집게와 메스의 깨끗한 세트를 사용하여 종양을 제거하고 얼음에 미디어를 씻어 5ml에 배치합니다.
  3. 추가 처리를위한 BLS2 캐비닛에 해부 종양을 가져 가라. 두 번, 용지를 제거하고 10 mM의 헤 페스 (HBSS / 헤 페스)로 수정 된 행크의 균형 소금 나트륨 10 ㎖로 종양을 씻어.
  4. 멸균 미리 무게 60cm 조직 배양 접시에 종양을 삭제합니다. 종양 덩어리를 추정 종양을 포함하는 플레이트를 단다.
  5. 메스를 사용하여, 다음, 반으로 종양을 잘라 절반에서 3mm 디스크를 절단하고 24 시간 동안 10 % 포르말린 용기에 넣습니다. 의 이질성을 확인하기 위해이 조직을 사용하여종양 샘플 (부모 PDX). 그리고 집게 깨끗한 메스를 사용하여 가능한 가장 작은 조각에 남아있는 종양을 말하다 (건조하기 위해 조직을 방지하기에 충분) HBSS / 헤 페스의 200 μl를 추가합니다.
  6. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 다진 종양을 전송합니다. 종양의 100 밀리그램 당 1 배 항진균제 항생제 함유 소화 버퍼의 최소 1 ML을 추가합니다.
    주 : 항생제 / 항진균제의 첨가가 시험 관내 종양 세포의 오염을 방지한다.
  7. 200 rpm으로 - 125에 떨고, 30 ° C에서 3 시간 동안 종양 다이제스트.
    참고 : 37 ° C까지 증가 온도는 (시간이 지남에 따라 더 많은 단일 세포)를 소화의 효율을 증가 있지만 일반적으로 증가 된 세포의 죽음을 동반한다. 대부분의 종양의 경우, 가능한 해리 세포의 충분한 수의 3 시간 결과 30 ° C에서 소화 라벨 단계로 진행합니다.
  8. 35 ml를 (5 % FBS와 DMEM / F12) 미디어를 씻어 추가 소화를 중지합니다. 깨끗한 50 ML의 C에 메쉬 70 μm의 나일론을 통해 필터onical 관은 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 5 분 동안 400 XG에서 소화 세포를 포함하는 여과 매체를 원심 분리기.
  9. 1 ml의 붉은 혈액 세포 용해 버퍼에 기음 뜨는 및에 resuspend 펠렛. 실온에서 5 분간 인큐베이션.
  10. 용해를 중지 : 10 ml의 세척 버퍼 (F12, 5 % FBS DMEM)를 추가합니다. 40 μm의 나일론을 통해 세포 덩어리를 제거하는 메쉬 전달합니다. 5 분 동안 400 XG에 원심 분리기와 얼음에, 자리를 뜨는을 제거합니다.
  11. 재현 탁은 버퍼와 트리 판 블루 배제를 사용하여 실행 가능한 비 가능한 두 세포를 계산 씻어 5 ml의 세포를 분해. 간단히, 세포의 50 μL와 트리 판 블루의 50 μl를 혼합하고 혈구를 사용하여-트리 판 블루를 제외한 세포를 계산합니다.
    참고 :이 원유 소화 제품은 인간의 PDX에서 파생 된 종양 세포뿐만 아니라 마우스 기질 세포가 포함됩니다 (섬유 아 세포, 혈액 세포, 등.). 소화 된 셀은 표시한다 (단계 6)에 대해 처리 될 수 있고, 또는 인간의 암세포에 기재된 방법 중 하나를 사용하여 농축 될 수있다참고 5인치

인간 상피 암 세포의 5. 심화

  1. 혈통 LIN (+) 세포 고갈 키트 (20)를 사용하여 마우스 간질 세포를 고갈.
    참고 :는 EpCAM 표현을 알 수없는되거나 손실되는 높은 기질 함량) 매우 혈관 종양 및 / 또는 종양 추천합니다.
    1. 깨끗한 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 107 가능한 셀을 타고 5 분 동안 300 XG에 2 ML의 EEB와 원심 분리기를 추가합니다. 완전히 상층 액을 피펫.
    2. 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 EEB 40 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
    3. 10 7 세포 당 비오틴 - 항체 칵테일의 10 μl를 추가, 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하고 10 분 동안 4 ° C (칵테일 린 + 마우스 세포에 항체를 포함)에 품어.
    4. 10 7 세포 당 차가운 EEB 30 μl를 추가, 부드럽게 피펫 팅하여 혼합한다.
    5. 부드럽게 피펫 팅 10 7 세포 당 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 믹스 추가하고 4 & # 부화176 15 분 C.
    6. 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 3 ㎖ 감기 EEB, 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 얼음에 EEB과 장소 500 μL에 재현 탁 펠렛.
    7. 자기 분리기의 자기장에 열을 놓습니다. 0.5 ml의 상피 농축 버퍼 열을 씻어 그것을 통해 똑 할 수 있습니다. 열이 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
    8. 열에서 새로운 폴리 프로필렌 수집 튜브를 놓습니다. 천천히 열을 통해 라벨 세포를 포함하는 500 μl를 추가 (린 +는 세포가 자기 열에서 유지됩니다 표시). 농축 계보 음 (종양) 세포 분획을 나타내는 레이블이없는 세포와 분수 등 폐기물 수집합니다.
    9. EBB의 500 μL와 열 3 번 씻어 단계 5.1.8의 유출과 같은 튜브에 유출 물을 수집합니다. 얼음에 유출 물을 유지하고 라벨 단계 (6)를 진행합니다.
    10. 옵션 : 자기장의 외부의 열을 가라. 아래에 새로운 폴리 프로필렌 튜브를 배치및 EEB 500 μL, 세 번 첨가 제공된 플런저를 사용하여 LIN + 분획을 용리시킨다.
  2. 인간는 EpCAM + 상피 암 세포의 농축은 (CD326 +를 표현하고 높은 마우스 기질 내용을 포함하는 것으로 알려진 종양 권장).
    1. 깨끗한 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 107 가능한 셀을 타고 5 분 동안 300 XG에 2 ml의에게 차가운 EEB와 원심 분리기를 추가합니다. 완전히 상층 액을 피펫.
    2. 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 EBB의 60 μL에 재현 탁 세포 펠렛.
    3. 10 7 세포 당는 EpCAM 마이크로 비즈의 20 μl를 추가, 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하고 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
    4. 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 3 ㎖ 감기 EEB, 원심 분리기와 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 재현 탁의 EEB 500 μL에 펠렛과 얼음에 넣어.
    5. 미니 분리기의 자기장에 열을 놓습니다. 0.5 ML의 EEB와 열을 씻어 그것을 통해 똑 할 수 있습니다. 열 건조하는 것을 허용하지 않습니다아웃.
    6. 열에서 새로운 폴리 프로필렌 수집 튜브를 놓습니다. 천천히, (는 EpCAM + 표지 세포가 자기 열에서 유지됩니다) 컬럼을 통해 라벨 세포를 포함하는 500 μl를 추가합니다. 마우스 간질 세포를 나타내는 표지 된 세포와 같은 유출 분획 수집.
    7. ME 버퍼 500 μL와 열 4 번 씻어 단계 5.1.8의 유출과 같은 튜브에 유출 물을 수집합니다.
    8. 자기장의 외부의 열을 가라. 아래 새로운 폴리 프로필렌 튜브를 놓고 ME 500 μL 버퍼 세 번 추가하여는 EpCAM + 분획을 용출. 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지화 된 세포를 플러시한다. 유출 농축 된는 EpCAM + 종양 세포 분획을 포함를 수집하고 얼음에 보관하십시오. 6 단계로 진행합니다.

PDX 유래의 종양 세포의 형질 도입 (6)

  1. 원심 분리기 2 ml의 mammosphere 메디칼 300 GX 5 분,에 resuspend에서 종양 세포를 해리에이. 4.11에서와 같이 트리 판 블루 배제를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
  2. 준비 8 μg의 / ㎖ 폴리 브렌 (미디어 1 ㎖ 당 재고의 폴리 브렌 2 μl를) 포함 mammosphere 미디어 10 ㎖.
  3. 2 × 10 5 가능한 종양 세포에 필요한 볼륨을 결정합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포 및 폴리 브렌 포함하는 미디어 2 ㎖에 재현 탁 펠렛. 6 웰 초저 부착 조직 배양 플레이트에 웰 당 접시에 2 × 105 생존 가능한 종양 세포.
    참고 :이 하나의 렌티 바이러스 벡터와 형질 도입에 필요한 세포의 최적의 숫자입니다.
    주의! 렌티 바이러스 입자와 렌티 바이러스 입자로 사용되는 모든 소모품은 재조합 DNA의 생물학적 위험에 대한 제도적 절차에 따라 처리해야합니다.
    참고 : 기본 유방암 세포의 렌티 바이러스 전달 강하게 (21) 라벨 동안 내강 세포와 종양 세포의 소집단의 선택의 가난한 표시 될 수 있습니다 근 상피 세포를 선호한다.
    4. <리>이 바이어스 전위 (21)에 대해 서로 다른 기본 세포 개체군에 바이러스 입자의 바인딩 정확한 전달을 증가시키기 전에 1 시간 동안 37 ° C에서 200를 mU / ㎖ 뉴 라미 가진 바이러스를 부화.
  4. PDX-해리 세포 린 + 마우스 세포 고갈 또는는 EpCAM + 세포에 농축되는 경우 10 MOI (2 × 10 5 가능한 세포 2 × 10 6 TU)에서 렌티 바이러스 입자를 추가합니다. 비 농축 PDX-해리 세포를 사용하는 경우 30 MOI (2 × 10 5 가능한 세포 6 × 10 6 TU)에서 렌티 바이러스 입자를 추가합니다.
    주 : 증가 MOI도 파편 많은 양의 원유 추출물의 죽은 세포의 존재 효율적인 전달이 가능합니다. 생존 능력 및 전달 효율에 대한 제어 역할을하는 레이블이없는 세포 하나 잘 보관하십시오.
  5. 세포와 바이러스를 혼합하는 소용돌이 친다. 37 ° C, 최대 96 시간 동안 5 % CO 2에서 품어. 24 시간 형질 전환 후 신선한 mammosphere 매체의 500 μl를 추가합니다. 세포는 ATTAC하지 않습니다판에 시간은 미디어를 대기음하지 않습니다.

평가 Immunocompromised에 마우스의 형질 도입 효율성과 레이블 세포의 재 주입 (7)

  1. 추적 마커 (GFP) 10 배 배율에서 형광 현미경을 이용하여 매 24 시간의 발현을 모니터링합니다.
    참고 : GFP 표현은 감염 후 빠르면 24 시간을 관찰 할 수 있지만, 대부분의 PDXs에서 GFP 발현은 72 시간 (그림 1) 이후에 명확하게 볼 수 있습니다.
  2. 총 잘 내에서 GFP + 세포의 비율을 평가하여 전달의 효율성을 예상하고있다.
    주 : 배양 다양한 정도의 종양 세포에서, 잔류 기질 세포와 죽은 세포를 포함하므로, 낮은 10 %의 GFP + 세포 웰 숙주 마우스에 이식 할 수있다.
  3. 15 ML 원뿔 관에 6 웰 플레이트에서 형질 세포를 전송합니다. 남아있는 모든 세포를 수집하는 우물에 mammosphere 매체의 1 ML을 추가합니다. 얼음에 놓습니다.
  4. 형질 세포와 C에 HBSS / HEPES 10 ML을 추가5 분, 4 ° C 300 XG에 entrifuge. 조심스럽게 얼음에 50 μl의 지하 매트릭스 추출물 (BME)에서 상층 액과에 resuspend을 대기음.
    참고 : BME 씩 1, 얼음에 해동해야 - 사용하기 2 시간 전에. BME 실온에서 고화한다; 항상 얼음에 보관하십시오.
  5. , 0.5 ml의 인슐린 주사기에 BME 내장 세포를로드 얼음에 유지하고, NSG 마우스로 재 치환술의 동물 시설에 가져다.
  6. 2 % 이소 플루 란 / 98 %의 산소 또는 프로토콜을 승인 승인 된 동물 연구 윤리에 따라 다음 5 분 5 %의 이소 플루 란 / 95 %의 산소를 사용하여 8 주 이전 NSG 마우스 - 여자 4 마취.
  7. 동물이 통증 자극 (발가락 핀치)에 응답하지 않는 경우, 에탄올 잎사귀 뒤에 betadine으로 주입 영역을 청소하고 4 번째 유방 지방 패드에서 세포의 50 μl를 주입. 승인 된 프로토콜에 나타낸 바와 같이 주입 불편을 완화하는 진통제와 마우스를 제공합니다.
  8. 세포들이 종양을 형성 할 수 있도록 (2-12주)를하고 GFP를 모니터링 및 / 또는가변 조명 시스템 및 / 또는 생체 루시퍼 촬상 시스템 (도 2)를 사용하여 루시퍼 라제 활성.
    주 : 기관 동물 연구 윤리위원회의 승인 마취, 진통제, 종양 부담 측정 및 안락사 기준에 대한 가이드 라인을 따르십시오.

레이블이 PDXs 8. 품질 관리

  1. 라벨 종양에서 루시퍼 라제 및 GFP 발현을 평가함으로써 라벨의 효율성을 결정합니다.
    참고 : 수행 기관 동물 연구 윤리위원회는 생체 내 생물 발광 영상 절차 (그림 2, 3) 승인했다.
    1. 종양의 크기가 1.0에 도달 할 때 안락사 마우스에서 종양을 해부 - 1.5 cm 직경 (또는 4에 기재된 바와 같이, 승인 된 프로토콜에 따라 전). 절개는 가변 조명 시스템 (또는 GFP 형광 평가할 수 등가 시스템) 하에서 수행한다.
    2. 각 종양에서 질적 체육를 추정GFP + 종양 현미경을 사용 rcentage. 100 % 미만의 경우, GFP의 + 부분 만 해부. 3 밀리 디스크 해부 파라핀 매입 조직 학적 분석을 위해, 10 % 포르말린으로 고정, RNA 또는 다른 원하는 분석을위한 작은 조각을 저장하고, 90 % FBS / 10 %를 함유하는 개개의 1.5 ml의 cryotubes에 가능한 한 많은 종양 저장 동결 보존에 대한 DMSO.
  2. 새받는 사람 NSG 마우스 (18)에 표시 종양의 재 임플란트 조각 확장 실험 전이 연구에 사용할 수 있습니다.
  3. 이전 전달 및 각 세대에서 종양에서 얻은 파라핀 조직의 표준 면역 조직 화학 염색을 수행 한 후 확인이 표시 PDXs 원래 PDXs에 조직 학적으로 유사한 남아 있습니다.
    참고 : 품질 관리에 사용되는 마커는 각 PDXs에 따라 달라집니다. 유방암 PDXs 에스트로겐 수용체 발현, 프로게스테론 수용체, 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 표피 성장 인자 수용체 1 (HER1 또는 EGFR), 유제품n 형 사이토 케라틴 (팬-CK)은 초기 스크리닝을 권장합니다.

레이블이 PDXs 9. 실험 전이 모델

  1. 레이블 PDX에서 종양 세포를 떼어 놓다, 4 장에서 설명하는 단계를 수행. 종양이 높은 혈관 또는 마우스 기질 풍부한 경우 4.5 또는 4.6에 기술 된 바와 같이, 암 세포의 농축을 수행한다.
  2. 마우스 당 (칼슘, 마그네슘 2+ 무료) 트리 판 블루 배제를 사용하여 가능한 세포를 계산, 100 μl의 PBS에서 25 세포를 희석. 얼음에 세포를 유지합니다. 다수의 마우스 주입 따라서 숫자를 조정 (페팅 오류를 고려하여 적어도 하나의 추가 주입 과량을 준비).
  3. 적절한 동물 절차 방에 얼음에 세포를 가져와 승인 IACUC 프로토콜에 따라 내 심장 주사를 진행합니다.
    참고 : 암 세포 내 심장 주입을위한 상세한 프로토콜은 다른 곳에서 22, 23 설명 하였다.
  4. 추적 및 전이를 정량화생물 발광 영상을 사용하여 시간에 걸쳐. 생물 발광 및 / 또는 부검 (24)에서 고립 된 장기의 GFP 영상 (그림 6)를 사용하여 다른 기관에서 거시적 인 전이를 시각화합니다.

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결과

이 방법은 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 pSIH1-H1-copGFP-T2A-순수하지 않아 및 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W를 사용하여 PDX-해리 유방암 세포의 전달에 대해 설명합니다. 이 벡터는, 감염 (그림 1a) 후 빠르면 24 시간을 시험관 내에서 전달의 효율성을 추정 허용 형광 마커를 표현한다. 가장 PDXs 들어, GFP 발현 세포 응집체의 형성은 일반적으로 관찰되는이 시점에서, 감염 (도 1b) 후 72 시간까지 지연 될 것이다. 형질 도입은 또는 조에서 PDX-분해 셀 (린 + 세포 고갈,도 1a를 이용하여, IE) 인간 암세포 농축 후에 얻어 질 수있다 (도 1B). 종양의 상피 세포의 보충은 매우 혈관이 종양 마우스 혈액 세포는 생존 세포의 수의 상당한 비율을 나타낸다이었다...

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토론

프로토콜 내에서 중요한 단계 :

시험 관내 형질 도입 동안 매체 조성물의 신중한 제어를 허용 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 사용은 (> 10 8 TU / ㎖),이 프로토콜의 성공에있어 중요한 단계이다. 고 역가 바이러스 입자의 제조를위한 다양한 방법이도 18, 19를 설명 하였지만; 이 프로토콜에서 상세히 설명한 바와 같이 제조 된 렌티 바이러스 입자를 사용 www.kottonlab.com를 . 암 세포의 종양의 소화와 분해를위한 부드러운 방법은 성공적인 라벨과 라벨이 종양의 성장을 위해 중요하다. 삼시간 넘어 소화 시간을 연장 또는 37 ° C의 분해 온도를 증가시키는 것은 해리 세포의 수를 증가하지만, 대부분의 종양 세포 생존 및 라벨의 성공을 감소시킨다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는이 연구에서 사용 된 높은 역가의 렌티 바이러스 생산을위한 파지 - EF1aL-을 DsRed-UBC-GFP-W 벡터 및 프로토콜을 제공하기 위해 보스턴 대학에서 박사 대럴 Kotton 감사합니다. 이 작품은 .NCI P30CA046934 센터 보조금은 생체 내 이미징에서 지원 DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG 번호 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC)와 R01 CA140985 (CAS)에 의해 투자되었다 조직 문화는 콜로라도 AMC의 대학에서 코어.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM/F12 (1:1)HycloneSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
HeparinSigmaH4784
B27Gibco/Thermo Fisher17504-44
항진균 항생제HycloneSV30010
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105-500소화 버퍼
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS 레드 Ca2+/Mg2+ 무료HycloneSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
CultrexCultrex3433-005-01지하 매트릭스 추출물 (BME)
30 ° C 쉐이커NewBrunswick Scientific CO. INC시리즈 25 인큐베이터 쉐이커
70 μ m 필터Falcon7352350
메스Fisher22079690
Clorhexidine 소독제Durvet NDC# 30798-624-35
레드 블러드  세포 용해 시약SigmaR7757
NeuraminidaseSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326+) 마이크로비즈*Miltenyil Biotec130-061-101
리니지 세포 고갈 키트, 마우스*Miltenyil Biotec130-090-858
MiniMACS 분리기 Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS 마그네틱 스탠드Miltenyil Biotec130-042-303
MS 컬럼Miltenyil Biotec130-042-201MS 또는 LS 컬럼을 사용할 수 있으며, 셀의 수에 맞게 조정할 수 있습니다.
Illumatool 튜너블 라이트 시스템Lightools 연구다양한생체 내 형광 이미징
Xenogen IVIS200 이미징 장치Xenogen다양한생체 내 발광 이미징
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibodyDAKOM0821Pan-cytokeratin 
표피 성장 인자 수용체 항체세포 신호4267SEGFR

참고문헌

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