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방법 논문

지방산의 확인 시험

9.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/54960

⸱

2016년 12월 5일

 ,  , 
1UMR408 SQPOV, Sécurité et Qualité des Produits d'Origine Végétale, INRA, Université d'Avignon, 2UMR1333 DGIMI, INRA, Université de Montpellier

이 논문에서

요약

우리는 지방산을 정제할 필요 없이 지방산을 식별할 수 있는 프로토콜을 제안합니다. 머무름 시간에 대한 정보와 지방산 유도체의 세 가지 유형, 즉 지방산 메틸 에스테르(FAME), 4,4-디메틸 옥사졸린 유도체(DMOX) 및 3-피리딜카르비닐 에스테르(피콜리닐)의 질량 스펙트럼을 결합합니다.

초록

바실러스 종 메틸 분기의 다양한 위치 체인 및 불포화 지방산 (FA들)을 포함 분지 (ISO 또는 안테 이소) 및 이중 결합. FA 조성물의 변화는 환경에 박테리아의 적응에 중요한 역할을한다. 이러한 수정은 안테 이소 FA들에 비해 분지 ISO의 비율의 변화를 수반하고, 특정 위치에 생성 된 이중 결합을 갖는 불포화 포화 FA를 FA에 대하여, 비율이다. 각 FA 프로파일의 정확한 식별은 바실러스 종의 적응 메카니즘을 이해하는 것이 필요하다.

바실러스에서의 FA의 대부분은 상업적으로 사용할 수 없습니다. 지방산 메틸 에스테르 (FAMES), 4,4- 디메틸 옥사 졸린 : 본 명세서에서 제안 된 전략은 세 FA 유도체의 종류의 질량 스펙트럼과 (등가 체인 길이 (ECL)의 연산에 의해) 보유 시간에 대한 정보를 조합하여 FA를 식별 파생 상품 (DMOX), 및3 pyridylcarbinyl 에스터 (picolinyl). 이 방법은 미지의 FA를 정제 할 필요없이 FA를 식별 할 수있다.

표준 상용 혼합물 바실러스 세레 우스로부터 제조 FAME의 크로마토 그래피 프로파일을 비교하는 다른 FA들 중 신원의 FA의 ECL의 계산 및 가설 포화 직쇄의 식별을 허용한다. FAMES의 탄소수가 동일한 수의 선형 포화 FA들에 비해 FA들, 또는 ISO 안테 이소에서, ECL에 일정한 마이너스 시프트를 표시 포화 분지. 불포화의 FA FAMES는 분자 이온의 질량을 감지하고 대응하는 포화 FA들에 비해 ECL의 양의 변화가 발생할 수있다.

FA들의 분기 위치의 FA 불포화 이중 결합의 위치는 각각 picolinyl 및 DMOX 유도체의 전자 이온화 질량 스펙트럼에 의해 확인 될 수있다. 이 접근법은 모든 미지의 포화 지점을 식별ED의 FA 불포화 직쇄 FA들 및 B. 세레 우스 추출물의 불포화 측쇄의 FA.

서론

지방산 메틸 에스테르 (FAME) 기체 크로마토 그래피 (GC)의 지질 특성에 필수적인 메소드이다. 이는 신속 분리 짧은 추출 공정 후의 시료의 각종 지방산 (FA들)을 정량화한다. 메틸 에스테르의 유도체는 크로마토 그래피 컬럼을 향해 매우 휘발성 안정하고 불활성시켜 미행 피크를 회피. 크로마토 그래피 프로파일 중 하나를 게시 또는 기준에 비교하기 때문에 샘플이 잘 알려진 FA를 구성 할 때 그들의 인식은 오히려 간단합니다. 또한, 각종의 FA 정량 검정 표준의 반복 분사 불꽃 이온화 검출 (FID) 한 그들의 거의 일정한 응답 주어진 요구되지 않는다.

FID에 더하여, 질량 분광 (MS) 검출 FAMES를 확인하는 내용의 상보 세트를 제공한다. FAMES가 전자 이온화 (EI)를 이용하여 충전하는 경우에는, 결과적인 스펙트럼은 항상 일을 허용하지FA 미세 구조의 전자 식별. 진단 이온 하나를 감지하기 어렵고 대상 이온 풍부 특성 변화가 질량 스펙트럼 라이브러리 (2)의 사용을 방지하는 시스템에 의존하기 때문에 예를 들어, 위치를 분기 (즉, 측쇄 메틸기)을 예측하는 것은 곤란하다. 또 다른 문제는 EI는 이중 결합의 이동을 야기하기 때문에 이중 결합의 위치를 ​​식별에있다. 따라서, 이중 결합의 위치를 ​​변화와 FA 이성질체들은 질량 스펙트럼에 의해 구별 될 수 없다. 다행히도 다른 도구 FA 식별을 위해 개발되었다. 예를 들어, 존재 및 준하여 이중 결합 또는 분지의 위치는 해당 체인 길이 (ECL) (3)을 계산함으로써 추측 할 수있다.

기타 유도체 화 방법은 이중 결합 또는 측쇄 메틸기의 위치에 따라 서로 다른 질량 스펙트럼 결과. 4,4- 디메틸 옥사 졸린 유도체 (DMOX) 4 EAS 허용불포화 지방산의 이중 결합의 위치의 Y 식별. 에스터 (picolinyl 에스테르) 메틸 유도체의 위치의 명확한 식별이 가능 -3- pyridylcarbinyl는 FA를 5 분지. 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼 구조 특성 1의 uncontestable 방법에 필요한 정제의 복잡한 방법을 사용하지 않고도 크로마토 유지율 (ECL) 질량 스펙트럼 (DMOX 및 picolinyl) 정보는 대부분의 FA의 식별을 가능하게 결합 .

일부 인간과 동물의 병원체를 포함 바실러스의 박테리아는 매우 다양한 틈새 시장에 정착 할 수 있으므로 널리 환경 (6)에 배포됩니다. 바실러스 속 중에서, FA 조성물 (환경 변화의 넓은 범위에 적응 FA 패턴의 변조와 종의 생태적 틈새에 의해 영향을 받는다 예를 들어, 성장 배지, 온도,산도 등) 7-9. 이 때문에 표준 조건에서 성장 동안 바실러스 종의 FA에 걸쳐 패턴의 상대적 균질성에, FA 조성물의 결정은 바실러스 종을 정의하는 데 사용되는 중요한 조건 중 하나이다. 바실러스 속의 독특한 특성은 12-17 탄소 ISO 및 환경 조건에 대한 적응의 주요 결정 인 안테 이소 이성체의 비율로 10-12 분지 쇄의 FA 풍부하다. 바실러스 종은 불포화 지방산의 비율을 변경함으로써, 환경의 변동에 적응. 이러한 바실러스 세레 우스와 같은 일부 종에서는,이 지방산 desaturases 적응 9 다른 역할로 알킬 체인 (13)의 다른 위치에 이중 결합을 만들 수 있습니다. 바실러스 속의 예 정확하게 이중 결합의 위치를 식별하고 FA 분지의 중요성을 나타낸다. 수집ively, 바실러스 FA 패턴의 식별은 몇 가지 유용한 응용 프로그램이 있습니다. 여기서, 우리는 고전 GC-MS 분석의 고유 한 한계를 극복 바실러스 FA 패턴을 식별하기위한 신규 GC-MS 방법을 제안한다.

이 혁신적인 접근 방식은 원시 생물학적 물질에 직접 사용하고, 기존 기술의 조합으로 구성 할 수 있습니다 체류 시간 (ECL) 및 다른 FA들 유도체 (FAME, DMOX 및 picolinyl 에스테르)의 질량 스펙트럼에 대한 정보를 제공합니다.

우리는 다음과 FA 명칭을 사용합니다. a 및 n은 ISO를 나타낸다 난, 안테 이소 메틸 각각 분지 및 직쇄 지방산. 불포화의 FA는 C로 명명 하였다 : C는 탄소 지방산 원자 및 (D)의 수이고, D는 이중 결합의 수이다. Δ의 X는 이중 결합이 카르 복실 말단으로부터 계수, x 번째의 탄소 - 탄소 결합에있는 이중 결합의 위치를 나타낸다.

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프로토콜

1. 세균성 문화

  1. LB 한천 배지의 플레이트의 표면에, LB (루리아 - 베르 타니 배지)에 30 ° C에서 배양 한 균주의 하룻밤 배양 100 μl를 분산시켜 박테리아 (바실러스 세레 우스 균주 ATCC 14579)의 잔디를 준비한다. 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.

2. ECL : 등가 체인 길이

  1. 다음과 같이 ECL을 계산합니다 : figure-protocol-1 와:
    내가 관심있는 용질;
    N, 용질 전에 용출 직쇄 포화 지방산 메틸 에스테르의 탄소수 I;
    N + 1, 용질 후 용출 직쇄 포화 지방산 메틸 에스테르의 탄소수 I;
    RTI, RTN,있는 걸 (N + 1) 상기 FAME 피크의 유지 시간.
    주 : (표준 혼합 주사 B가 직쇄 포화 지방산 메틸 에스테르의 체류 시간을 구하는AME).

3. FAME 준비 및 분석

  1. 한천 플레이트에서 콜로니를 긁어 지질 지방산, 수확물 균체를 얻고 스크류 캡과 PTFE 씰 10 mL 유리 튜브에 박테리아 (109 생세포 등가 신선 중량) 40 mg을 전송하기 위해.
  2. 아래에 설명 에스테르 링크 방법 14, 15을 통해 에스테르 교환 반응을 수행합니다.
    1. 신선한 박테리아 세포에 메탄올 0.2 M KOH의 5 ML을 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. 이 반응은 지질에 에스테르 연결을 끊고 지방산 메틸 에스테르를 생산하고, 알칼리 메탄 구성된다.
    2. 7.0 pH를 낮추기 위해 1 M 아세트산 1 ㎖를 추가한다. 산도 테스트 스트립 pH를 확인합니다.
    3. FAMES를 추출 헥산 3 ㎖를 추가합니다.
    4. 약 200 μL를 얻는 질소의 연속 흐름하에 실온에서 증발시켜 깨끗한 튜브에 상청 (유기상)을 전송하고 집중추출물. 삽입과 GC 바이알에 샘플을 전송합니다.
    5. 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC-MS)로 추출 시스템을 주입한다.

4. GC / MS 조건

  1. 모세관 컬럼 ZB-WAX (직경 0.25 mm, 필름 두께 0.25 ㎛의 길이, 30m)를 구비 한 GC-MS 기기 FAME에 샘플을 주입.
  2. (비분 모드) 주입구 250 ° C까지 온도를 설정합니다. 37cm / sec의 속도로 선형, 캐리어 가스로서 헬륨을 사용한다. 20 ° C / 분의 속도로 190 ℃로 증가시키고, 2 ℃ / 분의 속도로 230 ℃의 최종 온도로 점진적 증가, 1 분 동안 50 ° C의 오븐 온도를 잡아.
  3. 상기 MS를 들어 70 eV로에서 전자 이온화 (EI)에 의하여 질량 스펙트럼을 기록하고, 50 내지 400 원자 질량 단위 (AMU) (2 스캔 / 초) 사이에 총 이온 전류의 인수를 설정한다.
  4. 필요한 경우, 동일한 조건 excep에서 DMOX 및 picolinyl 파생 상품을 주입다음과 같이 온도 프로그램 오븐 T :
    DMOX : 50 ° C (1 분), 20 ° C 210 ° C까지 / 분, 2 ° C / 분 240 ° C (5 분)까지;
    Picolinyl : 6 ° C (1 분), 220 ° C까지 20 ° C / 분, 250 ° C (20 분)까지 2 ° C / 분.

FAME (16) 5. Picolinyl 에스테르 준비

  1. 질소의 흐름 (적어도 10 mg의 건조 물질)와 함께 제 3 항 중 FAME 추출액을 증발 건조 디클로로 메탄 1 ㎖에 용해.
  2. 테트라 히드로 푸란 칼륨 터 t- 부톡 사이드의 1.0 M 용액을 준비합니다.
  3. 명성 추출물 단계 5.2에서 만든 용액 0.2 ml의 3 피리딘 메탄올 0.1 ML을 추가합니다.
  4. 밀폐 된 바이알에서 30 분 동안 40 ° C에서 상기 용액을 가열한다.
  5. 실온으로 냉각시킨 후, (재료 표 참조, 2 ㎖)와 헥산 (4 mL) 중 정제 된 탈 이온수를 추가한다. 와류 혼합 상을 분리 할 수 ​​있도록하고, 유기상을 수집한다.
  6. 박사유기상까지 무수 황산나트륨을 첨가하여 Y 완벽하게 알 수있다. 깨끗한 튜브로 전송합니다. 그런 다음 200 μl를 증발. 삽입과 GC 바이알에 샘플을 전송합니다.

FAME (17) 6. DMOX 준비

  1. 질소 (최소 10 mg의 건조 물질)의 흐름을 제 3의 FAME 추출물을 증발.
  2. 명성 건조 추출물에 2- 아미노 -2- 메틸 -1- 프로판올 250 ㎎을 추가. 질소 용기를 세척하는 스토퍼를 추가하고, 190 ℃에서 하룻밤 가열 블록에 넣습니다.
  3. 실온으로 냉각 한 후, 튜브를 3 ml의 디클로로 메탄을 추가하고, 5 ml의 탈 이온수 (재료 표 참조) 정제 하였다.
  4. 상 분리 흔들어 후, 수성 상을 제거합니다.
  5. 5 ㎖의 물, 유기 상을 세척한다. 상 분리 흔들어 후, 수성 상을 제거합니다.
  6. 유기상까지 무수 황산나트륨을 첨가하여 건조 완벽하고 명확한깨끗한 튜브로 전송할 수 있습니다. 200 μL의 부피에 도달 할 때까지 질소 기류 하에서 증발시켰다. 삽입과 GC 바이알에 샘플을 전송합니다.

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결과

박테리아 세포에서 FA 식별의 전략은 그림 1에 제시되어있다. 각 단계는 상호 보완적인 스펙트럼 정보 또는 크로마토 그래피 보존에 대한 정보를 제공합니다. 1 단계는 표준 용액을 사용하여 예비 FA 식별 구성된다. 단계 2 임시 제품을 식별하기 위해, FAME EI 스펙트럼 및 ECL의 해석을 허용한다. 3 단계는 분지 쇄-의 FA의 정확한 분기 위치를 식별합니다. 마지막으로, 4 단계는 불포화의 FA에 이중 결합의 정확한 위치를 식별합니다.

FAME 및 ECL

BAME 혼합물은 우리가 직쇄 포화 지방산의 시리즈 (N17에서 N12)를 식별하도록 허용 일부 메틸 지방산 (I15, A15, I16, I17)를 분지. 그러나, <...

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토론

표 1에 나타낸 FA를 크로마토 프로필 한천 플레이트 표면에 성장 B. 세레 우스 ATCC 14579에 대응한다. 세균을 동일 온도에서 8 통기 액체 배지에서 성장했을 때 유사한 프로파일을 얻었다. 액체 배지에서 성장 세균의 경우 세균 미생물이 성장 배지를 원심 분리에 의해 회수하고, 성장 조건에 따라 8,19 전술 한 프로토콜에 따라 세척 될 수있다. B. 세레 우스에 의해 생성 된 각종의 FA 식별 저온 7,9의 성장에 필요한 몇 가지 유전자 돌연변이 균주에서 검출 될의 FA 비율에 미세한 변화를 허용.

보통, ECL은 고정 된 온도에서 결정된 조정 된 체류 시간의 로그 값을 사용하여 계산된다 (20) (등온 온도 제어 오븐을 사용하여). 여기서 때문에 P에 비등 레인지의 사용관심 FAME 최적화 된 분리 ermit, 계산 방법은 이...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 자신의 기술 지원 토마스 Mison에게 감사하고, 원고를 수정하기위한 레이첼 한전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GC/MSShimadzuQP2010
모세관 컬럼 ZB WAXPhenomenex7HG-G007-1130 m x 0.25 mm x 0.25  &마이크로; m
메탄올 LichrosolvVWR1.06018.2500
수산화칼AldrichP1767
THFHipersolv Chromanorm28559.320
디클로로 메Hipersolv Chromanorm23373.320
헥산Hipersolv Chromanorm24575.320
3- 피리딘 메탄올AldrichP6-680-7
칼륨 tertiobutoxideAldrich156671
2-amino-2-methyl-1-propanolA-9879
MilliQ AcademicMilliporeZMQS50001
세균산 메틸 에스테르(BAME) 믹스Sigma-Aldrich47080-U Supelco
륨 탄

참고문헌

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  21. van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
  22. Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).

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